Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente

Resumo

Descrevemos o método de análise quantitativa da distribuição de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamanho) nas vias aéreas dos camundongos. O método também pode ser utilizado para a análise de micropartículas e distribuição de nanopartículas nas vias aéreas em vários modelos de condições patológicas.

Resumo

Aspergillus fumigatus conidia são patógenos aéreos que podem penetrar nas vias aéreas humanas. Pessoas imunocompetntes sem alergias apresentam resistência e tolerância imunológica, enquanto em pacientes imunocomprometidos, a conidia pode colonizar as vias aéreas e causar distúrbios respiratórios graves. Várias células em diferentes compartimentos das vias aéreas estão envolvidas na resposta imune que previne a invasão fúngica; no entanto, os aspectos espátulais-temporais da eliminação do patógeno ainda não são completamente compreendidos. Imagens tridimensionais (3D) de órgãos de montagem total eliminados opticamente, particularmente os pulmões de camundongos experimentais, permitem a detecção de patógenos fluorescentes rotulados nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção. No presente estudo, descrevemos uma configuração experimental para realizar uma análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM), rastreamos a localização de conidia fluorescente rotulada nos ramos brônquicos e no compartimento alveolar 6 horas após a aplicação do orofaringe aos ratos. A abordagem aqui descrita foi previamente utilizada para detecção da localização precisa do patógeno e identificação das células que interagem com patógenos em diferentes fases da resposta imune. A configuração experimental pode ser usada para estimar a cinética da eliminação do patógeno em diferentes condições patológicas.

Introdução

Diariamente, as pessoas inalam patógenos transmitidos pelo ar, incluindo esporos de fungos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que podem penetrar no trato respiratório¹. O trato respiratório dos mamíferos é um sistema de vias aéreas de diferentes gerações que se caracterizam pelas diferentes estruturas das paredes das vias aéreas^2,3,4. As paredes traqueobronquiais consistem em vários tipos de células entre as quais estão células ciliadas que fornecem o desembaraço mucociliar⁵. Nos alvéolos, não há células ciliadas e os patógenos espaciais alveolares penetrantes não podem ser eliminados pelo desembaraço mucociliary⁶. Além disso, cada geração de vias aéreas é um nicho para múltiplas populações de células imunes e subconjuntos dessas populações são únicos para certos compartimentos das vias aéreas. Assim, os macrófagos alveolares residem nos compartimentos alveolares, enquanto tanto a traqueia quanto as vias aéreas condutoras são forradas com as células dendríticas intraepitheliais^7,8.

O tamanho aproximado de A. fumigatus conidia é de 2-3,5 μm⁹. Uma vez que o diâmetro das pequenas vias aéreas em humanos e até mesmo em camundongos excede 3,5 μm, foi sugerido que a conidia pode penetrar no espaço alveolar^2,10,11. De fato, o exame histológico mostrou o crescimento fúngico nos alvéolos dos pacientes que sofrem de aspergillose¹². Conidia também foi detectada nos alvéolos de camundongos infectados usando imagens vivas das fatias de pulmão espessas¹³. Simultaneamente, conidia foi detectada no lado luminal do epitélio brônquico dos camundongos¹⁴.

A imagem tridimensional (3D) dos pulmões do rato de montagem total eliminados opticamente permite a análise morfométrica das vias aéreas¹⁵. Particularmente, a análise quantitativa da distribuição visceral do nervo pleural foi realizada utilizando amostras de pulmão de camundongos adequadamente limpas¹⁵. Recentemente, Amich et al.¹⁶ investigaram o crescimento fúngico após a aplicação intranasal de conídio aos camundongos imunocomprometidos usando uma microscopia de fluorescência de folhas leves de amostras pulmonares de camundongos eliminados opticamente. A localização precisa da conidia de repouso nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção é importante para identificar as populações celulares que podem fornecer defesa antifúngica suficiente em determinadas fases de inflamação. No entanto, devido ao tamanho relativamente pequeno, os aspectos espástico-temporais da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas são mal caracterizados.

Aqui, apresentamos uma configuração experimental para a análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas de camundongos infectados. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM) de pulmões opticamente limpos de camundongos que receberam uma aplicação orofaríngea da A. fumigatus conidia fluorescente, obtemos imagens 3D e realizamos o processamento da imagem. Usando imagens 3D do lobo pulmonar de todo o monte, já mostramos anteriormente a distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas condutoras de camundongos 72 horas após a aplicação conidia⁸.

Protocolo

Todos os métodos relativos aos animais de laboratório descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Instituto Shemyakin e Ovchinnikov de Química Bioorgânica, Academia Russa de Ciências (protocolo número 226/2017).

1. A. aplicação de conidia fumigatus

1. Para obter fluorescentemente rotulado A. fumigatus conidia, fixe 5 × 10⁸ conidia adicionando 1 mL de 3% de paraformaldeído à pelota conidia. Incubar em um tubo de ensaio de 50 mL por 2 h em um shaker à temperatura ambiente.
2. Lave conidia com 20 mL de soro fisco tampão de fosfato (PBS): centrífuga a 1.000 x g por 15 min, remova suavemente o sobrenante e adicione PBS fresco em um volume de 20 mL. Repetir.
3. Dissolva a conidia em 900 μL de 0,1 M NaHCO₃.
4. Dissolva o éster succinimidil do corante fluorescente de 594 nm em 100 μL de sulfoxida de dimetila e adicione à conidia.
5. Incubar a conidia com o corante por 1h em um shaker a 150 rpm em temperatura ambiente.
6. Lave a conidia duas vezes com 20 mL de PBS na centrífuga a 1.000 x g por 15 min.
7. Diluir a conidia a uma concentração de 1 × 10⁸ conidia/mL na PBS e armazenar a 4 °C.
8. Anestesiar o rato com vapor isoflurane de 0,5-3%. Coloque o mouse no suporte, conserte a língua com fórceps lisos e segure as nares. Pegue uma pipeta de canal único e aplique 50 μL de suspensão conidia à faringe do mouse. Espere até a suspensão ser inalada.

2. Preparação de espécimes

1. Prepare o tubo de ensaio de 50 mL e preencha-o com 15 mL de paraformaldeído fresco de 2%. Coloque os instrumentos médicos (fórceps de dissecação de 15 cm, fórceps de ponta fina de 8 cm e tesoura de 10 cm com extremidades cegas) em solução de 70% de etanol.
2. Eutanize o mouse de acordo com o protocolo IACUC. Em seguida, coloque o rato na posição dorsal e fixe as patas do rato com agulhas.
   NOTA: Se usar luxação cervical para eutanásia, certifique-se da integridade da traqueia.
   1. Trate o mouse com 70% de etanol usando um pulverizador.
   2. Faça um corte longitudinal mediano na pele ventral das patas traseiras para as patas dianteiras e o queixo.
   3. Separe a pele do tecido subcutâneo usando fórceps dentados e tesouras fechadas. Conserte as extremidades superiores da pele com agulhas.
   4. Faça uma incisão na parede abdominal e separe o fígado do diafragma. Escolha cuidadosamente o diafragma com uma tesoura fechada e corte o diafragma.
   5. Faça um corte medial dos tecidos conjuntivos do tórax e pescoço até que a traqueia seja visível.
3. Passe um fio de seda sob a traqueia e faça um nó cirúrgico usando dois fórceps.
   NOTA: Alternativamente, use fio dental em vez de fio dental.
   1. Puxe cuidadosamente a rosca e corte os pulmões do tecido conjuntivo com uma tesoura. Segure a tesoura perpendicular à mesa.
   2. Coloque os pulmões no tubo de ensaio de 50 mL com 2% de paraformaldeído. Deixe as extremidades da rosca fora do tubo, coloque a tampa apertada e vire o tubo para cobrir os pulmões com paraformaldeído. Segure os pulmões durante a noite a 4 °C.
4. Disseca os lóbulos pulmonares do coração e uns dos outros com um bisturi.
   1. Coloque os lóbulos pulmonares em uma placa de 24 poços, com cada lóbulo em um poço separado. Lave os lóbulos pulmonares em 1 mL de soro fisiológico tris-tampão (TBS) pH 7.4, 5 vezes por 1 h cada em um shaker a 150 rpm.
   2. Substitua 1 mL de TBS por 1 mL do tampão de bloqueio (1% Triton X 100, 5% de leite em pó em TBS) e deixe a amostra durante a noite em temperatura ambiente em um shaker.
   3. Substitua o tampão de bloqueio por 1 mL de streptavidin-488-nm conjugado fluorcromo diluído 1:30 em TBS. Deixe o espécime por pelo menos 72 h em temperatura ambiente em um shaker (150 rpm).
5. Lave a amostra 5 vezes por 1 h cada em 1 mL de TBS à temperatura ambiente em um agitador (150 rpm). Transfira a amostra para os novos poços e cubra-a com 2% de paraformaldeído durante a noite a 4 °C para pós-fixação.

3. Limpeza óptica do lobo pulmonar do rato

1. Coloque o espécime na garrafa de vidro de 5 mL preenchida com 3 mL de solução de água de metanol de 50% e coloque-o na batedeira de amostra em temperatura ambiente por 1h.
2. Substitua 3 mL de 50% de metanol por 3 mL de 100% de metanol e coloque-o no misturador de amostras por 2h. Prepare uma mistura de 1:2 v/v de álcool benzílico e benzoato benzílico (BABB) em um volume total de 1 mL.
3. Transfira o espécime para uma placa de 24 poços e cubra com 1 mL de mistura BABB por pelo menos 30 min. Não deixe o espécime no BABB por muito tempo; BABB pode danificar a placa de plástico e tornar o espécime muito rígido.
4. Coloque o espécime na câmara de cobertura de imagens celulares. A amostra está pronta para a imagem.

4. Imagem do lobo pulmonar do rato com CLSM

1. Ligue o sistema de microscópio. Abra o software do microscópio. Acenda a luz de transmissão na guia Localizar. Selecione o objetivo de 10x.
   NOTA: Para uma análise mais detalhada, use o objetivo de 20x, mas aumenta o tempo do experimento e o tamanho do arquivo de imagem.
2. Coloque a câmara com o espécime no porta-slides. Coloque o suporte no estágio XY sobre o objetivo. Centralizar o espécime usando os controles XY do palco em cima do objetivo. Use a luz de transmissão e a ocular para encontrar manualmente o espécime Z-plane.
3. Mude o software para a guia Aquisição. Selecione o modo CLSM λ.. Ligue os lasers de 488 nm e 561 nm. Selecione o espelho dicrómico 488/561 nm. Mude a faixa espectral do detector para 490-695 nm. Ajuste a potência do laser à faixa apropriada (10-50 μW). Ajuste o ganho do detector entre 750-900.
   NOTA: As configurações de ganho mais altas são indesejáveis devido ao ruído.
4. Reduza o pinhole para 1 Unidade arejada clicando no botão 1 AU. Defina a resolução do pixel para 512 × 512 pixels.
5. Ligue o modo Z-stack. Iniciar imagens ao vivo. Selecione o plano focal no qual ambos os corantes são visíveis.
   NOTA: Se necessário, ajuste a potência do laser para normalizar o brilho dos dois corantes fluorescentes. Use o modo Galeria e Single-channel, para evitar o recorte e para combinar com precisão a intensidade da fluorescência.
6. Expanda o painel z-stack apareceu. Use a roda de foco e encontre o plano mais baixo da amostra. Use o primeiro botão no painel Z-stack. Mova o plano focal para cima para encontrar o limite superior do espécime e salve a posição usando o botão Último. Verifique a representação da profundidade da amostra no painel de pilha Z.
   NOTA: Uma representação da profundidade da amostra aparecerá no painel de pilha de Z após a primeira e as últimas posições serem escolhidas.
7. Posicione o objetivo usando a roda de foco perto da parte inferior do espécime, olhando para o painel z-stack. Isto é aproximadamente 20 μm do fundo do espécime.
8. Desligue o modo Z-stack e ligue o modo de varredura de ladrilhos. Adquira a imagem com um número adequado de telhas para o tamanho do espécime. 5 × 5 telhas são um bom ponto de partida.
9. Ajuste o número de telhas e a posição XY da amostra até que todo o pulmão se encaixe dentro da imagem de ladrilho. Verifique novamente a correção das posições de pilha Z com a posição XY recém-obtida no centro da amostra.
10. Ligue os modos Z-stack e Tile Scan. Definir passo Z (em painel z-stack) a 5 μm. Defina a velocidade de varredura para 6. Ligue a função Autosave. Ligue a opção Salvar telhas separadas. Diga o arquivo. Pressione o botão Iniciar experimento.
11. Verificar se o experimento não excede o tempo alocado no microscópio; se assim for - ajuste a velocidade.
    NOTA: O tamanho aproximado do arquivo é superior a 10 Gb; certifique-se de que há espaço suficiente no disco rígido.

5. Descompra e costura espectral

1. Use o software para o processamento inicial da imagem. Para descompração espectral, selecione a opção Descompração. Selecione duas regiões correspondentes ao streptavidin/airways e conidia para adquirir o espectro da imagem. Clique em Iniciar Desmixing.
   NOTA: Alternativamente, utilize os espectros existentes para fluorocromes de 488 e 594 nm.
2. Abra o arquivo para o processamento da imagem e selecione a guia Processamento. Na seção Métodos, selecione Geométrico e Costura . Na seção Parâmetro, selecione a nova saída e marque a opção Azulejos de Fusíveis. Use o modo de referência com o canal selecionado correspondente à fluorescência das vias aéreas. Aplique a Costura clicando em Aplicar.

6. Processamento de imagem: renderização de superfície

1. Abra a imagem como uma exibição 3D de superação. Crie uma superfície das vias aéreas usando a opção Superfície para o canal que foi usado para a visualização das vias aéreas. Escolha o parâmetro Desválico de 10 μm.
   NOTA: Escolha também o valor do limiar automático.
2. Inspecione visualmente a superfície. Escolha os limiares para reduzir o sinal de saída. Remova as superfícies da pleura e vasos.
3. Crie uma máscara para a superfície das vias aéreas usando as opções Editar e Mascarar Tudo. Selecione o canal das vias aéreas e defina Voxels fora da superfície para 0,001.
4. Salve o arquivo com a máscara das vias aéreas como uma série TIFF para a pasta. Salve o arquivo com o canal conidia como uma série TIFF para a pasta separada.

7. Processamento de imagem: correção da máscara

1. Abra o arquivo com a máscara das vias aéreas em uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas¹⁷ como uma imagem de 8 bits. Torne a imagem binária clicando em Process | | binário Faça binário.
   NOTA: Se necessário, corrija a máscara: remova as superfícies excessivas usando a seleção do Polígono e exclua a guia Excluir. Alternativamente, utilize a Ferramenta de Enchimento de Inundação.
2. Desenhe as superfícies ausentes usando várias vezes Dilate (3D): clique em Plugins | | processos Dilatação (3D). Preencha os orifícios clicando em Process | | binário Preencher furos. Use a interpolação do gerenciador de seleção e roi para preencher os orifícios residuais na máscara manualmente. Aplique várias opções de Erode (3D) (Plugins | | processos Erosão (3D)) para reemplar a espessura da máscara.
   NOTA: Crie macros usando plugins | As opções de macros para várias repetições de Dilate (3D) e Erode (3D).
   Certifique-se de que o número de erode (3D) seja igual ao número de aplicações dilatados (3D).
3. Salve a máscara em uma nova pasta como uma série TIFF.

8. Análise quantitativa conidia

1. Abra o aplicativo na plataforma de programação e computação numérica: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
2. Pressione o botão Adicionar arquivos. Selecione a pasta da máscara das vias aéreas e a pasta conidia.
3. Estabeleça um limite personalizado entre 0 e 1. Pressione o botão OK.
4. Salve a tabela de saída para o arquivo .xls personalizado.
5. Analise os dados com software para análise estatística.

Resultados

Seguindo o protocolo acima, obteve-se a imagem 3D mostrando as vias aéreas e A. fumigatus conidia no lobo pulmonar de um rato (Figura 1A). Streptavidin (que foi usado para visualização de vias aéreas) rotulou brônquios e brônquios¹⁵. Além disso, os vasos de grande porte, que são facilmente distinguíveis das vias aéreas por sua morfologia, e pleura são visualizados no canal das vias aéreas(Figura 1A-C)...

Discussão

A imagem 3D de órgãos inteiros permite a obtenção dos dados sem dissecção da amostra, o que é de grande importância para investigar os aspectos espaciais da distribuição anatômica do patógeno no organismo. Existem várias técnicas e modificações de limpeza óptica tecidual que ajudam a superar a dispersão da luz laser e permitem imagens de órgãos inteiros^15,16,18,19. Uma das a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html