קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

Summary

אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.

Abstract

אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה הם פתוגנים מוטסים שיכולים לחדור דרכי הנשימה האנושיות. אנשים אימונו-מוכשרים ללא אלרגיות מפגינים עמידות וסובלנות חיסונית, ואילו בחולים אימונו-קום, קונידיה יכולה ליישב דרכי הנשימה ולגרום להפרעות נשימה פולשניות חמורות. תאים שונים בתאי דרכי הנשימה השונים מעורבים בתגובה החיסונית המונעת פלישה פטרייתית; עם זאת, ההיבטים המרחבי-זמניים של חיסול פתוגן עדיין לא מובנים לחלוטין. הדמיה תלת ממדית (3D) של איברים בעלי הרכבה מלאה שנוקתה אופטית, במיוחד הריאות של עכברים ניסיוניים, מאפשרת זיהוי של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. במחקר הנוכחי, אנו מתארים התקנה ניסיונית לביצוע ניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM), איתרנו את המיקום של קונידיה שכותרתו פלואורסצנטית בענפי הסימפונות ובתא המכתשי 6 שעות לאחר יישום oropharyngeal לעכברים. הגישה המתוארת כאן שימשה בעבר לזיהוי מיקום הפתוגן המדויק וזיהוי התאים האינטראקטיביים של הפתוגן בשלבים שונים של התגובה החיסונית. ההתקנה הניסיונית יכולה לשמש להערכת הקינטיקה של חיסול הפתוגן בתנאים פתולוגיים שונים.

Introduction

על בסיס יומי, אנשים שואפים פתוגנים מוטסים, כולל נבגים של פטריות אופורטוניסטיות אספרגילוס פומיגאטוס (A. fumigatus conidia) שיכולים לחדור את דרכי^{הנשימה 1}. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים המאופיינים במבנים השונים של קירות דרכי^{הנשימה 2,3,4}. קירות קנה הנשימה מורכבים ממספר סוגי תאים ביניהם תאים ססיליים המספקים את הסיווג הרירי⁵. ב alveoli, אין תאים ciliated ואת פתוגנים בחלל המצף חודר לא ניתן לחסל על ידי אישור רירית⁶. יתר על כן, כל ייצור דרכי הנשימה הוא נישה עבור אוכלוסיות תאי חיסון מרובות ותת קבוצות של אוכלוסיות אלה ייחודיות לתאי דרכי הנשימה מסוימים. לפיכך, מקרופאגים מכתשיים שוכנים בתאים מכתשיים, בעוד הן קנה הנשימה והן דרכי הנשימה המוליכות מרופדים בתאים דנדריטיים תוך-אפיטליים^7,8.

הגודל המשוער של קונידיה A. fumigatus הוא 2-3.5 מיקרומטר⁹. מאז הקוטר של דרכי הנשימה הקטנות בבני אדם ואפילו בעכברים עולה על 3.5 מיקרומטר, הוצע כי conidia יכול לחדור את החלל המהשתי^2,10,11. למעשה, בדיקה היסתולוגית הראתה את הצמיחה הפטרייתית ב alveoli של החולים הסובלים אספרגילוזיס¹². Conidia זוהו גם alveoli של עכברים נגועים באמצעות הדמיה חיה של פרוסות הריאה העבה¹³. בו זמנית, conidia זוהו בצד הזוהר של אפיתל הסימפונות של עכברים¹⁴.

הדמיה תלת מימדית (3D) של ריאות העכבר המלא שנוקתה אופטית מאפשרת ניתוח מורפומטרי של דרכי^{הנשימה 15}. במיוחד, הניתוח הכמותי של התפלגות עצב pleural הקרביים בוצע באמצעות אופטית ניקה דגימות ריאות עכבר¹⁵. לאחרונה, Amich ואח^{' 16} חקר את הצמיחה הפטרייתית לאחר יישום תוך נאוי של conidia לעכברים immunocompromised באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של דגימות ריאות עכבר נקי אופטית. המיקום המדויק של conidia המנוחה בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר הזיהום חשוב לזיהוי אוכלוסיות התאים שיכולים לספק הגנה אנטי פטרייתית מספקת בשלבים מסוימים של דלקת. עם זאת, בשל הגודל הקטן יחסית, ההיבטים המרחבי-זמניים של התפלגות קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה מאופיינים בצורה גרועה.

כאן, אנו מציגים מערך ניסיוני לניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה של עכברים נגועים. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM) של ריאות מנוקות אופטית של עכברים שקיבלו יישום oropharyngeal של conidia A. fumigatus, אנו מקבלים תמונות תלת-ממדיות ומבצעים את עיבוד התמונה. באמצעות הדמיה תלת-ממדית של אונת הריאות כולה, הראינו בעבר את ההתפלגות של קונידיה A. fumigatus בנתיב האוויר של עכברים 72 שעות לאחר יישום conidia⁸.

Protocol

כל השיטות הנוגעות לחיות מעבדה המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכון שמיאקין ואובצ'יניקוב לכימיה ביואורגנית, האקדמיה הרוסית למדעים (פרוטוקול מספר 226/2017).

1. א. יישום קונידיה של פומיגטוס

1. כדי להשיג פלואורסצנטית שכותרתו A. fumigatus conidia, לתקן 5 × 10⁸ conidia על ידי הוספת 1 מ"ל של 3% paraformaldehyde לכדור conidia. דגירה במבחנה של 50 מ"ל למשך 2 שעות על שייקר בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף conidia עם 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS): צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות, בעדינות להסיר את supernatant, ולהוסיף PBS טרי בנפח של 20 מ"ל. חוזר.
3. להמיס את conidia ב 900 μL של 0.1 M NaHCO₃.
4. ממיסים את אסתר הסוצ'ינימידיל של צבע פלואורסצנטי 594 ננומטר ב 100 μL של דימתיל סולפוקסיד ולהוסיף conidia.
5. לדגור את conidia עם הצבע במשך 1 שעה על שייקר ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר.
6. לשטוף את conidia פעמיים עם 20 מ"ל של PBS בצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות.
7. לדלל את conidia לריכוז של 1 × 10⁸ conidia / mL ב PBS ולאחסן ב 4 °C (77 °F).
8. תירדים את העכבר עם 0.5-3% אדים איזופלוריין. שים את העכבר על המחזיק, תקן את הלשון במלקחיים חלקים, והחזק את ה- nares. קח pipette ערוץ יחיד ולהחיל 50 μL של השעיית conidia על הלוע העכבר. חכה עד שההשעיה תשאוף.

2. הכנת דגימה

1. הכן את מבחנה 50 מ"ל ולמלא אותו עם 15 מ"ל של 2% paraformaldehyde טרי. מניחים את המכשירים הרפואיים (מלקחיים ניתוח שיניים 15 ס"מ, מלקחיים עדינים 8 ס"מ ומספריים 10 ס"מ עם קצוות קהים) לתמיסת אתנול 70%.
2. המת חסד העכבר בהתאם לפרוטוקול IACUC. לאחר מכן למקם את העכבר במצב גבעול ולתקן את כפות העכבר עם מחטים.
   הערה: אם משתמשים בפריקה צוואר הרחם להמתת חסד, להבטיח את שלמות קנה הנשימה.
   1. לטפל בעכבר עם 70% אתנול באמצעות מרסס.
   2. הפוך חתך אורך חציוני בעור הגחון מן כפות הרגליים האחוריות אל forepaws ואת הסנטר.
   3. להפריד את העור מן הרקמה התת עורית באמצעות מלקחיים שיניים ומספריים סגורות. לתקן את הקצוות העליונים של העור עם מחטים.
   4. לעשות חתכים בדופן הבטן ולהפריד את הכבד מן הסרעפת. בזהירות לבחור את הסרעפת עם מספריים סגורים ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת.
   5. הפוך חתך מנדלי של בית החזה ורקמות חיבור הצוואר עד קנה הנשימה גלוי.
3. הפעל חוט משי מתחת קנה הנשימה ולעשות קשר כירורגי באמצעות שני מלקחיים.
   הערה: לחלופין, השתמש בחוט דנטלי במקום בחוט משי.
   1. בזהירות למשוך את החוט ולחתוך את הריאות מרקמת החיבור עם מספריים. החזק את המספריים בניצב לשולחן.
   2. שים את הריאות במבחנה 50 מ"ל עם 2% paraformaldehyde. להשאיר חוט מסתיים מחוץ לצינור, לשים את הכיסוי חזק, ולהפוך את הצינור כדי לכסות את הריאות עם paraformaldehyde. החזק את הריאות לילה ב 4 °C (5 °F).
4. לנתח את אונות הריאות מהלב וזה את זה עם אזמל.
   1. שים את אונות הריאות בצלחת 24 היטב, עם כל אונה בבאר נפרדת. לשטוף את אונות הריאות ב 1 מ"ל של תמיסת מלח (TBS) pH 7.4, 5 פעמים עבור 1 שעה כל אחד על שייקר ב 150 סל"ד.
   2. החלף 1 מ"ל של TBS עם 1 מ"ל של מאגר חסימה (1% Triton X 100, 5% אבקת חלב ב- TBS) ולהשאיר את הדגימה לילה בטמפרטורת החדר על שייקר.
   3. החלף את מאגר החסימה עם 1 מ"ל של סטרפטאבידין-488- ננומטר פלואורכרום מצומד 1:30 ב- TBS. השאר את הדגימה לפחות 72 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר (150 סל"ד).
5. לשטוף את הדגימה 5 פעמים במשך 1 שעה כל אחד ב 1 מ"ל של TBS בטמפרטורת החדר על שייקר (150 סל"ד). מעבירים את הדגימה לבארות החדשות ומכסים אותה ב-2% פרפורמלדהיד לילה ב-4 מעלות צלזיוס לאחר קיבעון.

3. ניקוי אופטי של אונת הריאה של העכבר

1. מניחים את הדגימה בבקבוק זכוכית 5 מ"ל מלא 3 מ"ל של 50% פתרון מי מתנול ולשים אותו על מערבל מדגם בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
2. החלף 3 מ"ל של 50% מתנול עם 3 מ"ל של 100% מתנול ולשים אותו על מערבל מדגם במשך 2 שעות. הכן תערובת 1:2 v/v של בנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB) בנפח כולל של 1 מ"ל.
3. מעבירים את הדגימה לצלחת של 24 באר ומכסים ב-1 מ"ל של תערובת BABB למשך 30 דקות לפחות. אין להשאיר את הדגימה ב- BABB במשך זמן רב; BABB יכול לפגוע בצלחת הפלסטיק ולהפוך את הדגימה נוקשה מדי.
4. שים את הדגימה בתא כיסוי הדמיית התא. הדגימה מוכנה להדמיה.

4. הדמיית אונות ריאות עכבר עם CLSM

1. תדליק את מערכת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת המיקרוסקופ. הפעל את נורית השידור בכרטיסיה איתור. בחר את המטרה 10x.
   הערה: לניתוח מפורט יותר, השתמש במטרה 20x, אך היא מגדילה את זמן הניסוי ואת גודל קובץ התמונה.
2. שים את התא עם הדגימה במחזיק שקופית הכיסוי. שים את המחזיק על במת XY מעל המטרה. מרכז את הדגימה באמצעות פקדי XY של הבמה מעל המטרה. השתמש באור השידור ובעין כדי למצוא ידנית את דגימת Z-plane.
3. עבור את התוכנה לכרטיסיה רכישה. בחר CLSM λ-mode. הפעל את הלייזרים 488 ננומטר ו- 561 ננומטר. בחר את המראה הדיכרואית 488/561 ננומטר. שנה את הטווח הספקטרלי של הגלאי ל 490-695 ננומטר. כוונן את כוח הלייזר לטווח המתאים (10-50 μW). התאם את רווח הגלאי בין טווח 750-900.
   הערה: הגדרות רווח גבוהות יותר אינן רצויות עקב רעש.
4. צמצם את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת על-ידי לחיצה על לחצן AU אחד. הגדר את רזולוציית הפיקסלים ל- 512 × 512 פיקסלים.
5. התחל את מצב מחסנית Z. התחל הדמיה חיה. בחר את מישור המוקד שבו שני הצבעים גלויים.
   הערה: במידת הצורך, להתאים את כוח הלייזר כדי לנרמל את הבהירות של שני צבעים פלואורסצנטיים. השתמש בגלריה ובמצב ערוץ יחיד, כדי להימנע מחיתוך ולהתאים במדויק את עוצמת הפלואורסצנטיות.
6. הרחב את חלונית מחסנית Z הופיעה. השתמש בגלגל המיקוד ומצא את המישור הנמוך ביותר של הדגימה. השתמש בלחצן הראשון בחלונית מחסנית Z. הזז את מישור המוקד כלפי מעלה כדי למצוא את הגבול העליון של הדגימה ולשמור את המיקום באמצעות לחצן Last. בדוק את הייצוג של עומק המדגם בחלונית מחסנית Z.
   הערה: ייצוג של עומק המדגם יופיע בחלונית מחסנית Z לאחר בחירת המיקום הראשון והאחרון.
7. מקם את המטרה באמצעות גלגל המיקוד ליד החלק התחתון של הדגימה, על-ידי התבוננות בחלונית מחסנית Z. זה בערך 20 מיקרומטר מתחתית הדגימה.
8. כבה את מצב מחסנית Z וההפעלה של מצב סריקת אריחים. השג את התמונה עם מספר מתאים של אריחים לגודל הדגימה. 5 × 5 אריחים הם נקודת התחלה טובה.
9. כווננו את מספר האריחים ואת מיקום ה-XY עד שכל הריאה תתאים לתמונה המרוחנת. בדוק שוב את הנכונות של מיקומי מחסנית Z עם המיקום XY החדש שהושג של מרכז המדגם.
10. הפעל את מצבי סריקת Z-stack ו-Tile. הגדר שלב Z (בחלונית מחסנית Z) ל- 5 מיקרומטר. הגדר את מהירות הסריקה ל- 6. הפעל את הפונקציה שמירה אוטומטית. הפעל את האפשרות שמירת אריחים נפרדים. תן שם לקובץ. לחץ על לחצן התחל ניסוי.
11. ודא שהניסוי אינו חורג מהזמן שהוקצה במיקרוסקופ; אם כן - להתאים את המהירות.
    הערה: גודל הקובץ המשוער הוא יותר מ- 10 Gb; ודא שיש מספיק מקום בכונן הקשיח.

5. ביטול ותפירה ספקטרליים

1. השתמש בתוכנה לעיבוד התמונה ההתחלתי. עבור ביטול ספקטרלי, בחר באפשרות בטל מיקסינג. בחר שני אזורים המתאימים לסטרפטאבידין / דרכי הנשימה וקונידיה כדי לרכוש את הספקטרום מהתמונה. לחץ על התחל לבטל את ההמהמה.
   הערה: לחלופין, השתמש בספקטרום הקיים עבור פלואורוכרום 488 ו- 594 ננומטר.
2. פתח את הקובץ עבור עיבוד התמונה ובחר בכרטיסיה עיבוד. במקטע שיטות, בחר גיאומטרי ותפירה . במקטע פרמטר, בחר באפשרות פלט חדש וסמן את האפשרות אריחי נתיכים. השתמש במצב ההפניה עם הערוץ שנבחר המתאים לפלורסצנטיות דרכי הנשימה. החל את התפירה על-ידי לחיצה על החל.

6. עיבוד תמונה: עיבוד פני השטח

1. פתחו את התמונה כתצוגת מעבר תלת-ממדי. צור משטח דרכי הנשימה באמצעות האפשרות Surface עבור הערוץ ששימש להדמיה של דרכי הנשימה. בחר בפרמטר החלקה של 10 מיקרומטר.
   הערה: בחר גם את ערך הסף האוטומטי.
2. תבדוק חזותית את פני השטח. בחר את הסף כדי להפחית את האות החיצוני. הסר את המשטחים של pleura וכלי.
3. צרו מסיכה למשטח הנשימה באמצעות אפשרויות עריכה ומסיכת הכל. בחר את ערוץ דרכי הנשימה והגדר את Voxels מחוץ לפני השטח ל- 0.001.
4. שמור את הקובץ עם מסיכת דרכי הנשימה כסדרת TIFF בתיקיה. שמור את הקובץ עם ערוץ conidia כסדרת TIFF בתיקיה הנפרדת.

7. עיבוד תמונה: תיקון מסיכה

1. פתח את הקובץ עם מסיכת דרכי הנשימה בפלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונה ביולוגית¹⁷ כתמונה של 8 סיביות. הפוך את התמונה לבינארית על-ידי לחיצה על תהליך | | בינארי הפוך בינארי.
   הערה: במידת הצורך, תקן את המסיכה: הסר את המשטחים המוגזמים באמצעות הבחירה במצולע והכרטיסיה מחק. לחלופין, השתמש בכלי מילוי הצפה.
2. צייר את המשטחים החסרים באמצעות מספר פעמים להרחיב (3D): לחץ על תוספים | תהליכי | להתרחב (3D). מלא את החורים על-ידי לחיצה על תהליך | | בינארי מלא חורים. השתמש באינטרפולציה של מנהל הבחירה וההחזר על תנאי כדי למלא את שאריות החורים במסכה באופן ידני. החל מספר אפשרויות לשחוק (3D) (תוספים | תהליכי | לשחוק (3D)) כדי לדגום מחדש את עובי המסכה.
   הערה: יצירת פקודות מאקרו באמצעות תוספים | אפשרויות פקודות מאקרו לחזרות מרובות של דילול (תלת-ממד) ו-Erode (3D).
   ודא שמספר השחוק (3D) שווה למספר יישומי דילול (3D).
3. שמור את המסיכה בתיקיה חדשה כסדרת TIFF.

8. קונידיה ניתוח כמותי

1. פתח את האפליקציה בפלטפורמת התכנות והמחשוב המספרי: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
2. לחץ על לחצן הוסף קבצים. בחר את התיקיה מסיכת דרכי הנשימה ואת התיקיה conidia.
3. הגדר סף מותאם אישית בין 0 ל- 1. לחץ על לחצן אישור.
4. שמור את טבלת הפלט בקובץ .xls המותאם אישית.
5. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול לעיל, התמונה 3D מראה את דרכי הנשימה ו A. fumigatus conidia באונה הריאות של עכבר הושגה (איור 1A). סטרפטאבידין (ששימש להדמיה של דרכי הנשימה) שכותרתו סימפונות וסימפונות¹⁵. בנוסף, כלי השיט הגדולים, שניתן להבחין ביניהם בקלות מדבורי הנשימה על ידי המורפולוגי?...

Discussion

הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם מאפשרת קבלת הנתונים ללא ניתוח של הדגימה, שהיא בעלת חשיבות רבה לחקירת ההיבטים המרחביים של ההתפלגות האנטומית של הפתוגן באורגניזם. ישנן מספר טכניקות ושינויים של ניקוי אופטי רקמה המסייעים להתגבר על פיזור אור הלייזר ולאפשר הדמיה של איברים שלמים^15,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html