Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Resumen

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Resumen

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel importante en el almacenamiento de glucosa, la secreción de proteínas, el metabolismo y la desintoxicación. Como ejecutor de la mayoría de las funciones hepáticas, los hepatocitos primarios tienen una capacidad de proliferación limitada. Esto requiere el establecimiento de modelos de expansión de hepatocitos ex vivo para la investigación fisiológica y patológica del hígado. Aquí, aislamos los hepatocitos murinos por dos pasos de perfusión de colagenasa y establecimos un cultivo de organoides 3D como el "mini-hígado" para recapitular las interacciones célula-célula y las funciones físicas. Los organoides consisten en poblaciones celulares heterogéneas que incluyen progenitores y hepatocitos maduros. Introducimos el proceso en detalle para aislar y cultivar los hepatocitos murinos o el hepatocito fetal para formar organoides en 2-3 semanas y mostrar cómo pasarlos canalizando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo. Además, también presentaremos cómo digerir los organoides en células individuales para la infección por lentivirus de la construcción shRNA / ectópica, la transfección de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9. Los organoides se pueden utilizar para pruebas de detección de drogas, modelado de enfermedades e investigación hepática básica mediante el modelado de la biología hepática y la patobiología.

Introducción

Los organoides son grupos in vitro autoorganizados, tridimensionales (3D) que incluyen células madre autorrenovantes y células diferenciadas ^{multilinaje1,2}. Los organoides de muchos órganos se han establecido a partir de células madre pluripotentes o adultas por factores de nicho bien definidos, incluidos el intestino, el cerebro, el colon, el riñón, el hígado, el páncreas, la tiroides, el estómago, la piel y el pulmón3,4,5,6,7 . Los organoides recapitulan las funciones de las células físicas imitando el desarrollo (originado a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, PSC) o la progresión de la homeostasis/regeneración (originada a partir de células madre adultas, ASC), lo que abre nuevas vías en la investigación y terapia de ^{enfermedades8,9}.

Como el órgano más grande en los mamíferos, el hígado es principalmente responsable del almacenamiento, el metabolismo y la desintoxicación. Dos tipos de tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos, construyen la unidad básica de un lóbulo hepático. Los hepatocitos son responsables del 70-80% de la función ^hepática10. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración, la rápida pérdida de las características de los hepatocitos ocurre durante el cultivo monocapa tradicional por polarización y desdiferenciación celular desregulada, lo que aumenta la necesidad de investigadores y médicos de construir modelos hepáticos de "puente de brecha" en un plato. Sin embargo, hasta hace poco los modelos de expansión ex vivo de los hepatocitos primarios no estaban bien establecidos11,12,13,14,15. Los organoides hepáticos se pueden establecer a partir de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas, conversión de fibroblastos en células similares a hepatocitos y células derivadas de tejidos. El desarrollo de organoides hepáticos impulsa la aplicación de un modelo in vitro para cribados farmacológicos y ensayos de toxicidad ^{hepática16,17}.

Aquí, describimos un protocolo detallado para establecer organoides hepáticos a partir de hepatocitos primarios murinos. Mediante el uso de este protocolo, establecimos un sistema de cultivo in vitro de organoides de hepatocitos con dos perfusiones de colagenasa. Estos organoides pueden ser pasados para la expansión a largo plazo durante meses. Su función fisiológica es altamente consistente con los hepatocitos. Además, también proporcionamos una descripción detallada de cómo realizar la manipulación genética, como la infección por lentivirus, la transducción de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9 utilizando organoides. La propagación de organoides de hepatocitos arrojó luz sobre la posibilidad de utilizar organoides para comprender la biología hepática y desarrollar enfoques de medicina personalizados y traslacionales.

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Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Shandong y se llevaron a cabo de acuerdo con la Licencia bajo las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior (No. ECSBMSSDU2019-2-079).

NOTA: Este protocolo se utiliza principalmente para cultivar organoides 3D a partir de hepatocitos primarios aislados.

1. Establecimiento del cultivo de organoides de hepatocitos murinos

NOTA: La matriz extracelular como Matrigel o BME se utilizan como matriz de sótano para cultivar organoides. Almacene la matriz extracelular a -20 °C y descongele previamente a 4 °C o sobre hielo. Mantenga la matriz extracelular en hielo durante los experimentos. El medio de lavado es Advanced DMEM/F12 suplementado con GlutaMAX, HEPES y penicilina/estreptomicina. Se utiliza una incubadora estándar (37 °C, atmósfera humidificada, 5% de _CO2) para el cultivo de organoides.

1. Preparación de materiales
   1. Prepare los instrumentos necesarios para el experimento: la almohada del ratón, instrumentos quirúrgicos estériles como pinzas, tijeras, tubos y una bomba con un caudal de 2-10 ml / min.
   2. Prepare los reactivos, incluido el tampón de perfusión, el tampón de digestión y hágalos estériles para el aislamiento de hepatocitos. Añadir colagenasa tipo IV fresca (0,10 mg/ml) y _CaCl2 (0,50 M) y precalentar el tampón a 37 °C en un baño de agua.
   3. Prepare el medio condicional para producir R-spondina 1 y todas las existencias químicas y de factor de crecimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Evite congelar y descongelar con frecuencia el medio condicional y las existencias. Preparar el medio de cultivo fresco y utilizarlo en el plazo de un mes. Esto es fundamental para la eficiencia de la formación de organoides.
2. Aislamiento de hepatocitos murinos por perfusión hepática y digestión
   NOTA: Se utilizaron ratones machos o hembras entre las edades de 12 semanas y 6 meses para el cultivo de organoides. No se encontraron diferencias obvias en la eficiencia de la formación de organoides con respecto a la edad del ratón donante dentro de este rango.
   1. Sacrificar al ratón con un método éticamente aprobado.
   2. Fije el ratón en la almohada del ratón y limpie el pelaje abdominal y la piel con un 70% de alcohol. Exponga el abdomen y levante el hígado por encima del resto del cuerpo. Haga una incisión en la línea media para exponer el hígado.
   3. Llene el tubo conectado a la bomba con tampón de perfusión. Haga una incisión de la vena porta (aproximadamente 1/3 del diámetro de la vena) y coloque cuidadosamente un catéter en ella. Levante los órganos digestivos para ayudar a insertar la cánula. Un lazo con la línea quirúrgica es opcional para evitar deslizarse y romperse.
   4. Arranque la bomba y realice la perfusión a un caudal de 5-7 ml/min con tampón de perfusión. Si el hígado se pone pálido inmediatamente, corte la vena cava inferior para permitir que el tampón de perfusión fluya a través de todo el hígado y expulse la sangre.
   5. Cuando el flujo de salida se limpie, retire la cánula. Tarda unos 5-10 minutos.
   6. Cambie el tampón de perfusión con el tampón de digestión precalentado a una velocidad de 5 ml / min. No detenga la bomba hasta que el hígado se vuelva blando e hinchado. Retire el catéter cuando el hígado deje de hincharse.
      NOTA: Es muy importante mantener un tiempo de digestión adecuado para evitar la digestión excesiva y obtener células hepáticas individuales.
   7. Cortar el hígado y colocarlo en una placa de 100 mm llena de 15 ml de medio de lavado en frío. Corta los ligamentos con tijeras pequeñas. Rompa el hígado en pedazos con puntas de pipeta o fórceps.
   8. Pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para liberar las células hasta que el tampón esté saturado de células (12-15 veces). Vierta la suspensión celular en un tubo de 50 ml a través de filtros de 70 μm.
   9. Centrifugar durante 1-3 minutos a 50 x g y 4 °C. Decantar el sobrenadante. Opcionalmente, resuspend las células con medio de lavado o resuspend las células con medio de cultivo directamente. Cuente las células con un hemacitómetro.
   10. Distinguir las células vivas o muertas por la máquina de contador de células después de la tinción de tinte de células vivas.
       NOTA: Lo mejor es purificar los hepatocitos usando Percoll frío al 40%. Después de este paso, los hepatocitos viables estarán en la parte inferior de los tubos.
3. Cultivo y paso organoide
   1. Retire el sobrenadante y resuspenda los hepatocitos con una mezcla de matriz extracelular y medio de cultivo en una proporción de 3:1.
      NOTA: Se recomiendan 10,000-20,000 células en una mezcla de 50-60 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos. Es importante trabajar rápidamente y mantener la mezcla en hielo durante todo el proceso. Se podrían formar 200-500 organoides a esta concentración.
   2. Agregue la gota de célula / mezcla en la placa con gotas pequeñas para evitar que la gota se conecte entre sí. Incubar la placa en la incubadora celular a 37 °C, 5% _co2 durante 5-10 min y luego sacar la placa durante 20-25 min hasta que la matriz extracelular se vuelva sólida.
   3. Agregue el medio de cultivo (500 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos) en los pozos y devuelva la placa a la incubadora para el cultivo de organoides. Cambie el medio cada 3-4 días. Observe los organoides hasta que sean lo suficientemente grandes como para ser pasados.
      NOTA: Un diámetro con alrededor de 400-500 μm es adecuado para el paso de organoides hepatocitos.
   4. Aísle los organoides de la matriz extracelular con el proceso detallado a continuación. Sostenga una pipeta Pasteur de vidrio en una llama para reducir su apertura (en ~ 1/2). Pipetear mecánicamente hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para disociar los organoides en organoides más pequeños durante el pasaje.
      NOTA: Durante el pasaje, prepare puntas y tubos de micropipeta prelavados con tampón de lavado de punta para evitar la pérdida de organoides que se adhieren a los tubos o puntas.

2. Manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

1. Células individuales de organoides de hepatocitos
   1. Agregue 500 μL de medio de lavado en frío/solución de recuperación celular a cada pozo. Pipete hacia arriba y hacia abajo para destruir la mezcla de matriz celular / extracelular con una micropipeta y luego transfiera la suspensión organoide a un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo. Opcionalmente, gire el tubo hacia arriba y hacia abajo de vez en cuando para descongelar la mezcla a fondo.
   2. Centrifugar durante 5 min a 500-800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Agregue 1 ml de solución de tripsina al pellet y pipetearlo para mezclar. Incubar a 37 °C durante 5-10 min y luego detener la digestión agregando un volumen 2x de medio de lavado.
   3. Centrifugar durante 5 min a 800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con medio de cultivo y cuente las células con un hemacitómetro.
2. transfección de siRNA o plásmido
   NOTA: Los organoides más pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides de hepatocitos se transfectan con siRNA utilizando lipofectamina o plásmidos que usan reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Mezcle siRNA o plásmidos con reactivo de transfección. Agregue células individuales de organoides y la mezcla lipofectamina-ARN/lipoplasma (por ejemplo, RNAiMAX) en 1-2 pocillos en la placa de 24 pocillos y la centrífuga durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Después de la centrifugación, incube la placa en la incubadora durante 4-5 h a 37 ° C.
   2. Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo a una concentración de 10.000 células por pozo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.
3. Infección lentiviral
   NOTA: Los organoides pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides hepatocitos están infectados por lentivirus utilizando reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Mezclar 250 μL de la suspensión unicelular del organoide y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.
   2. Envasar la mezcla y centrifugar durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Incubar durante 4-5 h a 37 °C.
   3. Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.
4. Ingeniería genética por CRISPR/Cas9
   NOTA: Proporcionamos video para esta actuación en los materiales complementarios. Las células individuales de los organoides fueron infectadas con lentivirus o transfectadas por plásmidos portadores de sgRNA y Cas9.
   1. Digiera células individuales de organoides de hepatocitos cultivados y pase de acuerdo con el método anterior.
   2. Infectar células individuales con sgRNA utilizando medio Opti-MEM y reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Mezcle 250 μL de una suspensión unicelular y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.
   4. Centrifugar la mezcla de 500 μL durante 1 h a 500 x g y 32 °C y luego incubar durante 4-5 h a 37 °C.
   5. Recoger la suspensión celular y la semilla en matriz extracelular. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.

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Resultados

Los organoides hepatocitos de Alb-Cre femenino; Se observó ratón Rosa26-GFP (8 semanas) cinco días después de la siembra (Figura 1A). Los organoides están proliferando con tinción positiva de Ki67 (Figura 1B). La expresión interferente de genes representativos en organoides de hepatocitos, ya sea por transfección por siRNA o infección por lentivirus, se examinó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se muestran en las Figu...

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Discusión

La capacidad de cultivar hepatocitos maduros durante largos períodos es fundamental en el estudio de la ciencia básica del hígado, la toxicología de medicamentos y las infecciones hepatotrópicas de microbiología del huésped, como la malaria y los virus de la hepatitis. Con un nicho bien definido, el protocolo aquí establece un sistema de cultivo para hepatocitos. Este protocolo impulsa a los hepatocitos maduros a expandirse en cultivo 3D con una heterogeneidad que recapitula la interacción célula-célula, la fu...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C