Confocal الليزر المسح المجهري القائم على التحليل الكمي من Aspergillus fumigatus كونيديا التوزيع في كامل جبل تطهيرها بصريا الرئة الماوس

Summary

نحن نصف طريقة التحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس فوميديا (3 ميكرومتر في الحجم) في الشعب الهوائية للفئران. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل الجسيمات الدقيقة وتوزيع الجسيمات النانوية في الشعب الهوائية في مختلف نماذج الحالة المرضية.

Abstract

أسبرجريلوس فوميديا هي مسببات الأمراض المحمولة جوا التي يمكن أن تخترق الشعب الهوائية البشرية. الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة دون حساسية يظهرون مقاومة وتسامحا مناعيا ، بينما في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة ، يمكن أن تستعمر كونيديا الشعب الهوائية وتسبب اضطرابات تنفسية غازية شديدة. وتشارك خلايا مختلفة في مقصورات مجرى الهواء المختلفة في الاستجابة المناعية التي تمنع الغزو الفطري. ومع ذلك ، فإن الجوانب الزمنية للتخلص من مسببات الأمراض لا تزال غير مفهومة تماما. يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للأعضاء الكاملة التركيب التي تم تطهيرها بصريا ، وخاصة رئتي الفئران التجريبية ، بالكشف عن مسببات الأمراض المسماة بالفلورسنت في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. في هذه الدراسة، ونحن نصف الإعداد التجريبي لإجراء تحليل كمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM)، تتبعنا موقع كونيديا المسمى الفلورسنت في فروع الشعب الهوائية ومقصورة الحويصلات الهوائية 6 ساعات بعد تطبيق البلعوم الأوروفاري إلى الفئران. وقد استخدم النهج الموصوف هنا في السابق للكشف عن موقع مسببات الأمراض الدقيق وتحديد الخلايا المتفاعلة مع مسببات الأمراض في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لتقدير حركية القضاء على مسببات الأمراض في حالات مرضية مختلفة.

Introduction

على أساس يومي ، يستنشق الناس مسببات الأمراض المحمولة جوا ، بما في ذلك جراثيم الفطريات الانتهازية Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) التي يمكن أن تخترق الجهاز التنفسي¹. الجهاز التنفسي للثدييات هو نظام من الخطوط الجوية من مختلف الأجيال التي تتميز بهياكل مختلفة من جدران مجرى الهواء^2،3،4. تتكون جدران القصبة الهوائية من عدة أنواع من الخلايا من بينها خلايا ciliated التي توفر إزالة المخاطية⁵. في الحويصلات الهوائية ، لا توجد خلايا ciliated ولا يمكن القضاء على مسببات الأمراض الفضائية السنفية المخترقة عن طريق إزالة المخ والخلايا^6. وعلاوة على ذلك، كل جيل مجرى الهواء هو مكانة لتجمعات متعددة من الخلايا المناعية ومجموعات فرعية من هذه المجموعات السكانية هي فريدة من نوعها لبعض مقصورات مجرى الهواء. وهكذا، الضامة الحويصلات الموجودة في مقصورات السنف، في حين تصطف كل من القصبة الهوائية والممرات الهوائية موصل مع الخلايا التغصنية داخل الظهارة^7،8.

الحجم التقريبي لل A. fumigatus كونيديا هو 2-3.5 ميكرومتر⁹. وبما أن قطر الشعب الهوائية الصغيرة في البشر وحتى في الفئران يتجاوز 3.5 ميكرومتر ، فقد اقترح أن كونيديا يمكن أن تخترق الفضاء الحويصلات^2،10،11. في الواقع ، أظهر الفحص النسيجي النمو الفطري في الحويصلات الهوائية للمرضى الذين يعانون من داء الرشاشيات¹². كما تم الكشف عن كونيديا في الحويصلات الهوائية من الفئران المصابة باستخدام التصوير الحي لشرائح الرئة سميكة¹³. في وقت واحد ، تم الكشف عن كونيديا في الجانب الإنارة من ظهارة الشعب الهوائية للفئران¹⁴.

ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير من مسح بصريا كامل جبل الماوس الرئتين يسمح التحليل المورفومتري للخطوط الجوية¹⁵. على وجه الخصوص ، تم إجراء التحليل الكمي لتوزيع العصب الجنبي الحشوي باستخدام عينات الرئة الماوس مسح بصريا¹⁵. في الآونة الأخيرة ، حقق Amich وآخرون¹⁶ في النمو الفطري بعد تطبيق كونيديا داخل الجهاز الداخلي على الفئران المنقوصة المناعية باستخدام مجهر مضان خفيف الورقة لعينات الرئة الماوس مسحت بصريا. الموقع الدقيق للكونيديا يستريح في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى مهم لتحديد مجموعات الخلايا التي يمكن أن توفر ما يكفي من الدفاع المضاد للفطريات في مراحل معينة من الالتهاب. ومع ذلك ، نظرا للحجم الصغير نسبيا ، فإن الجوانب الزمنية للتبخير A. conidia التوزيع في الشعب الهوائية هي سيئة الخصائص.

هنا، نقدم إعداد تجريبي للتحليل الكمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية للفئران المصابة. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM) من الرئتين تطهيرها بصريا من الفئران التي تلقت تطبيق البلعوم من الفلورسنت المسمى A. fumigatus كونيديا، نحصل على صور 3D وإجراء معالجة الصور. باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد لفص الرئة كامل الجبل ، أظهرنا سابقا توزيع A. fumigatus conidia في مجرى الهواء لإجراء الفئران بعد 72 ساعة من تطبيق كونيديا⁸.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق المتعلقة بحيوانات المختبرات الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد شيمياكين وأوفتشينيكوف للكيمياء العضوية الحيوية، الأكاديمية الروسية للعلوم (البروتوكول رقم 226/2017).

1. A. تطبيق فوميداتوس كونيديا

1. للحصول على المسمى الفلورسنت A. fumigatus كونيديا، إصلاح 5 × 10⁸ كونيديا بإضافة 1 مل من 3٪ بارافورمالديهايد إلى بيليه كونيديا. احتضان في أنبوب اختبار 50 مل لمدة 2 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
2. غسل كونيديا مع 20 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS): الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة، وإزالة بلطف supernatant، وإضافة برنامج تلفزيوني جديد في حجم 20 مل. كرر.
3. حل كونيديا في 900 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO₃.
4. حل إستر succinimidyl من صبغة الفلورسنت نانومتر 594 في 100 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي ميثيل وإضافة إلى كونيديا.
5. احتضان كونيديا مع صبغة لمدة 1 ساعة على شاكر في 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل كونيديا مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة.
7. تمييع كونيديا إلى تركيز 1 × 10⁸ كونيديا / مل في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجة مئوية.
8. تخدير الماوس مع بخار isoflurane 0.5-3٪. وضع الماوس على حامل، وإصلاح اللسان مع ملقط على نحو سلس، وعقد nares. تأخذ ماصة قناة واحدة وتطبيق 50 ميكرولتر من تعليق كونيديا إلى البلعوم الماوس. انتظر حتى يتم استنشاق التعليق.

2. إعداد العينة

1. إعداد أنبوب اختبار 50 مل وملئه مع 15 مل من 2٪ بارافورمالديهايد الطازجة. ضع الأدوات الطبية (15 سم ملقط تشريح مسنن ، و 8 سم ملقط ذو رؤوس ناعمة ، ومقص 10 سم مع أطراف حادة) في محلول الإيثانول بنسبة 70٪.
2. قتل الفأرة وفقا لبروتوكول IACUC. ثم ضع الماوس في الموضع الظهري وإصلاح كفوف الماوس بالإبر.
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلع عنق الرحم للقتل الرحيم، فتأكد من سلامة القصبة الهوائية.
   1. علاج الماوس مع الإيثانول 70٪ باستخدام بخاخ.
   2. جعل متوسط قطع طولي في الجلد البطني من الكفوف الخلفية إلى الشقوق والذقن.
   3. فصل الجلد عن الأنسجة تحت الجلد باستخدام ملقط مسنن ومقص مغلق. إصلاح الأطراف العليا من الجلد مع الإبر.
   4. إجراء شق في جدار البطن وفصل الكبد من الحجاب الحاجز. اختر الحجاب الحاجز بعناية بمقص مغلق ثم اقطع الحجاب الحاجز.
   5. جعل قطع وسيطة من الصدر والأنسجة الضامة الرقبة حتى القصبة الهوائية مرئية.
3. تشغيل خيط الحرير تحت القصبة الهوائية وجعل عقدة الجراحية باستخدام ملقطين اثنين.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم خيط تنظيف الأسنان بدلا من الخيط الحريري.
   1. سحب بعناية الخيط وقطع الرئتين من النسيج الضام مع مقص. عقد مقص عمودي على الطاولة.
   2. وضع الرئتين في أنبوب اختبار 50 مل مع 2٪ بارافورمالديهايد. ترك الخيط ينتهي خارج الأنبوب، ووضع غطاء ضيق، وتسليم أنبوب لتغطية الرئتين مع paraformaldehyde. أمسك الرئتين بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. تشريح فصوص الرئة من القلب وبعضها البعض مع مشرط.
   1. وضع فصوص الرئة في لوحة بئر 24، مع كل فص في بئر منفصلة. اغسل فصوص الرئة في 1 مل من درجة الحموضة المالحة (TBS) العازلة من تريس 7.4، 5 مرات لمدة ساعة واحدة لكل منها على شاكر عند 150 دورة في الدقيقة.
   2. استبدال 1 مل من TBS مع 1 مل من العازلة حجب (1٪ تريتون X 100، 5٪ مسحوق الحليب في TBS) وترك العينة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
   3. استبدال العازلة حجب مع 1 مل من streptavidin-488-nm الفلوركروم المصاحبة المخفف 1:30 في TBS. ترك العينة لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة على شاكر (150 دورة في الدقيقة).
5. غسل العينة 5 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما في 1 مل من TBS في درجة حرارة الغرفة على شاكر (150 دورة في الدقيقة). نقل العينة إلى الآبار الجديدة وتغطيتها مع 2٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لما بعد التثبيت.

3. الماوس الرئة الفص الضوئي المقاصة

1. ضع العينة في زجاجة 5 مل مليئة 3 مل من محلول الميثانول والمياه بنسبة 50٪ ووضعها على خلاط العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
2. استبدال 3 مل من الميثانول 50٪ مع 3 مل من الميثانول 100٪ ووضعها على خلاط عينة لمدة 2 ساعة. إعداد خليط 1:2 v/v من الكحول البنزيل والبنزيل بنزوات (BABB) في حجم إجمالي قدره 1 مل.
3. نقل العينة إلى لوحة بئر 24 وتغطي مع 1 مل من خليط BABB لمدة 30 دقيقة على الأقل. لا تترك العينة في BABB لفترة طويلة. BABB يمكن أن تلحق الضرر لوحة بلاستيكية وجعل العينة جامدة جدا.
4. وضع العينة في غرفة تغطية تصوير الخلية القاع. العينة جاهزة للتصوير.

4. الماوس تصوير فص الرئة مع CLSM

1. تشغيل نظام المجهر. افتح برنامج المجهر. تشغيل ضوء الإرسال في علامة التبويب تحديد موقع. حدد الهدف 10x.
   ملاحظة: للحصول على تحليل أكثر تفصيلا، استخدم الهدف 20x، ولكنه يزيد من وقت التجربة وحجم ملف الصورة.
2. وضع الغرفة مع العينة في حامل الشريحة الغطاء. وضع حامل على المرحلة XY على الهدف. مركز العينة باستخدام عناصر التحكم XY من المرحلة على رأس الهدف. استخدام ضوء انتقال والعين للعثور على العينة يدويا Z-الطائرة.
3. قم بتبديل البرنامج إلى علامة التبويب اكتساب. حدد CLSM λ-الوضع. تشغيل الليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر. حدد مرآة 488/561 نانومتر ديكهروي. تغيير النطاق الطيفي للكاشف إلى 490-695 نانومتر. ضبط طاقة الليزر إلى النطاق المناسب (10-50 ميكرو واط). ضبط كسب كاشف بين نطاق 750-900.
   ملاحظة: إعدادات كسب أعلى غير مرغوب فيه بسبب الضوضاء.
4. تضييق الثقب إلى وحدة متجدد الهواء 1 عن طريق النقر على زر 1 الاتحاد الافريقي. تعيين دقة بكسل إلى 512 × 512 بكسل.
5. قم بتشغيل وضع المكدس Z. بدء التصوير الحي. حدد المستوى البؤري الذي تكون فيه الصبغتان مرئيتين.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، ضبط قوة الليزر لتطبيع سطوع اثنين من الأصباغ الفلورية. استخدم وضع المعرض والقناة الواحدة لتجنب القص ولمضاهاة كثافة الفلورسينس بدقة.
6. قم بتوسيع الجزء Z-المكدس ظهرت. استخدام عجلة التركيز والعثور على أدنى مستوى من العينة. استخدم الزر الأول في جزء المكدس Z. تحريك الطائرة المحورية صعودا للعثور على الحد العلوي للعينة وحفظ الموقف باستخدام الزر الأخير. تحقق من تمثيل عمق العينة في جزء المكدس Z.
   ملاحظة: تمثيل عمق العينة ستظهر في جزء المكدس Z بعد الأول و يتم اختيار المواضع الأخيرة.
7. ضع الهدف باستخدام عجلة التركيز بالقرب من أسفل العينة ، من خلال النظر إلى جزء Z-stack. هذا هو ما يقرب من 20 ميكرومتر من الجزء السفلي من العينة.
8. قم بإيقاف تشغيل وضع Z-stack ثم قم بتشغيل وضع فحص التجانب. الحصول على الصورة مع عدد مناسب من البلاط لحجم العينة. 5 × 5 البلاط هي نقطة انطلاق جيدة.
9. ضبط عدد البلاط ووضع XY العينة حتى الرئة كلها يناسب داخل الصورة البلاط. إعادة فحص صحة مواضع المكدس Z مع موضع XY الذي تم الحصول عليه حديثا من مركز العينة.
10. تشغيل كل من Z-المكدس و وضعي مسح Tile. تعيين Z الخطوة (في جزء المكدس Z) إلى 5 ميكرومتر. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 6. تشغيل وظيفة الحفظ التلقائي. تشغيل الخيار حفظ البلاط منفصلة على. اسم الملف. اضغط على الزر بدء التجربة.
11. تحقق من أن التجربة لا تتجاوز الوقت المخصص على المجهر؛ إذا كان الأمر كذلك -- ضبط السرعة.
    ملاحظة: حجم الملف التقريبي هو أكثر من 10 غيغابايت; تأكد من أن هناك مساحة كافية على القرص الصلب.

5. الطيفية اللطاطة وخياطة

1. استخدم البرنامج لمعالجة الصور الأولية. للحصول على الطيات الطيفية، حدد خيار Unmixing. حدد منطقتين المقابلة لstrptavidin / الخطوط الجوية وconidia للحصول على الأطياف من الصورة. انقر فوق بدء التشغيل في إعادة التشغيل.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم الأطياف الموجودة لفلوروشرومس 488 و 594 نانومتر.
2. افتح الملف لمعالجة الصور وحدد علامة التبويب معالجة. في قسم الأساليب، حدد الهندسية والخياطة. في المقطع المعلمة حدد الإخراج الجديد ووضع علامة على الخيار "تجانب الصمامات". استخدم الوضع المرجعي مع القناة المحددة المطابقة لفلورة مجرى الهواء. تطبيق خياطة بالنقر فوق تطبيق.

6. معالجة الصور: تقديم السطح

1. افتح الصورة كعرض تجاوز ثلاثي الأبعاد. إنشاء سطح مجرى الهواء باستخدام خيار Surface للقناة التي تم استخدامها لتصور مجرى الهواء. اختر معلمة التجانس التي 10 ميكرومتر.
   ملاحظة: اختر قيمة العتبة التلقائية أيضا.
2. فحص بصريا السطح. اختر العتبات لتقليل الإشارة الخارجة. إزالة أسطح الجنب والأوعية.
3. إنشاء قناع لسطح مجرى الهواء باستخدام خيارات تحرير وقناع الكل. حدد قناة مجرى الهواء وتعيين Voxels خارج السطح إلى 0.001.
4. حفظ الملف مع قناع مجرى الهواء كسلسلة TIFF إلى المجلد. حفظ الملف مع قناة كونيديا كسلسلة TIFF إلى مجلد منفصل.

7. معالجة الصور: تصحيح القناع

1. افتح الملف باستخدام قناع مجرى الهواء في منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية¹⁷ كصورة 8 بت. جعل الصورة ثنائية بالنقر فوق عملية | | ثنائي جعل ثنائي.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، تصحيح القناع: إزالة الأسطح الزائدة باستخدام تحديد المضلع وحذف علامة التبويب. بدلا من ذلك، استخدم أداة تعبئة الفيضانات.
2. رسم السطوح المفقودة باستخدام عدة مرات توسيع (3D): انقر فوق الإضافات | | العملية تمدد (3D). ملء الثقوب عن طريق النقر على عملية | | ثنائي ملء الثقوب. استخدم التحديد والإنتربول مدير عائد الاستثمار لملء الثقوب المتبقية في القناع يدويا. تطبيق العديد من الخيارات تآكل (3D) (الإضافات | | العملية تآكل (3D)) لإعادة دمج سمك القناع.
   ملاحظة: إنشاء وحدات الماكرو باستخدام الإضافات | خيارات وحدات الماكرو لتوسعات متعددة (3D) وتآكل (3D) يكرر.
   تأكد من أن عدد Erode (3D) يساوي عدد تطبيقات تمدد (3D).
3. حفظ القناع في مجلد جديد كسلسلة TIFF.

8. كونيديا التحليل الكمي

1. افتح التطبيق في منصة البرمجة والحوسبة الرقمية: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
2. اضغط على الزر إضافة ملفات. حدد مجلد قناع مجرى الهواء والمجلد كونيديا.
3. تعيين عتبة مخصصة بين 0 و 1. اضغط على الزر موافق.
4. حفظ جدول الإخراج إلى ملف .xls المخصص.
5. تحليل البيانات باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي.

النتائج

بعد البروتوكول أعلاه، تم الحصول على الصورة ثلاثية الأبعاد التي تظهر الشعب الهوائية وA. fumigatus كونيديا في فص الرئة من الماوس(الشكل 1A). Streptavidin (التي كانت تستخدم لتصور مجرى الهواء) وصفت القصبات الهوائية والشعب الهوائية¹⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور السفن الكبي?...

Discussion

يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد لكامل الأعضاء بالحصول على البيانات دون تشريح العينة ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للتحقيق في الجوانب المكانية للتوزيع التشريحي للمسبب الممرض في الكائن الحي. هناك العديد من التقنيات والتعديلات من الأنسجة البصرية المقاصة التي تساعد على التغلب على ضوء الليزر التشتت و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html