إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية

Summary

تم إنشاء نظام ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد سابقة طويلة الأجل من خلايا الكبد الماوس. يمكن تمرير هذه organoids والتلاعب بها وراثيا عن طريق عدوى الفيروس العدسي من بناء shRNA / خارج الرحم ، انتقال الحمض النووي الريبي والهندسة CRISPR-Cas9.

Abstract

الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. وهو يلعب دورا هاما في تخزين الجلوكوز، إفراز البروتين، والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. كمنفذ لمعظم وظائف الكبد، خلايا الكبد الأولية لديها قدرة محدودة على الانتشار. وهذا يتطلب إنشاء نماذج التوسع في خلايا الكبد في الجسم الحي السابق للبحوث الفسيولوجية والمرضية الكبد. هنا، قمنا بعزل خلايا الكبد المورين بخطوتين من التشوش الكولاجيني وأنشأنا ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد ك "الكبد المصغر" لتلخيص التفاعلات بين الخلايا الخلوية والوظائف الفيزيائية. تتكون الأجهزة العضوية من مجموعات خلايا غير متجانسة بما في ذلك السلف والخلايا الكبدية الناضجة. نحن نقدم هذه العملية بالتفصيل لعزل وثقافة خلايا الكبد مورين أو خلايا الكبد الجنينية لتشكيل organoids في غضون 2-3 أسابيع وتبين كيفية تمريرها عن طريق الأنابيب ميكانيكيا صعودا وهبوطا. وبالإضافة إلى ذلك، سوف نقدم أيضا كيفية هضم organoids في خلايا واحدة لعدوى الفيروس العدسي من shRNA / البناء خارج الرحم، سيرنا transfection و CRISPR-Cas9 الهندسة. يمكن استخدام الأجهزة العضوية لشاشات الأدوية ونمذجة الأمراض وأبحاث الكبد الأساسية من خلال نمذجة بيولوجيا الكبد وعلم الأحياء المرضية.

Introduction

الأجهزة العضوية هي ذاتية التنظيم وثلاثية الأبعاد (3D) في مجموعات المختبر التي تشمل الخلايا الجذعية ذاتية التجديد والخلايا المتباينة متعددة ^{النسب1,2}. تم إنشاء الأعضاء العضوية للعديد من الأعضاء إما من خلايا جذعية متعددة القدرات أو بالغة من خلال عوامل متخصصة محددة جيدا بما في ذلك الأمعاء والدماغ والقولون والكلى والكبد والبنكرياس والغدة الدرقية والمعدة والجلد ^{والرئة3،4،5،6،7} . تقوم الأجهزة العضوية بتلخيص وظائف الخلايا الفيزيائية عن طريق محاكاة التطور (الناشئ عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، PSCs) أو تطور التوازن / التجديد (نشأت من الخلايا الجذعية البالغة ، ASCs) ، مما يفتح آفاقا جديدة في أبحاث الأمراض والعلاج ^8،9.

كأكبر عضو في الثدييات ، فإن الكبد مسؤول بشكل رئيسي عن التخزين والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. نوعين من أنواع الخلايا الظهارية، خلايا الكبد وcholeangiocytes، وبناء الوحدة الأساسية لفصيص الكبد. خلايا الكبد هي المسؤولة عن 70-80٪ من وظائف ^الكبد10. على الرغم من أن الكبد لديه قدرة تجديد ملحوظة ، إلا أن الخسارة السريعة لميزات الخلايا الكبدية تحدث أثناء زراعة أحادية الطبقة التقليدية عن طريق استقطاب الخلايا غير التنظيمية والتمايز ، مما يزيد من حاجة الباحثين والأطباء لبناء نماذج الكبد "لسد الفجوة" في الطبق. ومع ذلك ، حتى وقت قريب لم تكن نماذج توسع الجسم الحي السابق من خلايا الكبد الأولية راسخة ^{11،12،13،14،15}. يمكن إنشاء أعضاء الكبد من الخلايا الجذعية الجنينية / المستحثة متعددة القدرات ، وتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تشبه خلايا الكبد ، والخلايا المشتقة من الأنسجة. تطوير organoids الكبد يعزز تطبيق نموذج في المختبر لشاشات المخدرات وسمية الكبد ^{المقايسات16,17}.

هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لإنشاء organoids الكبد من خلايا الكبد مورين الأولية. باستخدام هذا البروتوكول، وضعنا نظام ثقافة في المختبر من organoids الكبدية مع اثنين من perfusions من الكولاجيناز. يمكن تمرير هذه الأجهزة العضوية للتوسع على المدى الطويل لعدة أشهر. وظيفتها الفسيولوجية تتفق إلى حد كبير مع خلايا الكبد. علاوة على ذلك، نقدم أيضا وصفا مفصلا لكيفية إجراء التلاعب الجيني، مثل عدوى الفيروس العدسي، ونقل سيرنا، والهندسة CRISPR-Cas9 باستخدام الأجهزة العضوية. انتشار الخلايا الكبدية organoids تسليط الضوء على إمكانية استخدام organoids لفهم بيولوجيا الكبد وتطوير نهج الطب الشخصية والترجمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية العلوم الطبية الاساسية بجامعة شاندونغ على جميع تجارب الفئران وتم تنفيذها وفقا للترخيص بموجب الخطوط العامة واللوائح الداخلية ( رقم 1000 / . ECSBMSSDU2019-2-079).

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بشكل رئيسي لزراعة الأجهزة العضوية ثلاثية الأبعاد من خلايا الكبد الأولية المعزولة.

1. إنشاء مورين هيباتوسيت الثقافة Organoid

ملاحظة: يتم استخدام مصفوفة خارج الخلية مثل Matrigel أو BME كمصفوفة الطابق السفلي لزراعة organoids. تخزين مصفوفة خارج الخلية في -20 درجة مئوية وقبل ذوبانه في 4 درجة مئوية أو على الجليد. الحفاظ على مصفوفة خارج الخلية على الجليد خلال التجارب. وسيلة الغسيل هي DMEM/F12 المتقدمة تكملها غلوتاماكس، HEPES والبنسلين / ستريبتوميسين. تستخدم حاضنة قياسية (37 درجة مئوية، جو رطب، 5_{٪ ثاني أكسيد} الكربون) في زراعة الأعضاء العضوية.

1. إعداد المواد
   1. إعداد الأدوات اللازمة للتجربة: وسادة الماوس، والأدوات الجراحية العقيمة مثل ملاقط، مقص، أنابيب، ومضخة مع معدل تدفق 2-10 مل / دقيقة.
   2. إعداد الكواشف بما في ذلك العازلة النتوعة، وحاجز الهضم وجعلها عقيمة لعزل خلايا الكبد. أضف الكولاجيناز من النوع الرابع الطازج (0.10 ملغم/مل) _وCaCl2 (0.50 م) ودفئ العازلة مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
   3. إعداد المتوسطة المشروطة لإنتاج R-spondin 1 وجميع المخزونات الكيميائية وعامل النمو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تجنب تجميد و إذابة المتوسطة الشرطية و الأسهم بشكل متكرر. إعداد الثقافة متوسطة طازجة واستخدامها في غضون شهر واحد. هذا أمر بالغ الأهمية لكفاءة تشكيل الجهازية.
2. عزل خلايا الكبد مورين عن طريق تغلغل الكبد والهضم
   ملاحظة: تم استخدام الفئران الذكور أو الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا و 6 أشهر لثقافة الجهازية. لم يتم العثور على اختلافات واضحة في كفاءة تكوين الجهازية من عمر الماوس المانحة داخل هذا النطاق.
   1. قتل الفأر باستخدام طريقة معتمدة أخلاقيا.
   2. إصلاح الماوس على وسادة الماوس وتنظيف فرو البطن والجلد مع الكحول 70٪. كشف البطن ورفع الكبد فوق بقية الجسم. إجراء شق خط الوسط لفضح الكبد.
   3. ملء أنبوب تعلق على المضخة مع المخزن المؤقت perfusion. إجراء شق الوريد المدخل (حوالي 1/3 من قطر الوريد) ووضع بعناية القسطرة في ذلك. رفع الجهاز الهضمي للمساعدة في إدراج القنية. التعادل مع الخط الجراحي اختياري لتجنب الانزلاق والتمزق.
   4. بدء تشغيل المضخة وأداء التخبط بمعدل تدفق 5-7 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت perfusion. إذا أصبح الكبد شاحبا على الفور ، فقطع الوريد الأجوف السفلي للسماح للحاجز التغلغلي بالتدفق عبر الكبد بأكمله ودفع الدم إلى الخارج.
   5. عندما يصبح التدفق نظيفا ، قم بإزالة القنية. يستغرق حوالي 5-10 دقائق.
   6. تغيير المخزن المؤقت perfusion مع المخزن المؤقت الهضم قبل تسخينها بمعدل 5 مل / دقيقة. لا توقف المضخة حتى يصبح الكبد لينة وتضخم. إزالة القسطرة عندما يتوقف الكبد تورم.
      ملاحظة: من المهم جدا الحفاظ على وقت الهضم المناسب لتجنب الهضم المفرط والحصول على خلايا الكبد واحدة.
   7. قطع الكبد ووضعه في لوحة 100 ملم مليئة 15 مل من المتوسط غسل الباردة. قطع الأربطة بمقص صغير. تمزق الكبد إلى قطع مع نصائح ماصة أو ملقط.
   8. ماصة صعودا وهبوطا بلطف للافراج عن الخلايا حتى يتم تشبع العازلة مع الخلايا (12-15 مرات). صب تعليق الخلية في أنبوب 50 مل من خلال مرشحات 70 ميكرومتر.
   9. جهاز طرد مركزي لمدة 1-3 دقائق عند 50 × ز و 4 درجات مئوية. (ديكانت) العملاق. اختياريا، إعادة إنفاق الخلايا مع غسل المتوسطة أو إعادة إنفاق الخلايا مع ثقافة المتوسطة مباشرة. عد الخلايا مع مقياس الخلايا.
   10. تمييز الخلايا الحية أو الميتة بواسطة آلة عداد الخلية بعد تلطيخ صبغة الخلية الحية.
       ملاحظة: فمن الأفضل لتنقية خلايا الكبد باستخدام البرد 40٪ Percoll. بعد هذه الخطوة، ستكون خلايا الكبد القابلة للحياة في الجزء السفلي من الأنابيب.
3. الثقافة العضوية والمرور
   1. إزالة supernatant وإعادة إنفاق خلايا الكبد مع خليط من مصفوفة خارج الخلية والثقافة المتوسطة في نسبة 3:1.
      ملاحظة: يوصى ب 10,000-20,000 خلية في خليط 50-60 ميكرولتر لكل بئر للوحة من 24 بئرا. من المهم العمل بسرعة والحفاظ على الخليط على الجليد طوال العملية. 200-500 يمكن تشكيل الأجهزة العضوية في هذا التركيز.
   2. إضافة الخلية / الخليط قطرة على لوحة مع قطرات صغيرة لمنع القطيرات من الاتصال معا. احتضان لوحة في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية، 5٪ _CO2 لمدة 5-10 دقيقة ومن ثم تأخذ لوحة من 20-25 دقيقة حتى تصبح المصفوفة خارج الخلية الصلبة.
   3. إضافة ثقافة المتوسطة (500 ميكرولتر لكل بئر للوحة 24 جيدا) في الآبار والعودة لوحة إلى حاضنة لثقافة organoid. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام. مراقبة organoids حتى تكون كبيرة بما يكفي لتمريرها.
      ملاحظة: قطر حوالي 400-500 ميكرومتر مناسب لمرور الخلايا الكبدية العضوية.
   4. عزل organoids من مصفوفة خارج الخلية مع عملية مفصلة أدناه. عقد ماصة باستور الزجاج في لهب لتضييق فتحة العدسة (من قبل ~ 1/2). ماصة ميكانيكيا صعودا وهبوطا 5-10 مرات لتفكيك organoids إلى الأعضاء أصغر أثناء passaging.
      ملاحظة: أثناء passaging، وإعداد نصائح micropipette غسلها مسبقا وأنابيب مع تلميح غسل العازلة لتجنب فقدان organoids الشائكة إلى أنابيب أو نصائح.

2. التلاعب الجيني من organoids الخلايا الكبدية مورين

1. خلايا واحدة من الخلايا الكبدية العضوية
   1. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد متوسط / الخلية الانتعاش لكل بئر. ماصة صعودا وهبوطا لتدمير خليط مصفوفة الخلية / خارج الخلية مع micropipette ومن ثم نقل تعليق organoid إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل على الجليد. اختياريا، بدوره أنبوب صعودا وهبوطا من وقت لآخر لإذابة الخليط جيدا.
   2. جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500-800 × ز و 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. إضافة 1 مل من محلول تريبسين إلى بيليه وماصة لخلط. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة ثم وقف الهضم عن طريق إضافة حجم 2X من المتوسط غسل.
   3. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 800 × ز و 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. Resuspend بيليه مع ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
2. سيرنا أو plasmid العدوى
   ملاحظة: يتم تحويل الأعضاء الأصغر التي يقل قطرها عن 50 ميكرومتر أو خلايا واحدة من الأجهزة العضوية الكبدية مع سيرنا باستخدام ليبفيكتامين أو بلازميدات باستخدام كاشف العدوى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. مزيج سيرنا أو البلازميدات مع كاشف العدوى. إضافة خلايا واحدة من الأجهزة العضوية وخليط Lipofectamine-RNA/Lipo-plasmid (على سبيل المثال، RNAiMAX) إلى 1-2 آبار في لوحة 24 جيدا وجهاز الطرد المركزي لمدة 1 ساعة في 500 × ز و 32 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، احتضان لوحة في الحاضنة لمدة 4-5 ساعة في 37 درجة مئوية.
   2. جمع الخلايا والبذور في مصفوفة خارج الخلية مع متوسطة الثقافة بتركيز 10،000 خلية لكل بئر. تغيير الوسط إلى شرط التحديد بعد يومين من العدوى. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.
3. عدوى لينتيفيرال
   ملاحظة: تصاب الأعضاء الصغيرة التي يقل قطرها عن 50 ميكرومتر أو خلايا واحدة من الأجهزة العضوية الكبدية بفيروس العدس باستخدام كاشفات العدوى المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. مزيج 250 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة من organoid و 250 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية في أنبوب 1.5 مل.
   2. صفيح الخليط والطرد المركزي لمدة ساعة واحدة عند 500 × جم و32 درجة مئوية. حضانة لمدة 4-5 ساعة في 37 درجة مئوية.
   3. جمع الخلايا والبذور في مصفوفة خارج الخلية مع ثقافة المتوسطة. تغيير الوسط إلى شرط التحديد بعد يومين من العدوى. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.
4. الهندسة الوراثية بواسطة CRISPR/Cas9
   ملاحظة: نحن نقدم الفيديو لهذا الأداء في المواد التكميلية. أصيبت خلايا واحدة من الأجهزة العضوية بفيروس العدسي أو مصابة بplasmids تحمل sgRNA و Cas9.
   1. هضم خلايا واحدة من organoids الكبدي المستزرعة والمرور وفقا للطريقة المذكورة أعلاه.
   2. تصيب خلايا واحدة مع sgRNA باستخدام Opti-MEM المتوسطة وشفوات العدوى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. اخلط 250 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة و250 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية معا في أنبوب 1.5 مل.
   4. طارد مركزي خليط 500 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة عند 500 × ز و 32 درجة مئوية ثم يحتضن لمدة 4-5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   5. جمع تعليق الخلية والبذور في مصفوفة خارج الخلية. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الأجهزة الكبدية من أنثى Alb-Cre; وقد لوحظ فأر Rosa26-GFP (8 أسابيع) بعد خمسة أيام من البذر (الشكل 1A). وتنتشر الأجهزة العضوية مع تلطيخ إيجابي Ki67 (الشكل 1B). التدخل في التعبير عن الجينات التمثيلية في organoids خلايا الكبد إما عن طريق العدوى سيرنا أو عدوى الفيروس العدسي تم فحصه?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

القدرة على زراعة خلايا الكبد الناضجة على مدى فترات طويلة أمر أساسي في دراسة العلوم الأساسية للكبد، وعلم السموم المخدرات والتهابات الميكروبيولوجيا المضيفة الهباتوتروبية مثل الملاريا وفيروسات التهاب الكبد. مع مكانة محددة جيدا ، يضع البروتوكول هنا نظاما ثقافة للخلايا الكبدية. يدفع هذا ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C