Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

Resumen

Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.

Resumen

El pez cebra se ha convertido en un importante modelo animal para estudiar las enfermedades humanas, especialmente el cáncer. Junto con las robustas tecnologías de edición transgénica y genómica aplicadas en el modelado del pez cebra, la facilidad de mantenimiento, la productividad de alto rendimiento y las potentes imágenes en vivo en conjunto hacen del pez cebra un valioso sistema modelo para estudiar la metástasis y las bases celulares y moleculares subyacentes a este proceso in vivo. El primer modelo de metástasis de neuroblastoma (NB) del pez cebra se desarrolló sobreexpresando dos oncogenes, MYCN y LMO1, bajo control del promotor dopamina-beta-hidroxilasa (dβh). La coexpresión de MYCN y LMO1 condujo a la reducción de la latencia y al aumento de la penetrancia de la neuroblastomagénesis, así como a la metástasis a distancia acelerada de las células tumorales. Este nuevo modelo reitera de manera confiable muchas características clave de la NB metastásica humana, incluida la participación de alteraciones genéticas clínicamente relevantes y asociadas a metástasis; desarrollo natural y espontáneo de metástasis in vivo; y sitios conservados de metástasis. Por lo tanto, el modelo de pez cebra posee ventajas únicas para diseccionar el complejo proceso de metástasis tumoral in vivo.

Introducción

El pez cebra ha sido ampliamente utilizado y aplicado a varias áreas de investigación, especialmente en cáncer. Este modelo proporciona muchas ventajas, como su reproducción robusta, mantenimiento rentable y visualización versátil del crecimiento tumoral y la metástasis, todo lo cual hace del pez cebra una herramienta poderosa para estudiar e investigar las bases celulares y moleculares de la tumorigénesis y la metástasis. Las nuevas técnicas para el mapeo del genoma a gran escala, la transgénesis, la sobreexpresión o eliminación de genes, el trasplante de células y las pantallas químicas han aumentado enormemente el poder del modelo del pez ^cebra1. Durante los últimos años, se han desarrollado muchas líneas de pez cebra para estudiar la tumorigénesis y la metástasis de una variedad de cánceres humanos, que incluyen, entre otros, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma y carcinoma hepatocelular2,3,4,5. Además, el primer modelo de pez cebra de neuroblastoma (NB) se generó mediante la sobreexpresión de MYCN, un oncogén, en el sistema nervioso simpático periférico (PSNS) bajo el control del promotor dopamina-beta-hidroxilasa (dβh). Con este modelo, se demostró además que la ALK activada puede sinergizarse con MYCN para acelerar la aparición del tumor y aumentar la penetrancia tumoral in ^vivo6.

El NB se deriva del linaje simpaticoadrenal de las células de la cresta neural, y es un cáncer altamente metastásico en ^niños7. Es responsable del 10% de las muertes pediátricas relacionadas con el ^cáncer8. Ampliamente metástasis en el momento del diagnóstico, el NB puede presentarse clínicamente como tumores originados principalmente a lo largo de la cadena de los ganglios simpáticos y la médula suprarrenal de PSNS9,10. La amplificación de MYCN se asocia comúnmente con malos resultados en pacientes con ^NB11,12. Además, el LMO1 ha sido identificado como un gen crítico de susceptibilidad al NB en casos de alto ^riesgo13,14. Los estudios encontraron que la coexpresión transgénica de MYCN y LMO1 en el PSNS del modelo de pez cebra no solo promueve la aparición más temprana de NB, sino que también induce metástasis generalizadas en los tejidos y órganos que son similares a los sitios comúnmente vistos en pacientes con ^NB13 de alto riesgo. Muy recientemente, también se ha observado otro fenotipo metastásico de NB en un nuevo modelo de pez cebra de NB, en el que tanto MYCN como Lin28B, que codifican una proteína de unión a ARN, se sobreexpresan bajo el control del promotor dβh16.

El abordaje transgénico estable en el pez cebra se utiliza a menudo para estudiar si la sobreexpresión de un gen de interés podría contribuir al desarrollo normal y a la patogénesis de la ^{enfermedad14,15}. Esta técnica se ha utilizado con éxito para demostrar la importancia de múltiples genes y vías para la tumorigénesis NB6,16,17,18,19,20. Este trabajo presentará cómo se creó la línea de peces transgénicos que sobreexpresa tanto MYCN como LMO1 en el PSNS y cómo se demostró que la cooperación de estos dos oncogenes acelera la aparición de tumorigénesis NB y metástasis13. En primer lugar, la línea transgénica que sobreexpresa EGFP-MYCN bajo control del promotor dβh (línea designada MYCN) se desarrolló inyectando la construcción dβh-EGFP-MYCN en una etapa unicelular de embriones AB de tipo salvaje (WT), como se describió anteriormente6,17. Se desarrolló una línea transgénica separada que sobreexpresa LMO1 en la PSNS (línea designada LMO1) mediante la coinyectación de dos construcciones de ADN, dβh-LMO1 y dβh-mCherry, en embriones WT en la etapa de una ^célula13. Se ha demostrado previamente que las construcciones de ADN doble coinyectadas se pueden cointegradar en el genoma de los peces; por lo tanto, LMO1 y mCherry se coexpresan en las células PSNS de los animales transgénicos. Una vez que los embriones F0 inyectados alcanzaron la madurez sexual, se cruzaron con peces WT para la identificación de peces positivos con integración de transgénes. Brevemente, la descendencia F1 se examinó por primera vez mediante microscopía fluorescente para la expresión de mCherry en las células PSNS. La integración de la línea germinal de LMO1 en peces mCherry-positivos se confirmó aún más mediante PCR genómica y secuenciación. Después de la identificación exitosa de cada línea transgénica, la progenie de peces transgénicos heterocigotos MYCN y LMO1 se cruzaron para generar una línea de peces compuestos que expresan tanto MYCN como LMO1 (designado MYCN; Línea LMO1). MYCN portador de tumores; Los peces LMO1 fueron monitoreados por microscopía fluorescente quincenalmente para detectar la evidencia de tumores metastásicos en las regiones distantes al sitio primario, región de la glándula interrenal (IRG, equivalente al pez cebra de la glándula suprarrenal humana)¹³. Confirmar la metástasis de tumores en MYCN; Se aplicaron análisis de peces LMO1, histológicos e inmunohistoquímicos.

Protocolo

Todos los métodos de investigación con pez cebra y cuidado/mantenimiento de animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales de Mayo Clinic.

1. Preparación y microinyección de constructos transgénicos para el desarrollo de línea de pez cebra transgénico LMO1 con sobreexpresión en PSNS

1. Para desarrollar el clon de entrada LMO1-pDONR221 , amplifique la región codificante del LMO1 humano a partir del ADNc obtenido de la línea celular humana mediante PCR.
   1. Realice una reacción de 25 μL como se detalla aquí: 2,5 μL de tampón de reacción Taq estándar 10x, 0,125 μL de ADN polimerasa Taq , 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 2 μL de plantilla de aDNc, 0,5 μL de imprimación ATTB1 LMO1 hacia adelante de 10 μM, 0,5 μL de imprimación ATTB2 de LMO1 inversa de 10 μM y 18,875 μL de agua.
      NOTA: Utilice la imprimación LMO1 ATTB1 hacia adelante: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGGA-3' y cebador inverso LMO1 ATTB2: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
   2. Amplificar usando el siguiente programa: 1 ciclo de 94 °C, 2 min; seguido de 30 ciclos de (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) y 72 °C, 7 min.
2. Clonar el producto LMO1 PCR en el vector donante puerta de enlace pDONR221 mediante reacción de recombinasa ^BP6,13 (fragmento PCR + Vector donante = Clon de entrada).
   1. Para una reacción de 10 μL, mezcle 1 μL de producto purificado de LMO1 PCR (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) vector donante pDONR221 y 6 μL de tampón TE (pH 8.0) con 2 μL de mezcla de enzimas BP, incube durante 1 h a 25 °C y transforme a E. coli competente TOP10 utilizando el protocolo del fabricante.
   2. A continuación, extienda 50-200 μL del vial de transformación en una placa de agar de caldo de Luria (LB) que contenga 50 μg / ml de kanamicina e incube a 37 ° C durante la noche.
   3. Seleccione clones inoculando una sola colonia en 2-5 ml de LB con 50 μg/ml de kanamicina y cultivando durante la noche (16-18 h) a 37 °C.
   4. Use 2 ml de cultivo bacteriano durante la noche para el aislamiento de plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para verificar el plásmido LMO1, envíe una muestra de plásmido para su secuenciación con cebador M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
3. Para generar un clon de entrada dβh-pDONRP4-P1R, obtenga el producto dβh ^PCR6,13 amplificando la región promotora de 5,2 kb utilizando el clon CH211-270H11 BAC como plantilla para preparar una reacción de 20 μL como se describió anteriormente en el paso 1.1.1. Utilice los siguientes parámetros del programa de PCR: 94 °C, 2 min; 10 ciclos de 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 ciclos de 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (con imprimación delantera 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
   CCCCTTTTTAGG-3' e imprimación inversa 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
   TCGTCTTTTGA-3').
   NOTA: Debido a las largas plantillas de ADN en este paso, asegúrese de usar un sistema de PCR apropiado para una amplificación precisa de PCR.
4. Clonar el producto de PCR dβh en el vector donante de puerta de enlace pDONRP4-P1R mediante reacción de recombinasa de ^BP6,13 (fragmento de PCR + Vector donante = Clon de entrada).
   1. Mezclar 1 μL de producto purificado de dβh PCR (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) de vector donante pDONRP4-P1R y 6 μL de tampón TE (pH 8.0) con 2 μL de mezcla de enzimas BP en un total de 10 μL de reacción, incubar durante 1 h a 25 °C.
   2. Transformar a TOP10 competente E. coli según el protocolo del fabricante. Aislar el plásmido como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.4 y verificar el plásmido mediante secuenciación con cebadores M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') y M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
5. Genere la construcción de expresión dβh:LMO1 .
   1. Combinar 1 μL de cada clon de entrada (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 y p3E-polyA11) (20 fmole cada uno), 1 μL (60 ng/μL) de vector de destino modificado con sitios de reconocimiento I-SceI y 4 μL de tampón TE (pH 8.0) que contenga 2 μL de la mezcla de enzimas recombinasas LR. Incubar esta mezcla durante 1 h a 25 °C.
   2. Mientras sigue el protocolo del fabricante, transforme las bacterias en TOP10 E. coli químicamente competentes. Aislar el plásmido como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.4 y verificar el plásmido mediante secuenciación con cebadores DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTGG-3') y LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
6. Genere la construcción de ADN dβh:mCherry con un sistema de puerta de enlace combinando clones de entrada de un promotor dβh de 5,2 kb, pME-mCherry y p3E-polyA en el vector de destino modificado que contiene sitios de reconocimiento I-SceI como se mencionó anteriormente en el paso 1.5.16. Aislar el plásmido como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.4 y verificar el plásmido mediante secuenciación con DBH Forward primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
7. Linealizar la construcción de ADN dβh:LMO1 y la construcción de ADN dβh:mCherry (en una proporción de 3:1, respectivamente) en un total de un volumen de reacción de 15 μL con 1 μL de enzima I-SceI (5 U/μL) y 0,75 μL de tampón (10x), e incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 h o durante la noche. Asegúrese de que la concentración de ADN no exceda los 750 ng en reacción.
8. Al día siguiente y después de la linealización de los constructos, agregue 0,5 μL de enzima I-SceI fresca (5 U/μL) y 0,5 μL de rojo fenol al 0,5% en 5 μL de mezcla total de ADN de la etapa anterior de 1,7. Microinyectar la solución total (de 50-80 pg de ADN linealizado) en embriones AB de tipo salvaje en etapa de una célula (y hasta 500 embriones) utilizando una aguja de micropipeta de vidrio de 1,0 mm de diámetro como se describió ^{anteriormente17}. Guarde la mezcla de ADN restante a -20 °C para futuras inyecciones.

2. Examinar y verificar la línea de peces transgénicos LMO1 para la transmisión de la línea germinal de LMO1 y mCherry

1. A los 3-4 días después de la fertilización (dpf), anestesiar los embriones inyectados con 0,02% de tricaína y examinarlos para detectar la expresión fluorescente de mCherry, que se presenta en cualquier parte del cuerpo del pez debido a la transgénesis en mosaico. Transfiera embriones mCherry-positivos a una placa de Petri con agua fresca de huevo y eleve embriones a la madurez sexual de acuerdo con el libro del pez ^cebra21.
   NOTA: Espere que la proporción de peces positivos varíe dependiendo de la pericia y la experiencia del personal de investigación. Por ejemplo, los aficionados principiantes pueden tener una baja tasa de integración del 10%, en comparación con un experto de ≥50%.
2. Para determinar los peces fundadores con transgenes dβh:LMO1 y dβh:mCherry integrados en las células germinales, cruce pares individuales de peces inyectados mCherry-positivo F0 sexualmente maduros del paso anterior (2.1) con peces WT AB. Examinar la generación F1 para detectar embriones mCherry positivos a 3-4 dpf.
3. Para confirmar que los peces mCherry-positivos portan transgén LMO1 , aísle el gDNA del embrión único F1 mCherry positivo utilizando el tampón de extracción de gDNA, que contiene: 12,5 μL de tampón de lisis 4x (500 μL de 1 M Tris con pH de 8,4, 2,5 ml de cloruro de potasio 1 M y 47 ml de agua purificada), 35 μL de agua purificada, y 2,5 μL de proteinasa K a 10 mg/ml. Incubar la muestra durante 16 h a 55 °C, seguido de 10 min a 98 °C.
4. Utilizar el gDNA extraído (2 μL) como plantilla para el genotipado PCR con cebadores: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' y LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', y el siguiente programa de PCR: 1 ciclo de 94 °C, 10 min; 35 ciclos de (94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s; 68 °C, 30 s); y 68 °C durante 7 min. Confirme el fragmento amplificado de 182 pb mediante secuenciación.
5. Después de la confirmación del genotipo, elevar los embriones F1 mCherry-positivos restantes a la madurez de acuerdo con las pautas estándar del libro del pez ^cebra21. Clip de aleta y genotiparlos a los 2-3 meses de edad utilizando los pasos 2.3-2.4 del protocolo anterior para confirmar aún más la integración del transgén LMO1 en los peces.
   NOTA: El pez F1 positivo para LMO1 será el pez transgénico estable [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (designado como línea LMO1 ).
6. Cría peces transgénicos estables F1 LMO1 con peces WT y repite según sea necesario para propagar esta línea.

3. Cruce de líneas transgénicas LMO1 y MYCN para crear un modelo metastásico

1. Una vez generada la línea de pez cebra transgénico LMO1, se cruza con la línea MYCN6,17 para desarrollar una línea de peces transgénicos heterocigotos que sobreexpresan tanto MYCN como LMO1.
2. A 1 dpf, clasifique la progenie de outcross para la expresión de EGFP con microscopio de fluorescencia estereoscópica, que se presenta como puntos EGFP positivos en la región del cerebro posterior.
   NOTA: Alternativamente, si no todos los embriones se clasifican para MYCN a 1 dpf, eleve los embriones a la edad adulta y el genotipo mediante recorte de aletas y utilizando las pautas establecidas anteriormente de los pasos 2.3-2.4 para el aislamiento de gDNA y el genotipado de PCR, con cebadores: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', y el siguiente programa con polimerasa Taq estándar: 1 ciclo de 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de (94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 68 °C durante 3 min), y 68 °C durante 7 min con un tamaño de amplicón esperado de 145 pb.
3. Después de clasificar el EGFP a 1 dpf, aísle los embriones examinados en placas de Petri separadas y etiquete los platos como: MYCN+ (EGFP-positivo) o MYCN- (EGFP-negativo).
4. A 3-4 dpf, visualice y clasifique embriones de ambos grupos (paso 3.3) para la expresión de LMO1 con un microscopio de fluorescencia estereoscópica. Busque la expresión de proteína fluorescente roja como manchas tanto en el ganglio cervical superior como en las células neuronales dopaminérgicas no PSNS en la región de la cabeza, especialmente en la médula oblonga del cerebro ^{posterior6,13}.
   NOTA: Detección de mCherry / LMO1 antes de que los embriones alcancen los 5 dpf, porque las vejigas natatorias llenas de aire se desarrollan completamente para entonces y harán que los embriones floten, lo que resulta en un enfoque microscópico difícil de las células PSNS durante el proceso de clasificación.
5. Una vez que se complete la clasificación, aísle los peces clasificados en cuatro grupos de diferentes genotipos y etiquete como se muestra a continuación. Criar los peces clasificados en condiciones idénticas según los protocolos estándar del libro del pez ^cebra21.
   1. SOLO MYCN (EGFP positivo),
   2. Solo LMO1 (mCherry-positivo),
   3. MYCN; LMO1 (EGFP y mCherry doble positivo),
   4. WT (EGFP y mCherry doble negativo).

4. Visualización de la carga tumoral en líneas de pez cebra transgénico

1. A las 4 semanas después de la fertilización (wpf), anestesiar los peces clasificados a partir del paso 3.5 con 0.02% de tricaína en una placa de Petri.
2. Visualice los tumores con un microscopio de fluorescencia estereoscópica volteando suavemente los peces con una espátula de metal en ambos lados laterales para ver el tumor. Espere que los tumores se presenten como masas EGFP-, simple mCherry-, o doble EGFP-y-mCherry-positivas que surgen de la región de la glándula interrenal (cerca de la cabeza y el riñón).
   NOTA: Es posible que el inicio inicial del tumor se presente típicamente con una masa positiva de fluorescencia más brillante y más grande en un lado de la glándula interrrenal, por lo que es crucial visualizar ambos lados de los peces para evitar la aparición temprana del tumor.
3. Después de la identificación de los posibles peces portadores de tumores, aísle los peces en un tanque separado con las etiquetas apropiadas, que incluyen la fecha de nacimiento, la fecha en que se examinó el tumor y el genotipo.
4. A los 6 wpf, repita los pasos anteriores 4.1-4.3 para examinar de nuevo a los peces portadores de tumores y a los peces no portadores de tumores para confirmar la presencia de tumores para peces portadores de tumores previamente examinados o identificar nuevos posibles peces portadores de tumores, respectivamente. Busque un tamaño sostenido o aumentado de la masa positiva para fluorescencia en peces con tumores confirmados.
5. Después de identificar los peces portadores de tumores, monitoréelos quincenalmente para detectar evidencia de migración de células tumorales, que se presenta como pequeñas masas tumorales EGFP y / o mCherry positivas lejos del sitio primario de la tumorgénesis (región de la glándula interrrenal). Aísle estos peces en tanques separados según sea necesario y etiquete adecuadamente para indicar una posible metástasis.
6. Para confirmar aún más la metástasis, continúe rastreando estos peces regularmente (cada dos semanas) hasta que las masas tumorales distantes positivas para fluorescencia muestren un tamaño claramente mayor, lo que indica el crecimiento de tumores en los sitios metastásicos.

5. Procesamiento de tejidos y seccionamiento de parafina de peces portadores de tumores

NOTA: Realizar este paso para caracterizar los tumores primarios y/o metastásicos desarrollados espontáneamente en MYCN y MYCN; Peces transgénicos LMO1 .

1. Después de la identificación y verificación de los peces portadores de tumores, sacrifique peces del paso 4.6 en una placa de Petri sumergiendo los peces en 0.02% de tricaína para anestesiar primero y luego aumentando la dosis de tricaína hasta que el pescado ya no esté respirando. Corte el pescado en dos pedazos, con una pieza que contenga la cabeza y una porción de la sección media del cuerpo (incluido el tumor), y otra pieza con el resto de la sección media y la cola del pez.
2. Fije ambas secciones de pescado con paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente en un balancín. Para mejorar la eficiencia de la fijación, reemplace el tampón con PFA fresco al 4% para aumentar la penetrancia en los órganos internos de manera efectiva y rápida. Deje el pescado con tampón de fijación fresco en un balancín a 4 °C durante la noche o durante 48 h.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Dado que los procedimientos de precaución y la eliminación adecuada del reactivo dependen de las regulaciones de su institución, busque las pautas adecuadas antes de usar y eliminar el reactivo.
3. Antes del procesamiento, coloque la(s) muestra(s) en solución descalcificador 100% rápida durante 15-20 min a temperatura ambiente. Asegúrese de usar un recipiente no metálico y de verificar la(s) muestra(s) durante la incubación para evitar la descalcificación excesiva. Si el tejido de la muestra parece muy degradado, coloque la muestra en agua o a 4 °C para ralentizar el proceso de descalcificación.
4. Una vez fijadas y descalcificadas, lave las muestras de pescado con agua corriente del grifo durante 1 h y colóquelas en los casetes del procesador. Si hay más de una muestra, separe cada una en su propio casete.
5. Deshidrate y prepare el tejido para la incrustación de parafina colocando casete(s) con pescado en el procesador de tejidos donde las muestras se sumergen en varias soluciones, respectivamente, de la siguiente manera: 70% de etanol (60 min, 40 °C), 85% de etanol (50 min, 40 °C), 95% de etanol (40 min, 40 °C) dos veces, 100% de etanol (30 min, 40 °C), otra solución fresca de 100% de etanol (50 min, 40 °C) dos veces, xileno (30 min, 40 °C), otra solución fresca de xileno (50 min, 40 °C), otro xileno fresco (50 min, 45 °C), parafina (30 min, 45 °C), parafina (20 min, 58 °C) tres veces.
6. Después de procesar el tejido, descargue el cassette (s) de la máquina procesadora mientras mantiene la organización de cada cassette y se asegura de evitar la mezcla de las muestras de pescado.
7. Elija el molde de tamaño apropiado en función del tamaño del pez, asegurándose de que el molde se ajuste a todo el cassette con la muestra de pescado. Cubra la parte inferior del molde con parafina líquida a 60 °C.
8. Coloque inmediatamente el cassette con el pescado encima del molde (asegurándose de que el pescado se coloque en su lado lateral plano para las secciones sagitales) con parafina líquida, y termine de llenar con parafina en la parte superior del molde para incrustar completamente el pescado.
9. Coloque el molde completo en la placa fría del microtomo de seccionamiento hasta que la parafina se endurezca.
10. Una vez que el bloque de parafina esté duro, lo que se puede juzgar observando visualmente una mayor opacidad y un toque firme al bloque, retire suavemente el bloque del molde. Raspe cuidadosamente cualquier exceso de parafina de los lados del cassette.
11. Seccione el bloque de peces incrustado en parafina a 4 micras en el microtomo y flote las secciones en un baño de agua tibia a 40 ° C que contenga agua destilada.
12. Transfiera cuidadosamente las secciones a portaobjetos cargados positivamente y hornee en el horno a 60 ° C durante 30 minutos antes de la tinción antes de continuar con el paso 6, 7 u 8.

6. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de parafina para revisión de patología

1. Coloque las diapositivas que contengan secciones de parafina del paso 5.12 en un soporte de diapositivas. Dentro de una campana de humos químicos, desparafinar con xileno 3 veces, 5 min cada una. Deseche la solución después de cada uso.
2. Rehidrate las secciones con etanol al 100% durante 3 min, y repita dos veces con etanol fresco al 100%. Reemplace el etanol al 100% con etanol al 95% durante 3 minutos y luego, el etanol al 80% durante 3 minutos.
3. Enjuague las secciones con agua destilada durante 5 min. Mientras las secciones se lavan en agua, asegúrese de eliminar las partículas oxidadas de la hematoxilina filtrando o desnatando la superficie de hematoxilina con una toallita sin pelusa.
4. Seque el exceso de agua del soporte de la diapositiva con toallitas de grado profesional sin pelusa y las diapositivas de manchas en hematoxilina al 50% (dilución 1: 1 con agua destilada) durante 2-5 minutos, dependiendo de la preferencia de tinción deseada y el deterioro del reactivo. Deseche la hematoxilina cuando el color de la solución cambie de ciruela a azul/marrón o cuando el tiempo de tinción se vuelva excesivo. Enjuague los toboganes con agua corriente del grifo durante 20 minutos.
5. Decolorar las secciones en etanol ácido al 1% (3,3 ml de ácido clorhídrico con 50 ml de etanol al 70%) sumergiendo rápidamente las diapositivas varias veces. Las diapositivas se pueden sumergir hasta 3 s, pero cuanto más largas se sumergen las diapositivas, más ligeras se vuelven las secciones.
6. Enjuague los toboganes con agua del grifo dos veces durante 1 minuto cada uno, y una vez con agua desionizada. Como opción, los toboganes se pueden dejar durante la noche en esta etapa, sumergiéndose en agua.
7. Sumergir las secciones en solución de carbonato de litio al 1,36% (47 g de carbonato de litio, 3500 ml de agua) durante 3 s. Asegúrese de no incubar en exceso las secciones, ya que cuanto más largo sea el tiempo en la solución de carbonato de litio, más probable es que el tejido flote.
8. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 5 minutos y borre el exceso de agua del soporte del portaobjetos con toallitas de grado profesional sin pelusa.
9. Contramante las diapositivas en eosina 100% lista para usar durante 15-30 s, e inmediatamente deshidrate con etanol al 95% dos veces durante 5 minutos cada una. Reemplace con etanol 100% dos veces durante 5 minutos cada una, desechando las soluciones después de cada uso.
10. Limpie las secciones en xileno durante 15 minutos y repita dos veces por 3 veces en total. Opcionalmente, los toboganes se pueden dejar en xileno durante la noche a temperatura ambiente para eliminar mejor el exceso de agua.
11. Deje que las diapositivas se sequen al aire en la campana de humos químicos y luego monte un resbalón de cubierta utilizando un medio de montaje para sellar la muestra de tejido.
12. Visualice y obtenga imágenes de las secciones de tejido teñido bajo microscopía. Examine cuidadosamente los tumores en el sitio primario (la región de la glándula interrrenal en el riñón de la cabeza) y las metástasis esporádicas distantes en otros tejidos y órganos de los peces. Envíe diapositivas teñidas para las secciones de tejido para que las revisen los patólogos. Basado en las características patológicas similares del modelo de pez al neuroblastoma humano, espere los tumores que surgieron en MYCN-only o MYCN; Los peces LMO1 serán diagnosticados por primera vez como neuroblastoma por los patólogos.

7. Análisis inmunohistoquímico (IHC) con anticuerpos contra el marcador NB y los transgenes sobreexpresados para confirmar aún más la propagación del tumor y su propiedad de linaje simpaticorrenal

1. Tinción con sistema de tinción totalmente automático
   1. Para comparar mejor el resultado de IHC con el de la tinción de H&E, seleccione diapositivas adyacentes del paso 5.12 para la tinción de IHC.
      NOTA: Aunque un sistema de tinción automatizado permite resultados más rápidos y menos laboriosos, se puede utilizar un protocolo manual para la tinción de IHC en ausencia de tales haciendo referencia a los pasos de la subsección 7.2.
   2. Diluya el anticuerpo primario contra la tirosina hidroxilasa (TH) (1:500), un marcador de neuroblastoma, en función de la concentración deseada y la cantidad total necesaria con el diluyente de anticuerpo primario correspondiente del sistema automatizado.
      NOTA: Las concentraciones óptimas de anticuerpos pueden variar según los anticuerpos y los tejidos.
   3. Dado que el sistema automatizado utiliza la recuperación de antígenos inducida por calor a bordo con solución de recuperación de epítopos durante 20 minutos y el reactivo de detección correspondiente del sistema, asegúrese de que los parámetros de la máquina se establezcan como: Bloqueo de peroxidasa, 5 min; Anticuerpo primario con concentración deseada, 15 min; anticuerpo secundario IgG anti-conejo biotinilado (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; sustrato intenso DAB mixto, 5 min; y hematoxilina, 5 min.
   4. Una vez que se hayan establecido los ajustes, coloque la bandeja de anticuerpos en la máquina. Configure las diapositivas creando un nuevo caso, que etiquetará las diapositivas. La máquina ahora está cargada y lista para funcionar (desparafinado, tinción y contratinción).
   5. Una vez que las diapositivas se desparasitan, tiñen y contratesten con la máquina automatizada, deshidrate las diapositivas en gradientes de etanol del 70%, 95% y 100% durante 5 minutos cada una. Sumergir los portaobjetos de las secciones en etanol 100% fresco de nuevo durante 5 min.
   6. Limpie las secciones en xileno durante 5 minutos, dos veces, o deje los toboganes en xileno durante la noche para eliminar mejor el exceso de agua.
   7. Deje que las correderas se sequen al aire en la campana de humos químicos y luego monte un deslizamiento de cubierta con un medio de montaje. Visualice e imagine las secciones de tejido teñido con microscopía.
   8. Para confirmar firmemente la metástasis en el modelo de pez, compare las diapositivas teñidas con anticuerpos contra el marcador de neuroblastoma del paso 7 con las teñidas por H&E del paso 6.
      NOTA: Espere ver una tinción positiva para el marcador de neuroblastoma, TH, en todas las células tumorales identificadas por tinción de H&E. Tampoco se espera una tinción positiva para la TH en los tejidos adyacentes donde se identificaron los tumores metastásicos en LMO1; Pez MYCN . Asegúrese de seleccionar peces de control WT y myCN que sean de edad similar a MYCN; LMO1 busca para este análisis descartar la posibilidad de que los tumores metastásicos sean tumores primarios multifocales.
2. Tinción manual sin sistema de tinción IHC automatizado
   1. Después de hornear las diapositivas, seleccione las diapositivas adyacentes del paso 5.12 para permitir una mejor comparación entre la tinción de H&E e IHC para desparafinar. Dentro de una campana de humos químicos, desparafina y rehidrate los portaobjetos con xileno utilizando los pasos anteriores 6.1 y 6.2., respectivamente.
   2. Después de la desparafinación y la rehidratación, remoje los portaobjetos en solución endógena de bloqueo de peróxido (1x PBS que contiene 0.1% de azida de sodio y 0.3% de peróxido de hidrógeno) durante 5 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas en 1x PBS fresco durante 3 minutos y repita dos veces para un total de 3 veces.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio es extremadamente tóxica. Asegúrese de practicar procedimientos de precaución y eliminación adecuada del reactivo dependiendo de las regulaciones de su institución.
   3. Recupere el antígeno incubando portaobjetos en solución con proteinasa K (1:500 en 1x PBS) durante 10 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas 3 veces con 1x PBS durante 3 min cada una.
   4. Bloquee los portaobjetos incubando con suero de cabra al 5% en 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente en balancín. Lave los portaobjetos con 1x PBS fresco dos veces durante 3 minutos cada uno.
   5. Agregue 4 gotas de solución de bloqueo de Avidin directamente sobre el portaobjetos e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las diapositivas con 1x PBS fresco dos veces durante 3 min cada una, agregue 4 gotas de solución bloqueadora de biotina e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
   6. Después de bloquear los portaobjetos, incubar en el anticuerpo primario de tirosina hidroxilasa (TH) (1:500) durante 45-60 min a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Tinción con anticuerpos adicionales contra transgenes y otros marcadores relevantes para abordar la fisiología y la actividad del tumor primario y otros sitios metastásicos. Las concentraciones óptimas de anticuerpos pueden variar según los anticuerpos y los tejidos.
   7. Lave las diapositivas con 1x PBS fresco durante 3 minutos, repitiendo dos veces con un total de 3 veces.
   8. Incubar portaobjetos en anticuerpo secundario de anticuerpo secundario IgG anti-conejo biotinilado (1:500) diluido en solución de bloqueo durante 45-60 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado anterior 7.2.7.
   9. Agregue AVIdin conjugada HRP (1:300 en 1x PBS) e incube durante 20 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas 3 veces con 1x PBS fresco durante 5 minutos cada una.
   10. Prepare la solución de diaminobencidina (DAB) de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (2,5 ml de agua destilada, 1 gota de tampón de kit, 1 gota de peróxido de hidrógeno y 2 gotas de DAB del kit) y coloque gotas de DAB directamente sobre los portaobjetos cerca de un microscopio. Después de agregar DAB, observe la reacción de cambio de color en las diapositivas bajo el microscopio. Una vez que se alcanza la intensidad de tinción deseada, detenga la reacción colocando secciones deslizantes en agua destilada fría.
   11. Contramante los portaobjetos con hematoxilina fresca al 50% sumergiendo o sumergiendo muestras durante unos breves segundos y colocándolas de nuevo en agua destilada. Repita como desee, pero normalmente, una vez debería ser suficiente ya que las secciones de tejido son delgadas.
   12. Muestre de tejido deshidratado en diapositivas en gradiente de alcohol como se describió anteriormente en el paso 7.1.5 y continúe a través de los pasos restantes (con el último paso como 7.1.8) para finalizar el análisis de IHC.

8. Tinción roja picrosirius de portaobjetos de parafina para la acumulación de colágeno en tumores como mecanismo de estudio

1. Repita los pasos 6.1-6.3 para desparafinar, hidratar y lavar las secciones de parafina en las diapositivas.
2. Después de secar el exceso de agua del soporte de la diapositiva con toallitas sin pelusa de grado profesional, manche en 50% de hematoxilina durante 10 minutos. Enjuague los toboganes con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
3. Transfiera los portaobjetos a Picrosirius Red e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Lave los portaobjetos en agua acidificada (5 ml de ácido acético glacial en 1 L de agua del grifo o destilada) dos veces, incubando durante 5 minutos en el agitador.
5. Decantar la mayor parte del agua de los toboganes primero antes de agitar físicamente y secar las secciones en los toboganes para eliminar la mayor cantidad de agua posible.
6. Coloque rápidamente las diapositivas en tres cambios de etanol 100% para deshidratar las secciones de parafina.
7. Repita los pasos 6.10 y 6.11 para borrar las diapositivas en xileno y montar la muestra. A continuación, imagen con microscopio compuesto que está equipado con una cámara.
8. Usando ImageJ, cuente las fibras de colágeno picrosirius rojo-positivas en al menos tres campos aleatorios para cada sección. Comparar entre diapositivas de MYCN y MYCN; Secciones de pescado LMO1.

Resultados

Para determinar si LMO1 se sinergiza con MYCN para afectar la patogénesis de NB, se inyectaron construcciones transgénicas que impulsan la expresión de LMO1 (dβh: LMO1 y dβh: mCherry) o MYCN (dβh: EGFP-MYCN) en las células PSNS bajo control del promotor dβh en embriones de pez ^cebra13. Como se ilustra en la Figura 1A, después del desarrollo de líneas transgénicas estables y la validaci?...

Discusión

El pez cebra se ha utilizado comúnmente en la investigación durante las últimas décadas, especialmente en la investigación del cáncer, por razones obvias, como su facilidad de mantenimiento, reproducción robusta y claras ventajas para la imagen in ^vivo1,28. El modelo de pez cebra puede manipularse fácilmente embrionariamente debido a su fertilización y desarrollo externo, lo que complementa bien a los organismos modelo de mamíferos, como ratas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL