In This Article

Summary

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia to patogeny przenoszone drogą powietrzną, które mogą przenikać do ludzkich dróg oddechowych. Osoby immunokompetentne bez alergii wykazują odporność i tolerancję immunologiczną, natomiast u pacjentów z obniżoną odpornością konidia mogą kolonizować drogi oddechowe i powodować ciężkie inwazyjne choroby układu oddechowego. Różne komórki w różnych przedziałach dróg oddechowych biorą udział w odpowiedzi immunologicznej, która zapobiega inwazji grzybów; Jednak czasoprzestrzenne aspekty eliminacji patogenów nadal nie są w pełni zrozumiałe. Trójwymiarowe (3D) obrazowanie optycznie oczyszczonych całych narządów, w szczególności płuc myszy eksperymentalnych, umożliwia wykrywanie fluorescencyjnie znakowanych patogenów w drogach oddechowych w różnych punktach czasowych po zakażeniu. W niniejszym badaniu opisano układ eksperymentalny do przeprowadzenia analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów A. fumigatus w drogach oddechowych. Za pomocą fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) prześledziliśmy lokalizację fluorescencyjnie znakowanych konidiów w gałęziach oskrzeli i przedziale pęcherzykowym 6 godzin po zastosowaniu jamy ustnej i gardła myszom. Opisane tutaj podejście było wcześniej stosowane do wykrywania dokładnej lokalizacji patogenu i identyfikacji komórek oddziałujących z patogenem w różnych fazach odpowiedzi immunologicznej. Układ doświadczalny można wykorzystać do oszacowania kinetyki eliminacji patogenu w różnych warunkach patologicznych.

Introduction

Codziennie ludzie wdychają patogeny unoszące się w powietrzu, w tym zarodniki oportunistycznych grzybów Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), które mogą przenikać do dróg oddechowych1. Drogi oddechowe ssaków to system dróg oddechowych różnych pokoleń, które charakteryzują się odmienną budową ścian dróg oddechowych2,3,4. Ściany tchawicy i oskrzeli składają się z kilku typów komórek, wśród których znajdują się komórki rzęskowe, które zapewniają klirens śluzowo-rzęskowy5. W pęcherzykach płucnych nie ma komórek rzęskowych, a patogeny penetrujące przestrzeń pęcherzykową nie mogą zostać wyeliminowane przez klirens śluzowo-rzęskowy6. Co więcej, każde pokolenie dróg oddechowych jest niszą dla wielu populacji komórek odpornościowych, a podzbiory tych populacji są unikalne dla niektórych przedziałów dróg oddechowych. Tak więc makrofagi pęcherzykowe znajdują się w przedziałach pęcherzykowych, podczas gdy zarówno tchawica, jak i przewodzące drogi oddechowe są wyłożone śródnabłonkowymi komórkami dendrytycznymi7,8.

Przybliżony rozmiar konidiów A. fumigatus to 2-3,5 μm9. Ponieważ średnica małych dróg oddechowych u ludzi, a nawet u myszy, przekracza 3,5 μm, zasugerowano, że konidia mogą przenikać przez przestrzeń pęcherzykową2,10,11. W rzeczywistości badanie histologiczne wykazało wzrost grzybów w pęcherzykach płucnych u pacjentów cierpiących na aspergilozę12. Konidia wykryto również w pęcherzykach płucnych zakażonych myszy za pomocą obrazowania na żywo grubych plastrów płuc13. Jednocześnie wykryto konidia po stronie światła nabłonka oskrzeli u myszy14.

Trójwymiarowe (3D) obrazowanie optycznie oczyszczonych płuc myszy pozwala na analizę morfometryczną dróg oddechowych15. W szczególności przeprowadzono analizę ilościową rozmieszczenia nerwów opłucnowych trzewnych przy użyciu optycznie oczyszczonych próbek płuc myszy15. Niedawno, Amich i wsp.16 badali wzrost grzybów po donosowym podaniu konidiów myszom z obniżoną odpornością, używając mikroskopii fluorescencyjnej z lekkim arkuszem optycznie oczyszczonych próbek płuc myszy. Dokładna lokalizacja spoczynkowych konidiów w drogach oddechowych w różnych punktach czasowych po infekcji jest ważna dla identyfikacji populacji komórek, które mogą zapewnić wystarczającą obronę przeciwgrzybiczą w określonych fazach zapalenia. Jednak ze względu na stosunkowo niewielkie rozmiary, czasoprzestrzenne aspekty rozmieszczenia konidiów A. fumigatus w drogach oddechowych są słabo scharakteryzowane.

Tutaj prezentujemy eksperymentalny zestaw do analizy ilościowej rozmieszczenia A. fumigatus conidia w drogach oddechowych zakażonych myszy. Za pomocą fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) optycznie oczyszczonych płuc myszy, którym podano do jamy ustnej i gardła znakowaną fluorescencyjnie A. fumigatus conidia, uzyskujemy obrazy 3D i przeprowadzamy przetwarzanie obrazu. Korzystając z obrazowania 3D całego płata płuca, wcześniej pokazaliśmy rozmieszczenie konidiów A. fumigatus w przewodzących drogach oddechowych myszy 72 godziny po aplikacji konidiów8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Instytucie Chemii Bioorganicznej im. Szemiakina i Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk (numer protokołu 226/2017).

1. Aplikacja konidiaów A. fumigatus

  1. Aby otrzymać znakowane fluorescencyjnie konidia A. fumigatus, utrwal 5 × 108 konidiów, dodając 1 ml 3% paraformaldehydu do granulki konidiów. Inkubować w probówce o pojemności 50 ml przez 2 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć konidia 20 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS): odwirować przy 1 000 x g przez 15 minut, delikatnie usunąć supernatant i dodać świeży PBS w objętości 20 ml. Powtórzyć.
  3. Rozpuścić konidia w 900 μl 0,1 M NaHCO3.
  4. Rozpuścić ester sukcynimidylowy barwnika fluorescencyjnego o długości fali 594 nm w 100 μl dimetylosulfotlenku i dodać do konidiów.
  5. Inkubować konidia z barwnikiem przez 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć konidia dwukrotnie 20 ml PBS w wirówce przy 1 000 x g przez 15 minut.
  7. Rozcieńczyć konidia do stężenia 1 × 10-8 konidii/ml w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Znieczulij mysz 0,5-3% parą izofluranu. Połóż mysz na uchwycie, przymocuj język gładkimi kleszczami i przytrzymaj nozdrza. Weź pipetę jednokanałową i nałóż 50 μl zawiesiny konidiów na gardło myszy. Poczekać, aż zawiesina zostanie wdychana.

2. Przygotowanie próbki

  1. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml i napełnij ją 15 ml świeżego 2% paraformaldehydu. Umieść narzędzia medyczne (15 cm kleszczy preparacyjne zębate, 8 cm kleszcze z cienką końcówką i 10 cm nożyczki z końcami) w 70% roztworze etanolu.
  2. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z protokołem IACUC. Następnie umieść mysz w pozycji grzbietowej i przymocuj łapki myszy za pomocą igieł.
    UWAGA: W przypadku stosowania zwichnięcia szyjki macicy do eutanazji należy upewnić się, że tchawica jest integralna.
    1. Potraktuj mysz 70% etanolem za pomocą opryskiwacza.
    2. Wykonaj środkowe podłużne cięcie w brzusznej skórze od tylnych łap do przednich łap i podbródka.
    3. Oddziel skórę od tkanki podskórnej za pomocą ząbkowanych kleszczy i zamkniętych nożyczek. Przymocuj górne końce skóry za pomocą igieł.
    4. Wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i oddziel wątrobę od przepony. Ostrożnie podnieś membranę zamkniętymi nożyczkami, a następnie przetnij membranę.
    5. Wykonaj przyśrodkowe cięcie tkanki łącznej klatki piersiowej i szyi, aż tchawica będzie widoczna.
  3. Przeprowadź jedwabną nić pod tchawicą i wykonaj węzeł chirurgiczny za pomocą dwóch kleszczy.
    UWAGA: Alternatywnie użyj nici dentystycznej zamiast nici jedwabnej.
    1. Ostrożnie pociągnij nić i odetnij nożyczkami płuca od tkanki łącznej. Trzymaj nożyczki prostopadle do stołu.
    2. Umieść płuca w probówce o pojemności 50 ml z 2% paraformaldehydem. Pozostaw końce nici na zewnątrz rurki, szczelnie załóż osłonę i odwróć rurkę, aby pokryć płuca paraformaldehydem. Utrzymać płuca przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Wypreparuj płaty płuc od serca i siebie nawzajem za pomocą skalpela.
    1. Umieść płaty płuc w 24-dołkowej płytce, tak aby każdy płat znajdował się w osobnym dołku. Przemyć płaty płuc w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) o pH 7,4, 5 razy po 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min.
    2. Zastąp 1 ml TBS 1 ml buforu blokującego (1% Triton X 100, 5% mleka w proszku w TBS) i pozostaw próbkę na noc w temperaturze pokojowej na shakerze.
    3. Zastąp bufor blokujący 1 ml koniugatu fluorchromu streptawidyny-488 nm rozcieńczonego w stosunku 1:30 w TBS. Pozostaw próbkę na co najmniej 72 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150 obr./min).
  5. Umyć próbkę 5 razy przez 1 godzinę w 1 ml TBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150 obr./min). Przenieść próbkę do nowych studzienek i przykryć ją 2% paraformaldehydem przez noc w temperaturze 4 °C w celu późniejszego utrwalenia.

3. Optyczne oczyszczanie płata płuc myszy

  1. Umieścić próbkę w szklanej butelce o pojemności 5 ml wypełnionej 3 ml 50% roztworu metanolu i wody i umieścić ją w mieszalniku próbek w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  2. Zastąp 3 ml 50% metanolu 3 ml 100% metanolu i umieść w mieszalniku próbek na 2 godziny. Przygotuj mieszaninę alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BABB) w proporcji 1:2 v/v w łącznej objętości 1 ml.
  3. Przenieść próbkę do płytki 24-dołkowej i zalać 1 ml mieszaniny BABB na co najmniej 30 minut. Nie zostawiaj próbki w BABB przez długi czas; BABB może uszkodzić plastikową płytkę i sprawić, że próbka będzie zbyt sztywna.
  4. Umieścić próbkę w komorze obrazowania komórkowego z dnem szklanym pokrywowym. Próbka jest gotowa do obrazowania.

4. Obrazowanie płata płuc myszy za pomocą CLSM

  1. Włącz system mikroskopu. Otwórz oprogramowanie mikroskopu. Włącz lampkę transmisji na karcie Lokalizacja. Wybierz obiektyw 10x.
    UWAGA: Aby uzyskać bardziej szczegółową analizę, użyj obiektywu 20x, ale wydłuża to czas eksperymentu i rozmiar pliku obrazu.
  2. Umieść komorę z próbką w uchwycie szkiełka pokrywy. Umieść uchwyt na stoliku XY nad obiektywem. Wyśrodkuj próbkę za pomocą elementów sterujących XY stolika na górze obiektywu. Użyj światła transmisyjnego i okularu, aby ręcznie znaleźć płaszczyznę Z próbki.
  3. Przełącz oprogramowanie na zakładkę Akwizycja. Wybierz tryb λ CLSM. Włącz lasery 488 nm i 561 nm. Wybierz lustro dichroiczne 488/561 nm. Zmień zakres widmowy detektora na 490-695 nm. Dostosuj moc lasera do odpowiedniego zakresu (10-50 μW). Dostosuj wzmocnienie detektora w zakresie 750-900.
    UWAGA: Wyższe ustawienia wzmocnienia są niepożądane ze względu na szumy.
  4. Zawęź otwór do 1 jednostki Airy, klikając przycisk 1 AU. Ustaw rozdzielczość pikseli na 512 × 512 pikseli.
  5. Włącz tryb Z-stack. Rozpocznij obrazowanie na żywo. Wybierz płaszczyznę ogniskowej, w której widoczne są oba barwniki.
    UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj moc lasera, aby znormalizować jasność dwóch barwników fluorescencyjnych. Użyj trybu Galeria i Jednokanałowy, aby uniknąć przycinania i precyzyjnie dopasować intensywność fluorescencji.
  6. Rozwiń wyświetlony panel stosu Z. Użyj pokrętła ostrości i znajdź najniższą płaszczyznę próbki. Użyj pierwszego przycisku w okienku Z-stack. Przesuń płaszczyznę ogniskowej w górę, aby znaleźć górną granicę próbki i zapisać pozycję za pomocą przycisku Ostatni. Sprawdź reprezentację głębokości próbki w panelu Z-stack.
    UWAGA: Reprezentacja głębokości próbki pojawi się w panelu Z-stack po wybraniu pierwszej i ostatniej pozycji.
  7. Ustaw obiektyw za pomocą pokrętła ostrości w pobliżu dolnej części preparatu, patrząc na panel Z-stack. Jest to około 20 μm od dna próbki.
  8. Wyłącz tryb Z-stack i włącz tryb Tile Scan (Skanowanie kafelków). Zdobądź obraz z odpowiednią liczbą płytek do wielkości próbki. 5 × 5 płytek to dobry punkt wyjścia.
  9. Dostosuj liczbę kafelków i pozycję XY próbki, aż całe płuco zmieści się w obrazie wyłożonym kafelkami. Ponownie sprawdź poprawność pozycji stosu Z z nowo uzyskaną pozycją XY środka próbki.
  10. Włącz zarówno tryby Z-stack, jak i Tile Scan. Ustaw krok Z (w panelu stosu Z) na 5 μm. Ustaw szybkość skanowania na 6. Włącz funkcję automatycznego zapisywania. Włącz opcję Zapisywanie oddzielnych kafelków. Nazwij plik. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment.
  11. Sprawdź, czy eksperyment nie przekracza czasu wyznaczonego na mikroskopie; jeśli tak - dostosuj prędkość.
    UWAGA: Przybliżony rozmiar pliku to ponad 10 GB; Upewnij się, że na dysku twardym jest wystarczająca ilość miejsca.

5. Widmowe mieszanie i zszywanie

  1. Użyj oprogramowania do wstępnego przetwarzania obrazu. Aby uzyskać rozmieszanie spektralne, wybierz opcję Unmixing. Wybierz dwa regiony odpowiadające streptawidynie/drogom oddechowym i konidiom, aby uzyskać widma z obrazu. Kliknij Rozpocznij rozmieszanie.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć istniejących widm dla fluorochromów 488 i 594 nm.
  2. Otwórz plik do przetwarzania obrazu i wybierz kartę Przetwarzanie. W sekcji Metody wybierz opcję Geometryczne i Zszywanie. W sekcji Parametr wybierz Nowe wyjście i zaznacz opcję Kafelki bezpiecznika. Użyj trybu referencyjnego z wybranym kanałem odpowiadającym fluorescencji dróg oddechowych. Zastosuj zszywanie, klikając przycisk Zastosuj.

6. Przetwarzanie obrazu: renderowanie powierzchni

  1. Otwórz obraz jako widok Surpass 3D. Utwórz powierzchnię dróg oddechowych, korzystając z opcji Powierzchnia dla kanału, który został użyty do wizualizacji dróg oddechowych. Wybierz parametr Wygładzanie 10 μm.
    UWAGA: Wybierz również automatyczną wartość progową.
  2. Sprawdź wzrokowo powierzchnię. Wybierz progi, aby zredukować sygnał odstający. Usuń powierzchnie opłucnej i naczyń.
  3. Utwórz maskę dla powierzchni dróg oddechowych, korzystając z opcji Edytuj i Zamaskuj wszystko. Wybierz kanał dróg oddechowych i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0,001.
  4. Zapisz plik z maską dróg oddechowych jako serię TIFF w folderze. Zapisz plik z kanałem conidia jako serię TIFF w osobnym folderze.

7. Przetwarzanie obrazu: korekta maski

  1. Otwórz plik z maską dróg oddechowych na platformie open source do analizy obrazu biologicznego17 jako obraz 8-bitowy. Utwórz obraz w formacie binarnym, klikając przycisk Proces | Binarny | Utwórz plik binarny.
    UWAGA: W razie potrzeby popraw maskę: usuń nadmiarowe powierzchnie za pomocą zakładki Wybór wielokąta i Usuń. Alternatywnie można użyć narzędzia Flood Fill Tool (Wypełnianie powodziowe).
  2. Narysuj brakujące powierzchnie, kilkakrotnie rozszerzając (3D): kliknij Wtyczki | Proces | Rozszerzanie (3D). Wypełnij otwory, klikając przycisk Process | Binarny | Wypełnianie otworów. Użyj interpolacji wyboru i menedżera ROI, aby ręcznie wypełnić pozostałe otwory w masce. Zastosuj kilka opcji erozji (3D) (Wtyczki | Proces | Erodowanie (3D)), aby ponownie próbkować grubość maski.
    UWAGA: Tworzenie makr za pomocą wtyczek | Opcje makr dla wielu powtórzeń rozszerzania (3D) i erozji (3D).
    Upewnij się, że liczba aplikacji Erode (3D) jest równa liczbie aplikacji Dilate (3D).
  3. Zapisz maskę w nowym folderze jako serię TIFF.

8. Analiza ilościowa konidiów

  1. Otwórz aplikację na platformie programowania i obliczeń numerycznych: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. Naciśnij przycisk Dodaj pliki. Wybierz folder maski dróg oddechowych i folder konidia.
  3. Ustaw niestandardowy próg z zakresu od 0 do 1. Naciśnij przycisk OK.
  4. Zapisz tabelę wyjściową w niestandardowym pliku .xls
    5. .
  5. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Zgodnie z powyższym protokołem, uzyskano obraz 3D pokazujący drogi oddechowe i konidia A. fumigatus w płacie płucnym myszy (Rysunek 1A). Streptawidyna (która była używana do wizualizacji dróg oddechowych) oznaczała oskrzela i oskrzeliki 15. Dodatkowo, duże naczynia, które można łatwo odróżnić od dróg oddechowych po ich morfologii, oraz opłucna są uwidocznione w kanale dróg oddechowych (Rysunek 1A-C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Obrazowanie 3D całego narządu pozwala na uzyskanie danych bez preparacji próbki, co ma ogromne znaczenie dla badania przestrzennych aspektów anatomicznego rozmieszczenia patogenu w organizmie. Istnieje kilka technik i modyfikacji optycznego oczyszczania tkanek, które pomagają przezwyciężyć rozpraszanie światła laserowego i umożliwiają obrazowanie całego narządu 15,16,18,19. Jedno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Acknowledgements

Autorzy dziękują Prof. Svenowi Krappmannowi (Szpital Uniwersytecki w Erlangen i FUA Erlangen-Nürnberg, Niemcy) za dostarczenie szczepu konidiów Aspergillus fumigatus AfS150. Autorzy dziękują Biuru Prasowemu MIPT. V.B. dziękuje Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Prace nad obrazowaniem i kwantyfikacją konidiów A. fumigatus były wspierane przez RSF nr 19-75-00082. Prace dotyczące obrazowania dróg oddechowych były wspierane przez RFBR nr 20-04-60311.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus konidiaATCC46645Szczep AfS150, pochodna ATCC 46645
Alkohol benzylowyPanreac141081.161198,0-100 %
Benzoesan benzyluAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 myszyPushchino Animal Centrum Hodowlane (Rosja)Samiec. 12 - 30 tygodni.
CewnikVenisystemsG715-A0118G
Obrazowanie komórek komora ze szklanym dnemEppendorf307420284 lub 8-dołkowa komora ze szklanym dnem
WirówkaEppendorf5804RMożna użyć dowolnej wirówki 1000 g
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZEISSZEISS LSM780
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich276855≥ 99,9%
Pakiet do przetwarzania obrazu FIDŻIDarmowe oprogramowanieFIJI
KleszczB. Braun AesculapBD557RKleszcz zębaty
B. Braun AesculapBD321RKleszcz z cienką końcówką
Bochem1727Gładki
Butelka szklanaDURAN242101304Z mieloną pokrywką
Edytor graficzny PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford InstrumentsDostępna jest bezpłatna wersja próbna https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObiektywZEISS420640-9800-000  Plan-apochromatyczny, 10 i razy; (NA = 0,3)
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
PipetaProLine722020od 5 do 50 sztuk L
Mleko w proszkuRothT145.2
Mieszalnik próbekDynalMXIC1
NożyczkiB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 obr./min
SkalpelBochem12646
Nić jedwabnaB. Braun3 USP
Streptawidyna, Alexa Fluor 488 koniugatThermoFisherS11223
ProbówkaSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroksymetyloaminometan)HelikonH-1702-0,5  Pan 121.14; Numer CAS: 77-86-1
Triton X-100Amresco Am-O694-0.1
Oprogramowanie mikroskopuZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

References

  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
  3. Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
  4. Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
  5. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
  6. Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
  7. Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
  8. Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
  9. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
  10. Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
  11. Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
  12. Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
  13. Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
  14. Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085(2018).
  15. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
  16. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
  19. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382(2014).
  20. Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaAspergillus fumigatusdystrybucja konidi wanaliza ilo ciowaca e mocowanieoptycznie oczyszczone p ucoklirens luzowo rz skowymakrofagi p cherzykowe p cherzyk w p ucnychneutrofilekonfiguracja eksperymentalnaoczyszczanie optyczneprotok obrazowaniaprzygotowanie pr bkiustawienia mikroskopowe