Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Riepilogo

Descriviamo il metodo per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l'analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia sono agenti patogeni presenti nell'aria che possono penetrare nelle vie aeree umane. Le persone immunocompetenti senza allergie mostrano resistenza e tolleranza immunologica, mentre nei pazienti immunocompromessi, i conidi possono colonizzare le vie aeree e causare gravi disturbi respiratori invasivi. Varie cellule in diversi compartimenti delle vie aeree sono coinvolte nella risposta immunitaria che previene l'invasione fungina; tuttavia, gli aspetti spazio-temporali dell'eliminazione dei patogeni non sono ancora completamente compresi. L'imaging tridimensionale (3D) di organi a montaggio intero otticamente cancellati, in particolare i polmoni di topi sperimentali, consente il rilevamento di agenti patogeni etichettati fluorescentmente nelle vie aeree in diversi punti temporali dopo l'infezione. Nel presente studio, descriviamo una configurazione sperimentale per eseguire un'analisi quantitativa della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree. Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale fluorescente (CLSM), abbiamo tracciato la posizione dei conidi etichettati fluorescentemente nei rami bronchiali e nel compartimento alveolare 6 ore dopo l'applicazione orofaringea ai topi. L'approccio qui descritto è stato precedentemente utilizzato per il rilevamento della posizione precisa del patogeno e l'identificazione delle cellule che interagiscono con i patogeni in diverse fasi della risposta immunitaria. La configurazione sperimentale può essere utilizzata per stimare la cinetica dell'eliminazione del patogeno in diverse condizioni patologiche.

Introduzione

Su base giornaliera, le persone inalano agenti patogeni presenti nell'aria, comprese le spore di funghi opportunistici Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) che possono penetrare nel tratto respiratorio¹. Il tratto respiratorio dei mammiferi è un sistema di vie aeree di diverse generazioni che sono caratterizzate dalle diverse strutture delle pareti delle vie aeree^2,3,4. Le pareti tracheobronchiali sono costituite da diversi tipi di cellule tra cui cellule ciliate che forniscono la clearance mucociliare⁵. Negli alveoli non ci sono cellule ciliate e i patogeni penetranti dello spazio alveolare non possono essere eliminati dalla clearance mucociliare⁶. Inoltre, ogni generazione di vie aeree è una nicchia per più popolazioni di cellule immunitarie e sottoinsiemi di queste popolazioni sono unici per alcuni compartimenti delle vie aeree. Pertanto, i macrofagi alveolari risiedono nei compartimenti alveolari, mentre sia la trachea che le vie aeree conduttrici sono rivestite con le cellule dendritiche intraepiteliali^7,8.

La dimensione approssimativa di A. fumigatus conidia è 2-3,5 μm⁹. Poiché il diametro delle piccole vie aeree nell'uomo e anche nei topi supera i 3,5 μm, è stato suggerito che i conidi possano penetrare nello spazio alveolare^2,10,11. Infatti, l'esame istologico ha mostrato la crescita fungina negli alveoli dei pazienti affetti da aspergillosi¹². I conidi sono stati rilevati anche negli alveoli di topi infetti utilizzando l'imaging dal vivo delle spesse fette polmonari¹³. Allo stesso tempo, i conidi sono stati rilevati nel lato luminale dell'epitelio bronchiale dei topi¹⁴.

L'imaging tridimensionale (3D) dei polmoni di topo a montaggio intero otticamente cancellati consente l'analisi morfometrica delle vie aeree¹⁵. In particolare, l'analisi quantitativa della distribuzione del nervo pleurico viscerale è stata eseguita utilizzando campioni polmonari di topo otticamente cancellati¹⁵. Recentemente, Amich et al.¹⁶ hanno studiato la crescita fungina dopo l'applicazione intranasale di conidi ai topi immunocompromessi utilizzando una microscopia a fluorescenza a foglio di luce di campioni polmonari di topo otticamente cancellati. La posizione precisa dei conidi a riposo nelle vie aeree in diversi punti temporali dopo l'infezione è importante per identificare le popolazioni cellulari che possono fornire una sufficiente difesa antifungina in alcune fasi dell'infiammazione. Tuttavia, a causa delle dimensioni relativamente piccole, gli aspetti spazio-temporali della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree sono scarsamente caratterizzati.

Qui, presentiamo una configurazione sperimentale per l'analisi quantitativa della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree di topi infetti. Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale fluorescente (CLSM) di polmoni otticamente cancellati di topi che hanno ricevuto un'applicazione orofaringea del conidia fluorescente etichettato A. fumigatus, otteniamo immagini 3D ed eseguiamo l'elaborazione delle immagini. Utilizzando l'imaging 3D del lobo polmonare a monte intero, abbiamo precedentemente mostrato la distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree condutture dei topi 72 ore dopo l'applicazione della conidia⁸.

Protocollo

Tutti i metodi riguardanti gli animali da laboratorio qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Istituto di chimica bioorganica Shemyakin e Ovchinnikov, Accademia russa delle scienze (numero di protocollo 226/2017).

1. Applicazione di A. fumigatus conidia

1. Per ottenere conidia etichettata fluorescentemente A. fumigatus, fissare 5 ×^{10 8} conidi aggiungendo 1 mL di paraformaldeide al 3% al pellet di conidi. Incubare in una provetta da 50 ml per 2 ore su uno shaker a temperatura ambiente.
2. Lavare i conidi con 20 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS): centrifugare a 1.000 x g per 15 minuti, rimuovere delicatamente il surnatante e aggiungere PBS fresco in un volume di 20 ml. Ripetere.
3. Sciogliere i conidi in 900 μL di 0,1 M NaHCO₃.
4. Sciogliere l'estere succinimidile del colorante fluorescente da 594 nm in 100 μL di dimetilsolfossido e aggiungere ai conidi.
5. Incubare i conidi con il colorante per 1 ora su uno shaker a 150 giri / min a temperatura ambiente.
6. Lavare i conidi due volte con 20 ml di PBS nella centrifuga a 1.000 x g per 15 min.
7. Diluire i conidi ad una concentrazione di 1 × 10⁸ conidi/mL in PBS e conservare a 4 °C.
8. Anestetizzare il mouse con vapore isoflurano allo 0,5-3%. Metti il mouse sul supporto, fissa la lingua con una pinna liscia e tieni le narici. Prendere una pipetta a canale singolo e applicare 50 μL di sospensione di conidi alla faringe del topo. Attendere fino a quando la sospensione non viene inalata.

2. Preparazione del campione

1. Preparare la provetta da 50 mL e riempirla con 15 mL di paraformaldeide fresca al 2%. Posizionare gli strumenti medici (pinza di dissezione dentata di 15 cm, pinza a punta fine da 8 cm e forbici da 10 cm con estremità smussate) in una soluzione di etanolo al 70%.
2. Eutanasia del mouse secondo il protocollo IACUC. Quindi posizionare il mouse in posizione dorsale e fissare le zampe del topo con gli aghi.
   NOTA: Se si utilizza la lussazione cervicale per l'eutanasia, assicurarsi dell'integrità della trachea.
   1. Trattare il topo con etanolo al 70% usando uno spruzzatore.
   2. Fai un taglio longitudinale mediano nella pelle ventrale dalle zampe posteriori alle zampe anteriori e al mento.
   3. Separare la pelle dal tessuto sottocutaneo usando pinza dentata e forbici chiuse. Fissare le estremità superiori della pelle con aghi.
   4. Fai un'incisione nella parete addominale e separa il fegato dal diaframma. Scegli con attenzione il diaframma con le forbici chiuse e poi taglia il diaframma.
   5. Effettuare un taglio mediale dei tessuti connettivi del torace e del collo fino a quando la trachea è visibile.
3. Esegui un filo di seta sotto la trachea e fai un nodo chirurgico usando due pinci.
   NOTA: in alternativa, utilizzare il filo interdentale al posto del filo di seta.
   1. Tirare con attenzione il filo e tagliare i polmoni dal tessuto connettivo con le forbici. Tenere le forbici perpendicolari al tavolo.
   2. Metti i polmoni nella provetta da 50 ml con il 2% di paraformaldeide. Lasciare le estremità del filo fuori dal tubo, mettere il coperchio stretto e girare il tubo per coprire i polmoni con paraformaldeide. Tenere i polmoni durante la notte a 4 °C.
4. Seziona i lobi polmonari dal cuore e l'un l'altro con un bisturi.
   1. Metti i lobi polmonari in una piastra a 24 pozzetti, con ogni lobo in un pozzo separato. Lavare i lobi polmonari in 1 mL di pH 7,4 di soluzione salina tamponata tris (TBS), 5 volte per 1 ora ciascuno su uno shaker a 150 giri / min.
   2. Sostituire 1 mL di TBS con 1 mL del tampone di bloccaggio (1% Triton X 100, 5% latte in polvere in TBS) e lasciare il campione durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker.
   3. Sostituire il tampone di blocco con 1 mL di streptavitina-488- nm coniugato di fluorcromo diluito 1:30 in TBS. Lasciare il campione per almeno 72 ore a temperatura ambiente su uno shaker (150 giri/min).
5. Lavare il campione 5 volte per 1 ora ciascuno in 1 mL di TBS a temperatura ambiente su uno shaker (150 rpm). Trasferire il campione nei nuovi pozzi e coprirlo con il 2% di paraformaldeide durante la notte a 4 °C per la post-fissazione.

3. Clearing ottico del lobo polmonare del topo

1. Posizionare il campione nella bottiglia di vetro da 5 ml riempita con 3 ml di soluzione di metanolo-acqua al 50% e metterlo sul miscelatore del campione a temperatura ambiente per 1 ora.
2. Sostituire 3 ml di metanolo al 50% con 3 ml di metanolo al 100% e metterlo sul mixer del campione per 2 ore. Preparare una miscela 1:2 v/v di alcool benzilico e benzil benzoato (BABB) in un volume totale di 1 mL.
3. Trasferire il campione in una piastra a 24 pozzetti e coprire con 1 mL di miscela BABB per almeno 30 minuti. Non lasciare il campione in BABB per lungo tempo; BABB può danneggiare la piastra di plastica e rendere il campione troppo rigido.
4. Inserire il campione nella camera di copertura dell'imaging cellulare. Il campione è pronto per l'imaging.

4. Imaging del lobo polmonare del topo con CLSM

1. Accendere il sistema del microscopio. Aprire il software del microscopio. Accendere la spia di trasmissione nella scheda Individua. Selezionare l'obiettivo 10x.
   NOTA: per un'analisi più dettagliata, utilizzare l'obiettivo 20x, ma aumenta il tempo dell'esperimento e le dimensioni del file immagine.
2. Mettere la camera con il campione nel supporto della slitta di copertura. Metti il supporto sul palco XY sopra l'obiettivo. Centra il campione usando i controlli XY dello stage sopra l'obiettivo. Utilizzare la luce di trasmissione e l'oculare per trovare manualmente il campione Z-plane.
3. Passare il software alla scheda Acquisizione. Selezionare CLSM λ-mode. Accendere i laser a 488 nm e 561 nm. Selezionare lo specchio dicroico 488/561 nm. Modificare l'intervallo spettrale del rivelatore a 490-695 nm. Regolare la potenza del laser nell'intervallo appropriato (10-50 μW). Regolare il guadagno del rilevatore tra 750-900.
   NOTA: impostazioni di guadagno più elevate sono indesiderabili a causa del rumore.
4. Restringere il foro stenopeico a 1 unità Airy facendo clic sul pulsante 1 AU. Imposta la risoluzione dei pixel su 512 × 512 pixel.
5. Attivare la modalità Z-stack. Avvia Live Imaging. Selezionare il piano focale in cui sono visibili entrambi i coloranti.
   NOTA: Se necessario, regolare la potenza del laser per normalizzare la luminosità dei due coloranti fluorescenti. Utilizzare la modalità Galleria e a canale singolo, per evitare il ritaglio e per abbinare con precisione l'intensità di fluorescenza.
6. Espandere il riquadro Z-stack visualizzato. Utilizzare la rotellina di messa a fuoco e trovare il piano più basso del campione. Utilizzare il primo pulsante nel riquadro Z-stack. Spostate il piano focale verso l'alto per trovare il limite superiore del campione e salvate la posizione utilizzando il pulsante Ultimo (Last). Controllare la rappresentazione della profondità del campione nel riquadro Z-stack.
   NOTA: dopo aver scelto la prima e l'ultima posizione, verrà visualizzata una rappresentazione della profondità del campione nel riquadro Z-stack.
7. Posizionate l'obiettivo utilizzando la ruota di messa a fuoco vicino alla parte inferiore del campione, osservando il pannello Z-stack. Questo è di circa 20 μm dal fondo del campione.
8. Disattiva la modalità Z-stack e attiva la modalità Scansione riquadri. Acquisire l'immagine con un numero appropriato di tessere per le dimensioni del campione. 5 × 5 piastrelle sono un buon punto di partenza.
9. Regolare il numero di tessere e la posizione XY del campione fino a quando l'intero polmone non si adatta all'interno dell'immagine affiancata. Ricontrollare la correttezza delle posizioni Z-stack con la posizione XY appena ottenuta del centro del campione.
10. Attiva entrambe le modalità Z-stack e Tile Scan. Impostare il passo Z (nel pannello Z-stack) su 5 μm. Impostare Velocità di scansione su 6. Attivare la funzione di salvataggio automatico. Attiva l'opzione Salvataggio di riquadri separati. Assegna un nome al file. Premi il pulsante Avvia esperimento.
11. Verificare che l'esperimento non superi il tempo assegnato al microscopio; in tal caso, regolare la velocità.
    NOTA: la dimensione approssimativa del file è superiore a 10 Gb; assicurarsi che ci sia abbastanza spazio sul disco rigido.

5. Unmixing spettrale e cuciture

1. Utilizzare il software per l'elaborazione iniziale delle immagini. Per la unmixing spettrale, selezionare l'opzione Unmixing. Selezionare due regioni corrispondenti alla streptavitina/vie aeree e ai conidi per acquisire gli spettri dall'immagine. Fare clic su Avvia unmixing.
   NOTA: in alternativa, utilizzare gli spettri esistenti per i fluorocromi a 488 e 594 nm.
2. Aprire il file per l'elaborazione delle immagini e selezionare la scheda Elaborazione. Nella sezione Metodi selezionare Geometrico e Cucitura. Nella sezione Parametro, selezionate Nuova uscita (New Output) e contrassegnate l'opzione Fusibili riquadri (Fuse Tiles). Utilizzare la modalità di riferimento con il canale selezionato corrispondente alla fluorescenza delle vie aeree. Applicare la cucitura facendo clic su Applica.

6. Elaborazione delle immagini: rendering della superficie

1. Aprite l'immagine come vista 3D Surpass. Create una superficie delle vie aeree utilizzando l'opzione Superficie per il canale utilizzato per la visualizzazione delle vie aeree. Scegliete il parametro Smoothing di 10 μm.
   NOTA: scegliere anche il valore di soglia automatica.
2. Ispezionare visivamente la superficie. Scegli le soglie per ridurre il segnale di fuoriuscita. Rimuovere le superfici della pleura e dei vasi.
3. Create una maschera per la superficie delle vie aeree utilizzando le opzioni Modifica (Edit) e Maschera tutto (Mask All). Selezionate il canale delle vie aeree e impostate Voxel all'esterno della superficie su 0,001.
4. Salvare il file con la maschera delle vie aeree come serie TIFF nella cartella. Salvare il file con il canale conidia come serie TIFF nella cartella separata.

7. Elaborazione delle immagini: correzione della maschera

1. Aprire il file con la maschera delle vie aeree in una piattaforma open source per l'analisi di immagini biologiche¹⁷ come immagine a 8 bit. Rendere l'immagine binaria facendo clic su Elabora | | binario Crea binario.
   NOTA: se necessario, correggere la maschera: rimuovete le superfici eccessive utilizzando la selezione poligono e la scheda Elimina. In alternativa, utilizzate lo strumento Riempimento inondazione.
2. Disegna le superfici mancanti usando più volte Dilate (3D): fai clic su Plugin | | di processo Dilatare (3D). Riempite i fori facendo clic su Elabora (Process |) | binario Riempi fori. Utilizzate la selezione e l'interpolazione del ROI Manager per riempire manualmente i fori residui nella maschera. Applica diverse opzioni Erode (3D) (Plugin | | di processo Erode (3D)) per ricampionare lo spessore della maschera.
   NOTA: creare macro utilizzando Plugins | Opzioni Macro per più ripetizioni dilatazione (3D) ed Erode (3D).
   Assicurarsi che il numero di Applicazioni Erode (3D) sia uguale al numero di applicazioni Dilate (3D).
3. Salvare la maschera in una nuova cartella come serie TIFF.

8. Analisi quantitativa Conidia

1. Apri l'app nella piattaforma di programmazione e calcolo numerico: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
2. Premere il pulsante Aggiungi file. Selezionare la cartella della maschera delle vie aeree e la cartella conidia.
3. Impostare una soglia personalizzata compresa tra 0 e 1. Premere il pulsante OK.
4. Salvare la tabella di output nel file di .xls personalizzato.
5. Analizza i dati con software per l'analisi statistica.

Risultati

Seguendo il protocollo di cui sopra, è stata ottenuta l'immagine 3D che mostra le vie aeree e A. fumigatus conidia nel lobo polmonare di un topo (Figura 1A). Streptavicina (che è stata utilizzata per la visualizzazione delle vie aeree) etichettato bronchi e bronchioli¹⁵. Inoltre, i grandi vasi, che sono facilmente distinguibili dalle vie aeree per la loro morfologia, e la pleura sono visualizzati nel canale delle vie aeree (Figura 1A

Discussione

L'imaging 3D dell'intero organo consente di ottenere i dati senza dissezione del campione, che è di grande importanza per indagare gli aspetti spaziali della distribuzione anatomica del patogeno nell'organismo. Esistono diverse tecniche e modifiche della compensazione ottica tissutale che aiutano a superare la diffusione della luce laser e consentono l'imaging di organi interi^15,16,18,19. Uno ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html