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要約

マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア(3μmの大きさ)の分布の定量分析方法について述べた。この方法は、様々な病理状態モデルにおける気道中の微粒子およびナノ粒子凝集分布の分析にも使用することができる。

要約

アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディアは、ヒトの気道に侵入することができる空中病原体である。アレルギーのない免疫管轄者は抵抗性および免疫学的耐性を示し、免疫不全患者では、コニディアは気道を植民地化し、重度の侵襲性呼吸器疾患を引き起こす可能性がある。異なる気道コンパートメント内の様々な細胞は、真菌の侵入を防ぐ免疫応答に関与しています。しかし、病原体の排除の時空間的な側面はまだ完全には理解されていません。光学的にクリアされた全実装器官、特に実験用マウスの肺の3次元(3D)画像化により、感染後の異なる時点で気道中の蛍光標識病原体を検出することができます。本研究では、気道における A.フミガトゥス コニジア分布の定量分析を行う実験セットアップについて説明する。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、マウスへの中咽頭適用から6時間後に気管支枝および肺胞コンパートメントにおける蛍光標識されたコニディアの位置を追跡した。ここで説明するアプローチは、免疫応答の異なる段階での病原体の正確な位置の検出および病原体相互作用細胞の同定に以前に使用された。実験のセットアップは、異なる病理条件における病原体の除去の運動を推定するために使用することができる。

概要

日常的に、人々は、気道1に浸透し得る日和見真菌アスペルギルス・フミガトゥス(A.フミガトゥス・コニディア)の胞子を含む空中病原体を吸入する。哺乳類の気道は、気道壁2、3、4の異なる構造によって特徴付けられる異なる世代の気道のシステムである。気管気管支壁は、粘液性クリアランス5を提供する毛状細胞である複数の細胞タイプから構成されている。肺胞では、毛様体細胞がなく、粘膜クリアランス6では浸透性肺胞空間病原体を排除できない。さらに、各気道生成は複数の免疫細胞集団のニッチであり、これらの集団のサブセットは特定の気道コンパートメントにとってユニークである。したがって、肺胞マクロファージは肺胞室に存在し、気管と伝導気道の両方が上皮内樹状細胞7,8と並んでいる。

A.フミガトゥスコニディアの概算サイズは2-3.5 μm9.ヒトやマウスでも小さな気道の直径が3.5μmを超えるため、ジニディアが歯槽空間2、10、11を貫通できることが示唆された。実際、組織学的検査は、アスペルギルス症12に罹患している患者の胞皮の真菌の成長を示した。コニディアは、厚い肺スライス13のライブイメージングを用いて感染したマウスの肺胞でも検出された。同時に、マウス14の気管支上皮の光側でコニディアが検出された。

光学的にクリアされた全マウントマウス肺の3次元(3D)画像化は、気道15の形態学的分析を可能にする。特に、内臓胸膜神経分布の定量分析は、光学的にクリアされたマウス肺検体15を用いて行った。最近、Amich et16 は、光学的にクリアされたマウス肺検体の光シート蛍光顕微鏡を用いて、免疫不全マウスへの鼻腔内の経鼻適用後の真菌増殖を調査した。感染後の異なる時点で気道中の静止したコニディアの正確な位置は、炎症の特定の段階で十分な抗真菌防御を提供することができる細胞集団を同定するために重要である。しかし、比較的小さいサイズのため、気道における A.フミガトゥス ・コニディア分布の時空間的側面は十分に特徴付けが悪い。

ここでは、感染したマウスの気道におけるA.フミガトゥスコニジア分布の定量分析のための実験セットアップを提示する。蛍光標識A.フミガトゥス・コニディアの中咽頭適用を受けたマウスの光学的にクリアされた肺の蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、3D画像を取得し、画像処理を行う。全体実装肺葉の3D画像化を用いて、我々は、コニディア塗布8の72時間後にマウスの導電気道におけるA.フミガトゥス・コニディアの分布を示した。

プロトコル

ここで説明する実験動物に関するすべての方法は、ロシア科学アカデミーシェミヤキン・オヴチンニコフ生物有機化学研究所(IACUC)の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル番号226/2017)。

1. フミガトゥス ・コニディアアプリケーション

  1. 蛍光標識 A.フミガトゥス ・コニディアを得るために、コニディアペレットに3%パラホルムアルデヒドの1mLを加えて5×108 コニディアを固定する。50 mL試験管で、室温でシェーカー上で2時間インキュベートします。
  2. 20 mLのリン酸緩衝塩水(PBS)でコニディアを洗浄する:15分間1,000 x gで遠心分離機を15分間、静かに取り出し、20 mLのボリュームで新鮮なPBSを加えます。繰り返す。
  3. 0.1 M NaHCO3の900 μLでコニディアを溶かします。
  4. 594 nm蛍光色素のコハニミジルエステルを100μLのジメチルスルホキシドで溶解し、コニディアに添加します。
  5. 室温で150rpmでシェーカー上で1時間、色素と共にコニディアをインキュベートします。
  6. 遠心分離機で20mLのPBSで2回、15分間1,000 x gでコニディアを洗浄します。
  7. PBSで1×108 コニディア/mLの濃度にコニディアを希釈し、4°Cで保存します。
  8. 0.5~3%のイオブルラン蒸気でマウスを麻酔します。マウスをホルダーに置き、滑らかな鉗子で舌を固定し、ナレスを保持します。単一のチャネルピペットを取り、マウス咽頭に50μLのコニディア懸濁液を塗布します。懸濁液が吸入されるまで待ちます。

2. 検体の準備

  1. 50 mL試験管を準備し、新鮮な2%パラホルムアルデヒドの15 mLでそれを充填します。70%エタノール溶液に医療器具(15cm歯解力、8cmの細かい先端鉗子、鈍い端を持つ10 cmのはさみ)を入れる。
  2. IACUCプロトコルに従ってマウスを安楽死させます。次に、マウスを後ろ位置に置き、針でマウスの足を固定します。
    注意:安楽死のために頸部脱臼を使用する場合は、気管の完全性を確保してください。
    1. 噴霧器を使用して70%エタノールでマウスを扱います。
    2. 後足から前足と顎に腹側皮膚の中央値縦方向のカットを行います。
    3. 歯付き鉗子と閉じたはさみを使用して皮下組織から皮膚を分離する。針で皮膚の上端を固定します。
    4. 腹壁に切開を行い、横隔膜から肝臓を分離します。慎重に閉じたはさみでダイヤフラムを選び、その後、横隔膜をカットします。
    5. 気管が見えるまで胸部と頸部の結合組織の内側カットを行います。
  3. 気管の下に絹糸を実行し、2つの鉗子を使用して外科結び目を作ります。
    注:シルク糸の代わりに歯科フロスを使用することもできます。
    1. 慎重に糸を引っ張り、はさみで結合組織から肺を切断します。はさみをテーブルに垂直に持ちなさい。
    2. 2%パラホルムアルデヒドで50mL試験管に肺を入れます。糸をチューブの外に置き、カバーをしっかりと入れ、チューブをひっくり返して肺をパラホルムアルデヒドで覆います。肺を4°Cで一晩保持する。
  4. 心臓から肺葉を解剖し、メスでお互いを解剖する。
    1. 肺ローブを24のウェルプレートに入れ、各ローブを別々の井戸に入れます。トリスバッファー状生理食糸生理食糸(TBS)pH 7.4の1mLで肺ローブを洗浄し、150 rpmでシェーカーでそれぞれ1時間5回洗浄します。
    2. 1 mLのTBSをブロッキングバッファーの1 mL(1%トリトンX 100、5%の粉ミルクはTBS)に置き換え、シェーカーの室温で一晩検体を残します。
    3. ブロッキングバッファーを1 mLのストレプトアビジン-488-nmフルオルクロムコンジュゲート希釈1:30 IN TBS.シェーカー(150 rpm)の室温で少なくとも72時間放置します。
  5. シェーカー(150rpm)で室温でTBSの1mLでそれぞれ1時間、試料を5回洗浄します。標本を新しい井戸に移し、4°Cで一晩2%パラホルムアルデヒドで覆い、後固定します。

3. マウス肺ローブ光学クリアリング

  1. 5mLのガラス瓶に50%のメタノール水溶液を充填した5mLのガラス瓶に試料を入れ、室温で1時間サンプルミキサーに置きます。
  2. 50%メタノールの3 mLを100%メタノールの3 mLに置き換え、2時間サンプルミキサーに置きます。ベンジルアルコールとベンジルベンゾエート(BABB)の1:2 v混合物を1mLの合計容量で調製します。
  3. 試料を24ウェルプレートに移し、1 mLのBABB混合物を少なくとも30分間覆います。長い時間のためにBABBに標本を残してはなりません;BABBはプラスチック板を損傷し、試料を硬くしすぎる可能性があります。
  4. 標本を細胞イメージングカバーグラス底チャンバーに入れます。サンプルはイメージングの準備ができています。

4. CLSMによるマウス肺葉イメージング

  1. 顕微鏡システムをオンにします。顕微鏡ソフトウェアを開きます。 [場所検索 ]タブで、トランスミッション ライトをオンにします。10x の目標を選択します。
    注: より詳細な分析を行う場合は、20x の目的を使用しますが、実験の時間とイメージ ファイルのサイズが長くなります。
  2. カバースライドホルダーに標本を入れてチャンバーを入れます。目的の上にXYステージにホルダーを置きます。目的の上にステージのXYコントロールを使用して標本を中心に配置します。透過光と接眼部を使用して、試料Z面を手動で見つけます。
  3. ソフトウェアを [取得 ]タブに切り替えます。 CLSM λ-モードを選択します。488 nm と 561 nm のレーザーをオンにします。488/561 nmの二色性ミラーを選択します。検出器のスペクトル範囲を490-695 nmに変更します。レーザーパワーを適切な範囲(10~50 μW)に調整します。750-900の範囲の間の 検出器の利得 を調節しなさい。
    注: ゲイン設定が高い方は、ノイズが原因で望ましくありません。
  4. 1 AUボタンをクリックして、1 Airyユニットにピンホールを狭くします。ピクセルの解像度を512 ピクセル× 512ピクセルに設定します。
  5. Z スタックモードをオンにします。ライブイメージングを開始します。両方の色素が表示される焦点面を選択します。
    注:必要に応じて、レーザーパワーを調整して、2つの蛍光色素の輝度を正規化します。クリッピングを回避し、蛍光強度を正確に一致させるために、 ギャラリー と シングルチャンネル モードを使用してください。
  6. 表示されたZ スタックペインを展開します。フォーカスホイールを使用して、サンプルの最も低い平面を見つけます。Z スタックペインの[最初] ボタンを使用します。焦点面を上方に移動して、試料の上の境界を見つけ、Lastボタンを使用して位置を保存します。Z スタックペインでサンプルの深さの表現を確認します。
    注: サンプルの深さの表現は、最初と最後の位置が選択された後、Z スタックペインに表示されます。
  7. Zスタックペインを見て、試料の底付近の焦点を合わせるホイールを使用して目標を配置します。これは標本の底からおよそ20μmである。
  8. Z スタック モードをオフにして 、タイル スキャン モードをオンにします。標本のサイズに適したタイル数で画像を取得します。5×5タイルは良い出発点です。
  9. タイルの数と、全体の肺がタイル画像の内側に収まるまで、標本のXY位置を調整します。サンプルの中心の新たに取得したXY位置で 、Zスタック 位置の正確性を再確認します。
  10. Z スタック と タイルスキャン の両方のモードをオンにします。Zステップ (Zスタック ペイン)を5μmに設定します。 スキャン速度 を 6 に設定します。 自動保存 機能をオンにします。[個別の タイルを保存する] オプションをオンにします。ファイルに名前を付けます。 [実験の開始 ] ボタンを押します。
  11. 実験が顕微鏡に割り当てられた時間を超えていないことを確認します。もしそうなら - 速度を調整します。
    注: ファイルサイズは 10 Gb を超えています。ハード ドライブに十分な空き容量があることを確認してください。

5. スペクトルのアンミックスとステッチ

  1. 初期画像処理にはソフトウェアを使用します。スペクトルをアンミックスする場合は、[ アンミックス ]オプションを選択します。ストレプトアビジン/気道とコニディアに対応する2つの領域を選択して、画像からスペクトルを取得します。[ ミックス解除を開始]をクリックします。
    注: または、488 および 594 nm のフルオロクロムの既存のスペクトルを使用します。
  2. 画像処理用のファイルを開き、[ 処理 ]タブを選択します。[ 方法] セクションで、[ 幾何学] と [ステッチ] を選択します。[ パラメータ]セクションで 、[ 新規出力 ]を選択し、[ タイルを融合 ]オプションにマークします。選択したチャネルをエアウェイ蛍光に対応する基準モードを使用します。[適用] をクリックしてステッチを 適用します。

6. 画像処理: サーフェス レンダリング

  1. イメージを [3D ビューを越える] ビューとして開きます。気道の視覚化に使用されたチャネルの オプション Surface を使用して、気道サーフェスを作成します。10 μm の スムージング パラメータを選択します。
    注: 自動しきい値も選択します。
  2. 表面を視覚的に検査します。信号を減らすしきい値を選択します。胸膜や容器の表面を取り除きます。
  3. [編集]オプションと [すべてマスク] オプションを使用して、気道サーフェスのマスクを作成します。気道チャネルを選択し、サーフェス外のボクセルを0.001 に設定します。
  4. このフォルダに、エアウェイ マスクを TIFF シリーズとして保存します。CONIDIA チャネルを持つファイルを TIFF シリーズとして別のフォルダに保存します。

7. 画像処理:マスク補正

  1. 8ビット画像として生物画像解析17 のためのオープンソースプラットフォームで気道マスクを使用してファイルを開きます。[プロセス] |クリックしてイメージをバイナリにする バイナリ|バイナリを作成します。
    注: 必要に応じてマスクを修正する: ポリゴン選択 と削除タブを使用して、過剰なサーフェスを 削除 します。または、 洪水フィル ツールを使用します。
  2. 数倍 の拡張(3D)を使用して不足しているサーフェスを描画する: [プラグイン] をクリック |プロセス|拡張(3D)[プロセス] |をクリックして穴を埋めます 。バイナリ|穴を埋める。選択と ROI マネージャ補間を 使用して、マスクの残差穴を手動で埋めます。いくつかの 侵食(3D)オプションを 適用する(プラグイン|プロセス|マスクの厚さをリサンプリングするには、侵食(3D)します。
    注: プラグイン |を使用してマクロを作成します。複数のディレート(3D)と侵食(3D)のマクロオプションが繰り返されます。
    3D(侵食)の数が、ディレート(3D)アプリケーションの数と同じであることを確認します。
  3. マスクを TIFF シリーズとして新しいフォルダに保存します。

8. コニディア定量分析

  1. プログラミングおよび数値コンピューティングプラットフォームでアプリを開きます: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter。
  2. [ ファイルの追加] ボタンを押します。気道マスクフォルダと conidia フォルダを選択します。
  3. カスタムしきい値を 0 ~ 1 の間で設定します。[OK]ボタンを押します。
  4. 出力テーブルをカスタム .xls ファイルに保存します。
  5. 統計分析のためにソフトウェアでデータを分析します。

結果

上記のプロトコルに従って、マウスの肺葉の気道およびA.フミガトゥス・コニディアを示す3D画像が得られた(図1A)。ストレプトアビジン(気道の可視化に使用された)は、気管支および気管支15とラベル付けされた。さらに、その形態によって気道と容易に区別できる大血管と、胸膜は気道チャネルで視覚化される(図1A-C)。

ディスカッション

全臓器3Dイメージングは、標本の解剖なしでデータを取得することを可能にし、これは、生物における病原体の解剖学的分布の空間的側面を調査する上で非常に重要である。レーザー光散乱を克服し、全臓器イメージング15、16、18、19を可能にする組織光学クリアリングのいくつかの技術と修正があります。

開示事項

著者らは、この研究に利益相反はないと報告している。

謝辞

著者らは、スヴェン・クラップマン教授(ドイツの大学病院エアランゲンとFUAエルランゲン・ニュルンベルク)が アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア株AfS150を提供してくれたことに感謝する。著者らはMIPTプレスオフィスに感謝します。V.Bロシア連邦の科学と高等教育省を認める(#075-00337-20-03、プロジェクトFSMG-2020-0003)。 A.フミガトゥス コニディアイメージングと定量に関する研究は、RSF No 19-75-00082によってサポートされました。気道のイメージ投射に関する仕事はRFBR No 20-04-60311によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcoholPanreac141081.161198.0-100 %
Benzyl benzoateAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 micePushchino Animal Breeding Centre (Russia)Male. 12 - 30 week old.
CatheterVenisystemsG715-A0118G
Cell imaging coverglass-bottom chamberEppendorf307420284 or 8 well chamber with coverglass bottom
CentrifugeEppendorf5804RAny centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscopeZEISSZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich276855≥99.9%
FIJI image processing packageFIJIFree software
ForcepB. Braun AesculapBD557RToothed
ForcepB. Braun AesculapBD321RFine-tipped
ForcepBochem1727Smooth
Glass bottleDURAN242101304With ground-in lid
Graphic Editor PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford InstrumentsFree trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObjectiveZEISS420640-9800-000 Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
PipetteProLine7220205 to 50 μL
Powdered milkRothT145.2
Sample mixerDynalMXIC1
ScissorsB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
Silk threadB. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisherS11223
Test tubeSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)HeliconH-1702-0.5 Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN microscope softwareZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

参考文献

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