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요약

우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.

초록

아스퍼 질러스 fumigatus 코니디아는 인간의 기도를 관통 할 수있는 공중 병원체입니다. 알레르기가없는 면역 능력이있는 사람들은 저항력과 면역 학적 내성을 나타내며 면역 손상 환자에서는 conidia가 기도를 식민지화하고 심각한 침습적 호흡기 질환을 일으킬 수 있습니다. 다른 기도 구획에 있는 각종 세포는 곰팡이 침략을 방지하는 면역 반응에서 관련시킵니다; 그러나 병원체 제거의 현세안-측두형 측면은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 광학적으로 클리어된 전산 기관, 특히 실험용 마우스의 폐의 3차원(3D) 이미징은 감염 후 다른 시점에서 기도에 형광으로 표지된 병원균의 검출을 허용합니다. 본 연구에서는, 우리는 기도에서 A. fumigatus conidia 분포의 정량적 분석을 수행하기 위한 실험 적인 설정을 기술합니다. 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)를 사용하여, 우리는 기관지 가지에 형광 표지 코니디아의 위치를 추적하고 폐포 구획 6 마우스에 구비 후 시간. 여기서 설명된 접근법은 면역 반응의 상이한 단계에서 병원균 상호 작용 세포의 정확한 병원체 위치 및 식별의 검출을 위해 이전에 사용되었습니다. 실험 설정은 다른 병리학 적 조건에서 병원체 제거의 운동학을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

매일, 사람들은 호흡기1을관통할 수 있는 기회성 곰팡이 아스퍼질러스 훈가투스(A.fumigatus conidia)의 포자를 포함하여 공중 병원균을 흡입한다. 포유동물의 호흡기는 기도벽2,3,4의상이한 구조를 특징으로 하는 다양한 세대의 기도 시스템이다. 기관막 벽은 점액 통관5를제공하는 섬모 세포인 여러 세포 유형으로 구성된다. 폐포에서는, 점액 통관6에의해 제거될 수 없고 관통폐포 공간 병원체가 없는 ciliated 세포 및 관통폐공간 병원체가 없습니다. 더욱이, 각 기도 생성은 다중 면역 세포 인구를 위한 틈새 시장이고 이 인구의 하위 집합은 특정 기도 구획을 위해 유일합니다. 따라서, 폐포 대식세포는 폐포 구획에 상주하며, 기관및 전도기도는 모두 상피 수지상 세포7,8로줄지어 있다.

A. fumigatus 코니디아의 대략적인 크기는 2-3.5 μm9입니다. 인간과 마우스에서도 작은 기도의 직경이 3.5 μm을 초과하기 때문에, 코니아가 폐포 공간2,10,11을관통할 수 있다는 것이 제안되었다. 실제로, 조직학적 검사는 아스퍼질로증(12)으로 고통받는 환자의 폐포에서곰팡이 성장을 보였다. 코니디아는 또한 두꺼운 폐 슬라이스의 라이브 이미징을 사용하여 감염된 마우스의폐포(13)에서검출되었다. 동시에, 코니디아는마우스(14)의기관지 상피의 발광 측에서 검출되었다.

광학적으로 클리어된 전체 마운트 마우스 폐의 3차원(3D) 이미징은기도(15)의형태측정 분석을 허용한다. 특히, 내장 흉막 신경 분포의 정량분석은 광학적으로 지워진 마우스 폐표본(15)을사용하여 수행되었다. 최근, Amich외. 16은 광학적으로 클리어된 마우스 폐 표본의 광시트 형광 현미경 검사를 이용하여 면역손상마우스에 코니아를 적용한 후 곰팡이 성장을 조사하였다. 감염 후 다른 시점에서 기도에 있는 휴식 코니디아의 정확한 위치는 염증의 특정 단계에서 충분한 항진균 방어를 제공할 수 있는 세포 인구를 확인하는 데 중요합니다. 그러나, 상대적으로 작은 크기로 인해, 기도내A. 후미가투스 코니디아 분포의 현세-측두성 측면은 제대로 특성화되지 않습니다.

여기서, 감염된 마우스의 기도에서 A. fumigatus 코니디아 분포의 정량적 분석을 위한 실험적인 설정을 제시한다. 형광공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여 형광으로 표지된 A. fumigatus 코니디아의 구인두 적용을 받은 마우스의 광학적으로 클리어된 폐의 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여, 3D 영상을 얻고 영상 처리를 수행한다. 전산 폐 엽의 3D 이미징을 사용하여, 우리는 이전에 코니디아 적용 후 72 시간 마우스의 실시기도에서 A. fumigatus 코니디아의 분포를 보여 주었다8.

프로토콜

여기에 설명 된 실험실 동물에 관한 모든 방법은 생물 유기 화학의 Shemyakin 및 Ovchinnikov 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다, 과학의 러시아 아카데미 (프로토콜 번호 226/2017).

1. A. 후미가투스 코니디아 응용 프로그램

  1. 형광으로 표기 된 A. fumigatus conidia를 얻으려면, 코니디아 펠릿에 3 %의 파라 포름알데히드의 1 mL을 추가하여 5 × 108 코니디아를 수정합니다. 실온에서 셰이커에 2 시간 동안 50 mL 테스트 튜브에서 인큐베이션.
  2. 20mL의 인산염 완충식식염(PBS)으로 코니디아를 세척: 원심분리기는 1,000 x g에서 15분 동안 1,000xg로 부드럽게 제거하고, 20mL의 부피에 신선한 PBS를 추가합니다. 반복하다.
  3. 0.1 M NaHCO3의900 μL에서 코니디아를 녹입니다.
  4. 디메틸 설프리산화물 의 100 μL에 594 nm 형광 염료의 succinimidyl 에스테르를 녹이고 코니디아에 추가합니다.
  5. 실온에서 150 rpm에서 셰이커에 1 시간 동안 염료로 코니디아를 인큐베이션하십시오.
  6. 원심분리기에서 PBS 20mL로 코니디아를 15분 간 1,000xg에 두 번 씻습니다.
  7. 코니디아를 PBS에서 1× 108 코니디아/mL의 농도로 희석하고 4°C에 저장한다.
  8. 0.5-3% 이소플루란 증기로 마우스를 마취한다. 마우스를 홀더에 놓고 혀를 매끄러운 집게로 고정하고 나레를 잡습니다. 단일 채널 파이펫을 가져 와서 마우스 인두에 코니디아 서스펜션 50 μL을 적용하십시오. 서스펜션이 흡입될 때까지 기다립니다.

2. 표본 준비

  1. 50mL 테스트 튜브를 준비하고 신선한 2 % 파라 포름 알데히드의 15 mL로 채웁니다. 의료 기기(15cm 이빨해부스팅 포셉, 8cm 미세 팁 포셉, 무딘 끝이 있는 10cm 가위)를 70% 에탄올 용액에 넣습니다.
  2. IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시합니다. 그런 다음 마우스를 등대 위치에 놓고 마우스 발을 바늘로 고정시하십시오.
    참고: 안락사에 자궁 경부 탈구를 사용하는 경우 기관지의 무결성을 보장하십시오.
    1. 스프레이를 사용하여 70 %의 에탄올로 마우스를 치료하십시오.
    2. 뒷발에서 앞발과 턱에 이르는 복부 피부의 중앙값 세로 컷을 만듭니다.
    3. 치아 집게와 닫힌 가위를 사용하여 피하 조직으로부터 피부를 분리합니다. 바늘로 피부의 윗쪽 끝을 고정합니다.
    4. 복벽에 절개를 하고 간을 다이어프램에서 분리합니다. 닫힌 가위로 다이어프램을 조심스럽게 선택한 다음 다이어프램을 잘라냅니다.
    5. 기관진이 보일 때까지 흉부와 목 결합 조직의 내측 컷을 만듭니다.
  3. 기관 아래에 실크 실을 실행하고 두 개의 집게를 사용하여 수술 매듭을 만듭니다.
    참고: 실크 실 대신 치실을 사용하십시오.
    1. 조심스럽게 실을 당기고 가위로 결합 조직에서 폐를 잘라냅니다. 가위를 테이블에 수직으로 고정합니다.
    2. 2% 파라포름알데히드로 50mL 시험관에 폐를 넣습니다. 나사가 튜브 바깥쪽으로 끝나고 덮개를 단단히 놓고 튜브를 뒤집어 폐를 파라포름데히드로 덮습니다. 폐를 4°C에서 하룻밤 동안 유지합니다.
  4. 폐 엽을 심장과 메스로 해부합니다.
    1. 폐 엽을 24개의 웰 플레이트에 넣고 각 엽을 별도의 우물에 넣습니다. 트리스 완충식식염수(TBS) pH 7.4의 1mL로 폐엽을 세척하고, 150rpm에서 셰이커에 각각 1h로 5회 세척한다.
    2. 1mL의 차단 버퍼(트리톤 X 100, TBS의 5% 분말 우유)로 1mL의 TBS를 교체하고 셰이커의 실온에서 밤새 시편을 둡니다.
    3. 블로킹 버퍼를 TBS에서 1mL의 스트렙타비딘-488-nm 형광 컨쥬게이트로 교체하십시오.
  5. 시편을 1mL의 1mL로 각각 1mL씩 쉐이커(150rpm)에 세척한다. 시편을 새로운 우물로 옮기고 4°C에서 하룻밤 사이에 2%의 파라포름알데히드로 덮어 수정 후.

3. 마우스 폐 로브 광학 클리어링

  1. 시편을 5mL 의 5mL 의 50% 메탄올-물 용액으로 채워진 5mL 유리 병에 넣고 실온에서 시료 믹서에 1시간 동안 놓습니다.
  2. 50% 메탄올3mL을 100% 메탄올3mL로 교체하고 2시간 동안 시료 믹서에 올려 놓습니다. 벤질 알코올과 벤질 벤조아테(BABB)의 혼합물을 총 1mL로 준비한다.
  3. 시편을 24개의 웰 플레이트로 옮기고 1mL의 BABB 혼합물로 30분 이상 덮습니다. 오랜 시간 동안 BABB에 표본을 두지 마십시오; BABB는 플라스틱 플레이트를 손상시키고 표본을 너무 단단하게 만들 수 있습니다.
  4. 세포 이미징 커버글래스-바닥 챔버에 표본을 넣습니다. 샘플은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.

4. CLSM을 가진 마우스 폐 엽 화상 진찰

  1. 현미경 시스템을 켭니다. 현미경 소프트웨어를 엽니다. 찾기 탭에서 전송 표시등을 켭니다. 10배 목표를 선택합니다.
    참고: 보다 자세한 분석을 위해 20배 목표를 사용하지만 실험 시간과 이미지 파일 크기가 증가합니다.
  2. 커버 슬라이드 홀더에 표본이 있는 챔버를 놓습니다. 목표보다 XY 단계에 홀더를 배치합니다. 목표 위에 단계의 XY 컨트롤을 사용하여 표본을 집중시합니다. 송전 광과 접면을 사용하여 시편 Z-평면을 수동으로 찾습니다.
  3. 소프트웨어를 인수 탭으로 전환합니다. CLSMλ-mode를 선택합니다. 488 nm 및 561 nm 레이저를 켭니다. 488/561 nm 디크로이크 미러를 선택합니다. 검출기의 스펙트럼 범위를 490-695 nm로 변경합니다. 레이저 전력을 적절한 범위(10-50 μW)로 조정합니다. 검출기 게인을 750-900 범위 사이 조정합니다.
    참고: 노이즈로 인해 게인 설정이 높을수록 바람직하지 않습니다.
  4. 1AU 버튼을 클릭하여 핀홀을 1개의 에어리 유닛으로 좁히세요. 픽셀 해상도를 512× 512픽셀로 설정합니다.
  5. Z 스택 모드를 켭막히게 합니다. 라이브 이미징을 시작합니다. 두 염료가 모두 표시되는 초점 평면을 선택합니다.
    참고: 필요한 경우 레이저 전원을 조정하여 두 개의 형광 염료의 밝기를 정규화합니다. 갤러리 및 단일 채널 모드를 사용하여 클리핑을 방지하고 형광 강도와 정확하게 일치합니다.
  6. 나타난 Z 스택 창을 확장합니다. 초점 휠을 사용하고 샘플의 가장 낮은 평면을 찾습니다. Z 스택 창의 첫 번째 단추를 사용합니다. 초점 평면을 위쪽으로 이동하여 시편의 상단 경계를 찾고 마지막 단추를 사용하여 위치를 저장합니다. Z 스택 창에서 샘플 깊이의 표현을 확인합니다.
    참고: 첫 번째 및 마지막 위치를 선택한 후 샘플 깊이의 표현이 Z 스택 창에 나타납니다.
  7. Z 스택 창을 보고 시편 바닥 근처에 초점 휠을 사용하여 목표를 배치합니다. 이것은 시편의 바닥에서 약 20 μm입니다.
  8. Z 스택 모드를 끄고 타일 스캔 모드를 켭니다. 시편의 크기에 적합한 타일 수의 이미지를 획득합니다. 5 × 5 타일은 좋은 출발점입니다.
  9. 타일의 수와 표본 XY 위치를 조정하여 전체 폐가 타일 이미지 내부에 맞을 때까지 조정합니다. 새로 획득한 XY 위치의 Z 스택 위치의 정확성을 시료 의 중심의 위치를 다시 확인합니다.
  10. Z 스택과 타일 스캔 모드를 모두 켭니다. Z 단계(Z 스택 창)를 5μm로 설정합니다. 스캔 속도를 6으로 설정합니다. 자동 저장 기능을 켭니다. 별도의 타일을 저장하는 옵션을 켭니다. 파일이름을 지정합니다. 실험 시작 버튼을 누릅니다.
  11. 실험이 현미경에 할당된 시간을 초과하지 않는지 확인합니다. 그렇다면 - 속도를 조정합니다.
    참고: 대략적인 파일 크기는 10Gb 이상입니다. 하드 드라이브에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.

5. 스펙트럼 혼합 및 스티치

  1. 초기 이미지 처리에 소프트웨어를 사용합니다. 스펙트럼 혼합 해제의 경우 혼합 해제 옵션을 선택합니다. 스트렙타비딘/기도 및 코니디아에 해당하는 두 개의 영역을 선택하여 이미지에서 스펙트럼을 획득합니다. 믹싱 해제를 클릭합니다.
    참고: 또는 기존 스펙트럼을 488 및 594nm 형광에 사용합니다.
  2. 이미지 처리를 위해 파일을 열고 처리 탭을 선택합니다. 메서드 섹션에서 기하학적 및 스티치를 선택합니다. 매개 변수 섹션에서 새 출력을 선택하고 퓨즈 타일 옵션을 표시합니다. 기도 형광에 대응하는 선택한 채널과 참조 모드를 사용합니다. 적용을 클릭하여 스티치를 적용합니다.

6. 이미지 처리 : 표면 렌더링

  1. 짝수 3D 뷰로 이미지를 엽니다. 기도 시각화에 사용된 채널에 대한 옵션 Surface를 사용하여 기도 표면을 만듭니다. 10 μm의 스무딩 매개변수를 선택합니다.
    참고: 자동 임계값값도 선택합니다.
  2. 표면을 육안으로 검사합니다. 임계값을 선택하여 외딴 신호를 줄입니다. 흉막과 용기의 표면을 제거합니다.
  3. 옵션 편집 및 마스크 모두를사용하여 기도 표면에 대한 마스크를 만듭니다. 기도 채널을 선택하고 Voxels를 표면 외부의 0.001로 설정합니다.
  4. 폴더에 TIFF 계열로 기도 마스크로 파일을 저장합니다. 파일을 TIFF 계열로 사용하여 파일을 별도의 폴더에 저장합니다.

7. 이미지 처리 : 마스크 보정

  1. 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼에서 기도 마스크로 파일을 열어 8비트 이미지로합니다(17). 프로세스 | 클릭하여 이미지 바이너리 만들기 바이너리 | 바이너리를 만듭니다.
    참고: 필요한 경우 마스크를 수정: 다각형 선택 영역을 사용하여 과도한 표면을 제거하고 탭 삭제합니다. 또는 홍수 채우기 도구를사용합니다.
  2. 여러 번 팽창 (3D)를사용하여 누락 된 표면을 그리기 : 플러그인 | 클릭 프로세스 | 디레이트 (3D). 프로세스 | 클릭하여 구멍을 채웁니다. 바이너리 | 구멍을 채웁니다. 선택 및 ROI 관리자 보간을 사용하여 마스크의 잔여 구멍을 수동으로 채웁니다. 여러 침식 (3D) 옵션(플러그인 | 적용 프로세스 | 침식 (3D)) 마스크 두께를 재샘플링합니다.
    참고: 플러그인 | 사용하여 매크로만들기 여러 디레이트(3D) 및 침식(3D)에 대한 매크로 옵션이 반복됩니다.
    Erode(3D) 수가 디레이트(3D) 응용 프로그램 수와 동일한지 확인합니다.
  3. 마스크를 새 폴더에 TIFF 시리즈로 저장합니다.

8. 코니디아 정량 분석

  1. 프로그래밍 및 숫자 컴퓨팅 플랫폼에서 앱을 엽니다: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. 파일 추가 버튼을 누릅니다. 기도 마스크 폴더와 코니디아 폴더를 선택합니다.
  3. 0에서 1 사이의 사용자 지정 임계값을 설정합니다. 확인 버튼을 누릅니다.
  4. 출력 테이블을 사용자 지정 .xls 파일에 저장합니다.
  5. 통계 분석을 위해 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

결과

상기 프로토콜에 따라, 마우스의 폐엽에서 기도 및 A. 후미가투스 코니디아를 보여주는 3D 영상을 얻었다(도1A). 스트렙타비딘 (기도 시각화에 사용 된) 라벨 기관지 및 기관지15. 또한, 그들의 형태에 의해 기도와 쉽게 구별할 수 있는 대형 선박, 및 흉막은 기도 채널(그림1A-C)에서시각화된다. 기도 표면과 마스크의 생...

토론

전장기 3D 이미징은 시편의 해부 없이 데이터를 얻는 것을 허용하며, 이는 유기체에서 병원체의 해부학적 분포의 공간 적 측면을 조사하는 데 매우 중요합니다. 레이저 광 산란을 극복하고 전신 학습자 이미징15, 16,18,19를허용하는 데 도움이되는 조직 광학 클리어링의 몇 가지 기술 및 변형이 있습니다...

공개

저자는이 작품에 대한 이해 상충을보고합니다.

감사의 말

저자는 아스퍼질러스 후미가투스 코니디아 균주 AfS150을 제공한 스벤 크라프만 교수(대학 병원 에를랑겐과 FUA 에를랑겐-뉘른베르크, 독일)에게 감사를 표합니다. 저자는 MIPT 프레스 오피스에 감사드립니다. V.B. 러시아 연방 과학 고등 교육부 (#075-00337-20-03, 프로젝트 FSMG-2020-0003)를 인정합니다. A. fumigatus 코니디아 이미징 및 정량화에 관한 작업은 RSF No 19-75-00082에 의해 지원되었다. 기도 화상 진찰에 관하여 일은 RFBR No 20-04-60311에 의해 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcoholPanreac141081.161198.0-100 %
Benzyl benzoateAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 micePushchino Animal Breeding Centre (Russia)Male. 12 - 30 week old.
CatheterVenisystemsG715-A0118G
Cell imaging coverglass-bottom chamberEppendorf307420284 or 8 well chamber with coverglass bottom
CentrifugeEppendorf5804RAny centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscopeZEISSZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich276855≥99.9%
FIJI image processing packageFIJIFree software
ForcepB. Braun AesculapBD557RToothed
ForcepB. Braun AesculapBD321RFine-tipped
ForcepBochem1727Smooth
Glass bottleDURAN242101304With ground-in lid
Graphic Editor PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford InstrumentsFree trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObjectiveZEISS420640-9800-000 Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
PipetteProLine7220205 to 50 μL
Powdered milkRothT145.2
Sample mixerDynalMXIC1
ScissorsB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
Silk threadB. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisherS11223
Test tubeSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)HeliconH-1702-0.5 Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN microscope softwareZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

참고문헌

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