Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Aspergillus fumigatus conidia sind luftgetragene Krankheitserreger, die in die menschlichen Atemwege eindringen können. Immunkompetente Menschen ohne Allergien zeigen Resistenz und immunologische Toleranz, während bei immungeschwächten Patienten Konidien die Atemwege besiedeln und schwere invasive Atemwegserkrankungen verursachen können. Verschiedene Zellen in verschiedenen Atemwegskompartimenten sind an der Immunantwort beteiligt, die das Eindringen von Pilzen verhindert; die räumlich-zeitlichen Aspekte der Erregereliminierung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die dreidimensionale (3D) Bildgebung von optisch gereinigten Ganzkörperorganen, insbesondere der Lunge von Versuchsmäusen, ermöglicht den Nachweis fluoreszierend markierter Krankheitserreger in den Atemwegen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen Versuchsaufbau, um eine quantitative Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen durchzuführen. Mit Hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verfolgten wir die Lage fluoreszierend markierter Konidien in den Bronchialästen und im Alveolarkompartiment 6 Stunden nach oropharyngealer Anwendung bei Mäusen. Der hier beschriebene Ansatz wurde bisher zum Nachweis des genauen Erregerortes und zur Identifizierung der pathogen-interagierenden Zellen in verschiedenen Phasen der Immunantwort verwendet. Der Versuchsaufbau kann verwendet werden, um die Kinetik der Erregerelimination unter verschiedenen pathologischen Zuständen abzuschätzen.

Einleitung

Täglich atmen Menschen luftgetragene Krankheitserreger ein, darunter Sporen opportunistischer Pilze Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), die in die Atemwege eindringen können¹. Die Atemwege von Säugetieren sind ein System von Atemwegen verschiedener Generationen, die durch die unterschiedlichen Strukturen der Atemwegswände^2,3,4gekennzeichnet sind . Tracheobronchialwände bestehen aus mehreren Zelltypen, darunter Flimmerzellen, die die mukokoziläre Clearance^{bereitstellen 5}. In den Alveolen gibt es keine Flimmerzellen und die eindringenden Alveolarraumerreger können durch die mukopoliliare Clearance nicht eliminiert werden⁶. Darüber hinaus ist jede Atemwegsgeneration eine Nische für mehrere Immunzellpopulationen, und Untergruppen dieser Populationen sind für bestimmte Atemwegskompartimente einzigartig. So befinden sich alveoläre Makrophagen in den Alveolarkompartimenten, während sowohl die Luftröhre als auch die leitenden Atemwege mit den intraepithelialen dendritischen Zellen ausgekleidet sind^7,8.

Die ungefähre Größe von A. fumigatus conidia beträgt 2-3,5 μm⁹. Da der Durchmesser kleiner Atemwege beim Menschen und sogar bei Mäusen 3,5 μm überschreitet, wurde vermutet, dass Konidien in den Alveolarraum eindringen können^2,10,11. Tatsächlich zeigte die histologische Untersuchung das Pilzwachstum in den Alveolen der Patienten, die an Aspergillose^{litten 12}. Konidien wurden auch in den Alveolen infizierter Mäuse mit Live-Bildgebung der dicken Lungenscheiben nachgewiesen¹³. Gleichzeitig wurden Konidien in der luminalen Seite des Bronchialepithels von Mäusen^{nachgewiesen 14}.

Die dreidimensionale (3D) Bildgebung der optisch gereinigten Ganzknierungs-Mauslunge ermöglicht eine morphometrische Analyse der Atemwege¹⁵. Insbesondere wurde die quantitative Analyse der viszeralen Pleuranervenverteilung mit optisch gereinigten Mauslungenproben^{durchgeführt 15}. Kürzlich untersuchten Amich et al.¹⁶ das Pilzwachstum nach intranataler Anwendung von Konidien auf die immungeschwächten Mäuse mit einer Lichtblattfluoreszenzmikroskopie von optisch gereinigten Mauslungenproben. Die genaue Lage der Ruhekonidien in den Atemwegen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion ist wichtig, um die Zellpopulationen zu identifizieren, die in bestimmten Entzündungsphasen eine ausreichende antimykotische Abwehr bieten können. Aufgrund der relativ geringen Größe sind jedoch die räumlich-zeitlichen Aspekte der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen schlecht charakterisiert.

Hier stellen wir einen Experimentellen Aufbau zur quantitativen Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen infizierter Mäuse vor. Mit hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) von optisch gereinigten Lungen von Mäusen, die eine oropharyngeale Anwendung der fluoreszierend markierten A. fumigatus conidia erhielten, erhalten wir 3D-Bilder und führen die Bildverarbeitung durch. Mit Hilfe der 3D-Bildgebung des ganz montierten Lungenlappens haben wir zuvor die Verteilung von A. fumigatus conidia in den leitenden Atemwegen von Mäusen 72 Stunden nach Conidienanwendung gezeigt⁸.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden für Versuchstiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Protokollnummer 226/2017) genehmigt.

1. A. fumigatus conidia Anwendung

1. Um fluoreszierend markierte A. fumigatus conidia zu erhalten, fixieren Sie 5 × 10⁸ Konidien, indem Sie dem Conidia-Pellet 1 ml 3% Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 50 mL Reagenzglas für 2 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur.
2. Conidia mit 20 mL Phosphatpuffersalzlösung (PBS) waschen: Zentrifuge bei 1.000 x g für 15 min, den Überstand vorsichtig entfernen und frisches PBS in einem Volumen von 20 ml hinzufügen. Wiederholen.
3. Die Konidien werden in 900 μL 0,1 M NaHCO3_aufgelöst.
4. Den Succinimidylester des 594 nm Fluoreszenzfarbstoffs in 100 μL Dimethylsulfoxid auflösen und zu Konidien geben.
5. Inkubieren Sie die Konidien mit dem Farbstoff für 1 h auf einem Shaker bei 150 U / min bei Raumtemperatur.
6. Die Konidien zweimal mit 20 mL PBS in der Zentrifuge bei 1.000 x g für 15 min waschen.
7. Die Konidien auf eine Konzentration von 1 × 10⁸ Konidien/ml in PBS verdünnen und bei 4 °C lagern.
8. Betäuben Sie die Maus mit 0,5-3% Isoflurandampf. Setzen Sie die Maus auf den Halter, fixieren Sie die Zunge mit einer glatten Zette und halten Sie die Nares. Nehmen Sie eine einkanalige Pipette und tragen Sie 50 μL Konidiensuspension auf den Mausparynx auf. Warten Sie, bis die Suspension eingeatmet ist.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie das 50 ml Reagenzglas vor und füllen Sie es mit 15 ml frischem 2% Paraformaldehyd. Legen Sie die medizinischen Instrumente (15 cm gezahnte Sezierzette, 8 cm feinspitzige Stoßzette und 10 cm Schere mit stumpfen Enden) in 70% ige Ethanollösung.
2. Euthanasiern Sie die Maus gemäß dem IACUC-Protokoll. Dann legen Sie die Maus in die rückenale Position und fixieren Sie die Mauspfoten mit Nadeln.
   HINWEIS: Wenn Sie zervikale Dislokation für die Euthanasie verwenden, stellen Sie die Integrität der Luftröhre sicher.
   1. Behandeln Sie die Maus mit 70% Ethanol mit einem Sprühgerät.
   2. Machen Sie einen mittleren Längsschnitt in der Bauchhaut von den Hinterpfoten bis zu den Vorpfoten und dem Kinn.
   3. Trennen Sie die Haut mit einer Zahnzette und einer geschlossenen Schere vom Unterhautgewebe. Fixieren Sie die oberen Enden der Haut mit Nadeln.
   4. Machen Sie einen Schnitt in der Bauchdecke und trennen Sie die Leber vom Zwerchfell. Wählen Sie vorsichtig die Membran mit einer geschlossenen Schere aus und schneiden Sie dann die Membran ab.
   5. Machen Sie einen medialen Schnitt des Thorax- und Nackensewattgewebes, bis die Luftröhre sichtbar ist.
3. Führen Sie einen Seidenfaden unter die Luftröhre und machen Sie einen chirurgischen Knoten mit zwei Zetten.
   HINWEIS: Alternativ verwenden Sie Zahnseide anstelle von Seidenfaden.
   1. Ziehen Sie vorsichtig den Faden und schneiden Sie die Lunge mit einer Schere vom Bindegewebe ab. Halten Sie die Schere senkrecht zum Tisch.
   2. Legen Sie die Lunge in das 50 ml Reagenzglas mit 2% Paraformaldehyd. Lassen Sie die Fadenenden außerhalb des Rohrs, legen Sie die Abdeckung fest und drehen Sie das Rohr um, um die Lunge mit Paraformaldehyd zu bedecken. Halten Sie die Lunge über Nacht bei 4 °C.
4. Sezieren Sie die Lungenlappen vom Herzen und untereinander mit einem Skalpell.
   1. Legen Sie die Lungenlappen in eine 24-Well-Platte, wobei jeder Lappen in einen separaten Brunnen passt. Waschen Sie die Lungenlappen in 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) pH 7,4, 5 mal für jeweils 1 h auf einem Shaker bei 150 U / min.
   2. Ersetzen Sie 1 ml TBS durch 1 ml des Sperrpuffers (1% Triton X 100, 5% Milchpulver in TBS) und lassen Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Shaker stehen.
   3. Ersetzen Sie den Sperrpuffer durch 1 ml Streptavidin-488-nm-Fluorchrom-Konjugat, verdünnt 1:30 in TBS. Lassen Sie die Probe mindestens 72 h bei Raumtemperatur auf einem Shaker (150 U /min).
5. Waschen Sie die Probe 5 mal für jeweils 1 h in 1 ml TBS bei Raumtemperatur auf einem Shaker (150 U/min). Die Probe in die neuen Vertiefungen überführen und über Nacht bei 4 °C zur Nachfixierung mit 2% Paraformaldehyd bedecken.

3. Optische Reinigung des Lungenlappens der Maus

1. Legen Sie die Probe in die 5 mL Glasflasche, die mit 3 mL 50% Methanol-Wasser-Lösung gefüllt ist, und legen Sie sie bei Raumtemperatur für 1 h auf den Probenmischer.
2. Ersetzen Sie 3 mL 50% Methanol durch 3 mL 100% Methanol und legen Sie es für 2 h auf den Probenmischer. Bereiten Sie eine 1:2 v/v Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) in einem Gesamtvolumen von 1 ml vor.
3. Die Probe auf eine 24-Well-Platte geben und mit 1 ml BABB-Mischung für mindestens 30 min abdecken. Lassen Sie die Probe nicht lange in BABB; BABB kann die Kunststoffplatte beschädigen und die Probe zu steif machen.
4. Legen Sie die Probe in die Zellbildgebungsabdeckungglasbodenkammer. Die Probe ist bereit für die Bildgebung.

4. Maus-Lungenlappen-Bildgebung mit CLSM

1. Schalten Sie das Mikroskopsystem ein. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Schalten Sie die Durchlichtleuchte auf der Registerkarte Suchen ein. Wähle das 10-fache Ziel aus.
   HINWEIS: Für eine detailliertere Analyse verwenden Sie das 20-fache Objektiv, aber es erhöht die Zeit des Experiments und die Größe der Bilddatei.
2. Legen Sie die Kammer mit der Probe in den Deckel-Diahalter. Setzen Sie den Halter auf die XY-Stufe über das Objektiv. Zentrieren Sie die Probe mit den XY-Steuerelementen der Bühne auf dem Objektiv. Verwenden Sie das Transmissionslicht und das Okular, um die Z-Ebene manuell zu finden.
3. Wechseln Sie die Software auf die Registerkarte Erfassung. Wählen Sie CLSM λ-mode. Schalten Sie die 488-nm- und 561-nm-Laser ein. Wählen Sie den dichroitischen Spiegel 488/561 nm aus. Ändern Sie den Spektralbereich des Detektors auf 490-695 nm. Stellen Sie die Laserleistung auf den entsprechenden Bereich (10-50 μW) ein. Stellen Sie die Detektorverstärkung zwischen 750-900 ein.
   HINWEIS: Höhere Verstärkungseinstellungen sind aufgrund von Rauschen unerwünscht.
4. Schmalen Sie das Loch auf 1 Airy-Einheit, indem Sie auf die Taste 1 AU klicken. Stellen Sie die Pixelauflösung auf 512 × 512 Pixel ein.
5. Schalten Sie den Z-Stack-Modus ein. Starten Sie Live Imaging. Wählen Sie die Fokusebene aus, in der beide Farbstoffe sichtbar sind.
   HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf die Laserleistung an, um die Helligkeit der beiden fluoreszierenden Farbstoffe zu normalisieren. Verwenden Sie den Galerie- und Einkanalmodus, um Clipping zu vermeiden und die Fluoreszenzintensität genau anzupassen.
6. Erweitern Sie den angezeigten Z-Stack-Bereich. Verwenden Sie das Fokussierungsrad und suchen Sie die unterste Ebene der Probe. Verwenden Sie die Schaltfläche Erste im Bereich Z-Stapel. Bewegen Sie die Fokusebene nach oben, um die obere Berandung der Probe zu finden, und speichern Sie die Position mithilfe der Schaltfläche Letzte. Überprüfen Sie die Darstellung der Probentiefe im Bereich Z-Stack.
   HINWEIS: Eine Darstellung der Probentiefe wird im Z-Stapelfenster angezeigt, nachdem die erste und die letzte Position ausgewählt wurden.
7. Positionieren Sie das Objektiv mit dem Fokussierenrad in der Nähe der Unterseite der Probe, indem Sie auf die Z-Stapelscheibe schauen. Dies ist ungefähr 20 μm vom Boden der Probe entfernt.
8. Schalten Sie den Z-Stack-Modus aus und aktivieren Sie den Kachelscan-Modus. Erfassen Sie das Bild mit einer angemessenen Anzahl von Kacheln für die Größe der Probe. 5 × 5 Kacheln sind ein guter Ausgangspunkt.
9. Passen Sie die Anzahl der Kacheln und die XY-Position der Probe an, bis die gesamte Lunge in das gekachelten Bild passt. Überprüfen Sie erneut die Richtigkeit der Z-Stapelpositionen mit der neu erhaltenen XY-Position der Mitte der Probe.
10. Aktivieren Sie sowohl den Z-Stack- als auch den Tile-Scan-Modus. Stellen Sie den Z-Schritt (im Z-Stack-Bereich) auf 5 μm ein. Legen Sie die Scangeschwindigkeit auf 6 fest. Schalten Sie die Autosave-Funktion ein. Aktivieren Sie die Option Separate Kacheln speichern. Benennen Sie die Datei. Drücken Sie die Taste Experiment starten.
11. Stellen Sie sicher, dass der Versuch die am Mikroskop zugewiesene Zeit nicht überschreitet. Wenn ja, passen Sie die Geschwindigkeit an.
    HINWEIS: Die ungefähre Dateigröße beträgt mehr als 10 GB; Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherplatz auf der Festplatte vorhanden ist.

5. Spektrales Entmischen und Nähen

1. Nutzen Sie die Software für die erste Bildverarbeitung. Wählen Sie für die spektrale Entmischung die Option Mischen aufheben aus. Wählen Sie zwei Bereiche aus, die dem Streptavidin/den Atemwegen und den Konidien entsprechen, um die Spektren aus dem Bild zu erfassen. Klicken Sie auf Entmischung starten.
   HINWEIS: Alternativ können Sie die vorhandenen Spektren für 488- und 594-nm-Fluorochrome verwenden.
2. Öffnen Sie die Datei für die Bildverarbeitung und wählen Sie die Registerkarte Verarbeitung. Wählen Sie im Abschnitt Methoden die Option Geometrisch und Stitching aus. Wählen Sie im Abschnitt Parameter die Option Neue Ausgabe aus und markieren Sie die Option Kacheln verschmelzen. Verwenden Sie den Referenzmodus mit dem ausgewählten Kanal, der der Atemwegsfluoreszenz entspricht. Wenden Sie die Stitching an, indem Sie auf Übernehmenklicken.

6. Bildverarbeitung: Oberflächenrendering

1. Öffnen Sie das Bild als Surpass 3D-Ansicht. Erstellen Sie eine Atemwegsoberfläche mit der Option Fläche für den Kanal, der für die Atemwegsvisualisierung verwendet wurde. Wählen Sie den Glättungsparameter von 10 μm.
   HINWEIS: Wählen Sie auch den automatischen Schwellenwert aus.
2. Untersuchen Sie die Oberfläche visuell. Wählen Sie die Schwellenwerte aus, um das ausgehende Signal zu reduzieren. Entfernen Sie die Oberflächen von Pleura und Gefäßen.
3. Erstellen Sie eine Maske für die Atemwegsoberfläche mit den Optionen Bearbeiten und Alle maskieren. Wählen Sie den Atemwegskanal und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf 0,001.
4. Speichern Sie die Datei mit der Atemwegsmaske als TIFF-Serie im Ordner. Speichern Sie die Datei mit dem conidia-Kanal als TIFF-Serie im separaten Ordner.

7. Bildbearbeitung: Maskenkorrektur

1. Öffnen Sie die Datei mit der Atemwegsmaske in einer Open-Source-Plattform für die biologische Bildanalyse¹⁷ als 8-Bit-Bild. Erstellen Sie das Bild binär, indem Sie auf | Binäre | Machen Sie Binär.
   HINWEIS: Korrigieren Sie bei Bedarf die Maske: Entfernen Sie die übermäßigen Flächen mithilfe der Polygonauswahl und der Registerkarte Löschen. Alternativ können Sie das Flood Fill Toolverwenden.
2. Zeichnen Sie die fehlenden Flächen mehrmals mit Dilate (3D):Klicken Sie auf Plugins | Prozess | Erweitern (3D). Füllen Sie die Löcher, indem Sie auf | Binäre | Löcher füllen. Verwenden Sie selektions- und ROI-Manager-Interpolation, um die Restlöcher in der Maske manuell zu füllen. Wenden Sie mehrere Erode-Optionen (3D) an (Plugins | Prozess | Erode (3D)), um die Maskendicke neu zu berechnen.
   HINWEIS: Erstellen von Makros mithilfe von Plugins | Makrooptionen für mehrere Dilate (3D) und Erode (3D) Wiederholungen.
   Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Erode (3D) der Anzahl der Dilate (3D)-Anwendungen entspricht.
3. Speichern Sie die Maske in einem neuen Ordner als TIFF-Serie.

8. Conidia quantitative Analyse

1. Öffnen Sie die App in der Programmier- und numerischen Rechenplattform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Dateien hinzufügen. Wählen Sie den Luftwegsmaskenordner und den Conidia-Ordner aus.
3. Legen Sie einen benutzerdefinierten Schwellenwert zwischen 0 und 1 fest. Drücken Sie die Taste OK.
4. Speichern Sie die Ausgabetabelle in der benutzerdefinierten .xls Datei.
5. Analysieren Sie die Daten mit Software für statistische Analysen.

Ergebnisse

Nach dem obigen Protokoll wurde das 3D-Bild erhalten, das die Atemwege und A. fumigatus conidia im Lungenlappen einer Maus zeigt (Abbildung 1A). Streptavidin (das zur Visualisierung der Atemwege verwendet wurde) markierte Bronchien und Bronchiolen¹⁵. Zusätzlich werden die großen Gefäße, die durch ihre Morphologie leicht von den Atemwegen zu unterscheiden sind, und die Pleura im Atemwegskanal visualisiert (Abbildung 1A...

Diskussion

Die 3D-Bildgebung von Ganzen Organen ermöglicht die Gewinnung der Daten ohne Sezierung der Probe, was für die Untersuchung der räumlichen Aspekte der anatomischen Verteilung des Erregers im Organismus von großer Bedeutung ist. Es gibt verschiedene Techniken und Modifikationen der gewebeoptischen Reinigung, die helfen, die Laserlichtstreuung zu überwinden und die Bildgebung ganzer Organe zu ermöglichen^15,16,18,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html