Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Zusammenfassung

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Zusammenfassung

Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Glukosespeicherung, der Proteinsekretion, dem Stoffwechsel und der Entgiftung. Als Vollstrecker für die meisten Leberfunktionen haben primäre Hepatozyten eine begrenzte Proliferationskapazität. Dies erfordert die Etablierung von ex vivo Hepatozytenexpansionsmodellen für die leberphysiologische und pathologische Forschung. Hier isolierten wir murine Hepatozyten durch zwei Schritte der Kollagenase-Perfusion und etablierten eine 3D-Organoidkultur als "Mini-Leber", um Zell-Zell-Interaktionen und physikalische Funktionen zu rekapitulieren. Die Organoide bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Vorläufern und reifen Hepatozyten. Wir stellen den Prozess im Detail vor, um die murinen Hepatozyten oder fetalen Hepatozyten zu isolieren und zu kultivieren, um innerhalb von 2-3 Wochen Organoide zu bilden und zu zeigen, wie man sie durch mechanisches Pipettieren auf und ab durchläuft. Darüber hinaus werden wir auch vorstellen, wie die Organoide in einzelne Zellen für die Lentivirus-Infektion der shRNA / ektopischen Konstruktion, die siRNA-Transfektion und das CRISPR-Cas9-Engineering verdaut werden können. Die Organoide können für Drogenscreenings, Krankheitsmodellierung und grundlegende Leberforschung verwendet werden, indem Leberbiologie und Pathobiologie modelliert werden.

Einleitung

Organoide sind selbstorganisierte, dreidimensionale (3D) In-vitro-Cluster, die selbsterneuernde Stammzellen und mehrliniendifferenzierte Zellen ^umfassen1,2. Die Organoide vieler Organe wurden entweder aus pluripotenten oder adulten Stammzellen durch genau definierte Nischenfaktoren wie Darm, Gehirn, Dickdarm, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Magen, Haut und Lunge hergestellt3,4,5,6,7 . Die Organoide rekapitulieren physikalische Zellfunktionen, indem sie entweder die Entwicklung (entstanden aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen, PSCs) oder die Homöostase/Regenerationsprogression (entstanden aus adulten Stammzellen, ASCs) nachahmen, was neue Wege in der Krankheitsforschung und -therapie ^eröffnet8,9.

Als größtes Organ bei Säugetieren ist die Leber vor allem für die Speicherung, den Stoffwechsel und die Entgiftung verantwortlich. Zwei Arten von Epithelzelltypen, Hepatozyten und Cholangiozyten, konstruieren die Grundeinheit eines Leberläppchens. Hepatozyten sind für 70-80% der Leberfunktion ^{verantwortlich10}. Obwohl die Leber eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit aufweist, kommt es während der traditionellen Monolayer-Kultivierung durch dysregulierte Zellpolarisation und -dedifferenzierung zu einem schnellen Verlust von Hepatozytenmerkmalen, was die Notwendigkeit von Forschern und Klinikern erhöht, "lückenüberbrückende" Lebermodelle in einer Schale zu erstellen. Bis vor kurzem waren die Ex-vivo-Expansionsmodelle von primären Hepatozyten jedoch nicht gut etabliert11,12,13,14,15. Leberorganoide können aus embryonalen/induzierten pluripotenten Stammzellen, Fibroblastenumwandlung in hepatozytenähnliche Zellen und gewebeabgeleiteten Zellen hergestellt werden. Die Entwicklung von Leberorganoiden fördert die Anwendung eines In-vitro-Modells für Arzneimittelscreenings und Lebertoxizitätstests16,17.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von Leberorganoiden aus murinen primären Hepatozyten. Mit diesem Protokoll haben wir ein In-vitro-Kultursystem aus Hepatozyten-Organoiden mit zwei Kollagenase-Perfusionen aufgebaut. Diese Organoide können für eine langfristige Expansion für Monate durchquert werden. Ihre physiologische Funktion ist sehr konsistent mit Hepatozyten. Darüber hinaus bieten wir auch eine detaillierte Beschreibung der Durchführung von Genmanipulationen, wie Lentivirus-Infektion, siRNA-Transduktion und CRISPR-Cas9-Engineering mit Organoiden. Die Vermehrung von Hepatozyten-Organoiden beleuchtet die Möglichkeit, Organoide zu verwenden, um die Leberbiologie zu verstehen und personalisierte und translationale medizinische Ansätze zu entwickeln.

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Protokoll

Alle Mäuseexperimente wurden vom Animal Care and Use Committee der School of Basic Medical Sciences an der Shandong University genehmigt und gemäß der Lizenz gemäß den Richtlinien und Vorschriften des Innenministeriums (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).

HINWEIS: Dieses Protokoll wird hauptsächlich verwendet, um 3D-Organoide aus isolierten primären Hepatozyten zu kultivieren.

1. Etablierung der Murinen Hepatozyten-Organoidkultur

HINWEIS: Extrazelluläre Matrix wie Matrigel oder BME werden als Basalmatrix zur Kultivierung von Organoiden verwendet. Lagern Sie die extrazelluläre Matrix bei -20 °C und tauen Sie sie bei 4 °C oder auf Eis auf. Bewahren Sie die extrazelluläre Matrix während der Experimente auf Eis auf. Das Waschmedium ist Advanced DMEM/F12, ergänzt mit GlutaMAX, HEPES und Penicillin/Streptomycin. Für die Organoidkultur wird ein Standard-Inkubator (37 °C, befeuchtete Atmosphäre, 5% _CO2) verwendet.

1. Vorbereitung von Materialien
   1. Bereiten Sie die für das Experiment erforderlichen Instrumente vor: das Mauskissen, sterile chirurgische Instrumente wie Pinzette, Schere, Röhrchen und eine Pumpe mit einer Durchflussrate von 2-10 ml / min.
   2. Bereiten Sie die Reagenzien einschließlich des Perfusionspuffers und des Verdauungspuffers vor und machen Sie sie steril für die Hepatozytenisolierung. Frische Kollagenase Typ IV (0,10 mg/ml) und _CaCl2 (0,50 m) zugeben und den Puffer bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.
   3. Bereiten Sie das bedingte Medium vor, um R-spondin 1 und alle Chemikalien- und Wachstumsfaktorbestände gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, das bedingte Medium und die Bestände häufig einzufrieren und aufzutauen. Bereiten Sie das Kulturmedium frisch zu und verwenden Sie es innerhalb eines Monats. Dies ist entscheidend für die Effizienz der Organoidbildung.
2. Murine Hepatozytenisolierung durch Leberperfusion und Verdauung
   HINWEIS: Männliche oder weibliche Mäuse im Alter zwischen 12 Wochen und 6 Monaten wurden für die Organoidkultur verwendet. Es wurden keine offensichtlichen Unterschiede in der Effizienz der Organoidbildung gegenüber dem Alter der Spendermaus innerhalb dieses Bereichs gefunden.
   1. Euthanasieren Sie die Maus mit einer ethisch anerkannten Methode.
   2. Fixieren Sie die Maus auf dem Mauskissen und reinigen Sie das Bauchfell und die Haut mit 70% Alkohol. Legen Sie den Bauch frei und heben Sie die Leber über den Rest des Körpers. Machen Sie einen Mittellinienschnitt, um die Leber freizulegen.
   3. Füllen Sie das an der Pumpe befestigte Röhrchen mit Perfusionspuffer. Machen Sie einen Schnitt der Pfortader (etwa 1/3 des Durchmessers der Vene) und legen Sie vorsichtig einen Katheter hinein. Heben Sie die Verdauungsorgane an, um die Kanüle einzuführen. Eine Verbindung mit der Operationslinie ist optional, um ein Herausrutschen und Reißen zu vermeiden.
   4. Starten Sie die Pumpe und führen Sie die Perfusion mit einer Durchflussrate von 5-7 ml / min mit Perfusionspuffer durch. Wenn die Leber sofort blass wird, schneiden Sie die untere Hohlvene ab, damit der Perfusionspuffer durch die gesamte Leber fließen und das Blut austreiben kann.
   5. Wenn der Abfluss sauber wird, entfernen Sie die Kanüle. Es dauert ca. 5-10 Minuten.
   6. Ändern Sie den Perfusionspuffer mit einem vorgewärmten Verdauungspuffer mit einer Rate von 5 ml / min. Stoppen Sie die Pumpe nicht, bis die Leber weich wird und anschwillt. Entfernen Sie den Katheter, wenn die Leber aufhört zu schwellen.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die richtige Verdauungszeit einzuhalten, um eine übermäßige Verdauung zu vermeiden und einzelne Leberzellen zu erhalten.
   7. Schneiden Sie die Leber ab und legen Sie sie in eine 100 mm Platte, die mit 15 ml kaltem Waschmedium gefüllt ist. Schneiden Sie die Bänder mit einer kleinen Schere ab. Reißen Sie die Leber mit Pipettenspitzen oder Pinzette in Stücke.
   8. Vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Zellen freizusetzen, bis der Puffer mit Zellen gesättigt ist (12-15 mal). Gießen Sie die Zellsuspension durch 70 μm-Filter in ein 50-ml-Röhrchen.
   9. Zentrifuge für 1-3 Minuten bei 50 x g und 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand. Optional werden die Zellen mit Waschmedium resuspendiert oder die Zellen direkt mit Kulturmedium resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer.
   10. Unterscheiden Sie lebende oder abgestorbene Zellen durch die Zellzählmaschine nach der Färbung lebender Zellfarbstoffe.
       HINWEIS: Es ist am besten, Hepatozyten mit kaltem 40% Percoll zu reinigen. Nach diesem Schritt befinden sich lebensfähige Hepatozyten am Boden der Röhrchen.
3. Organoidkultur und -passage
   1. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Hepatozyten mit einer Mischung aus extrazellulärer Matrix und Kulturmedium im Verhältnis 3: 1.
      HINWEIS: 10.000-20.000 Zellen in einer 50-60 μL-Mischung pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte werden empfohlen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und die Mischung während des gesamten Prozesses auf Eis zu halten. In dieser Konzentration konnten 200-500 Organoide gebildet werden.
   2. Fügen Sie den Zell- / Mischungstropfen mit kleinen Tröpfchen auf die Platte hinzu, um zu verhindern, dass sich das Tröpfchen miteinander verbindet. Inkubieren Sie die Platte im Zellinkubator bei 37 °C, 5% _CO2 für 5-10 min und nehmen Sie die Platte dann für 20-25 min heraus, bis die extrazelluläre Matrix fest wird.
   3. Kulturmedium (500 μL pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte) in die Vertiefungen geben und die Platte zur Organoidkultur in den Inkubator zurückgeben. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Beobachten Sie die Organoide, bis sie groß genug sind, um durchquert zu werden.
      HINWEIS: Ein Durchmesser mit etwa 400-500 μm eignet sich für die Passage von Hepatozyten-Organoiden.
   4. Isolieren Sie Organoide aus der extrazellulären Matrix mit dem detaillierten Prozess unten. Halten Sie eine Pasteurpipette aus Glas in eine Flamme, um ihre Öffnung zu verengen (um ~ 1/2). Mechanisch 5-10 Mal nach oben und unten pipettieren, um die Organoide während des Passierens in kleinere Organoide zu dissoziieren.
      HINWEIS: Bereiten Sie während des Passierens vorgewaschene Mikropipettenspitzen und -röhrchen mit Tip-Wash-Puffer vor, um den Verlust von Organoiden zu vermeiden, die an den Schläuchen oder Spitzen haften.

2. Genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

1. Einzelzellen aus Hepatozyten-Organoiden
   1. Geben Sie 500 μL Kaltwaschmittel/ Zellrückgewinnungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um das Zell- / extrazelluläre Matrixgemisch mit einer Mikropipette zu zerstören, und übertragen Sie dann die Organoidsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Optional drehen Sie das Röhrchen von Zeit zu Zeit auf und ab, um die Mischung gründlich aufzutauen.
   2. 5 min bei 500-800 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 1 ml Trypsinlösung zum Pellet hinzu und pipettieren Sie es zum Mischen. Bei 37 °C für 5-10 min inkubieren und dann die Verdauung durch Zugabe eines 2-fachen Volumens Waschmedium stoppen.
   3. 5 min bei 800 x g und 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Resuspendieren Sie das Pellet mit Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer.
2. siRNA- oder Plasmidtransfektion
   HINWEIS: Kleinere Organoide mit einem Durchmesser von weniger als 50 μm oder einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden werden mit siRNA unter Verwendung von Lipofektamin oder Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert.
   1. Mischen Sie siRNA oder Plasmide mit Transfektionsreagenz. Einzelne Zellen aus Organoiden und die Lipofectamin-RNA/Lipo-Plasmid-Mischung (z. B. RNAiMAX) in 1-2 Vertiefungen in der 24-Well-Platte und Zentrifuge für 1 h bei 500 x g und 32 °C geben. Nach der Zentrifugation die Platte im Inkubator für 4-5 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Sammeln Sie die Zellen und samen Sie in extrazellulärer Matrix mit Kulturmedium in einer Konzentration von 10.000 Zellen pro Vertiefung. Ändern Sie das Medium zwei Tage nach der Transfektion in die Selektionsbedingung. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.
3. Lentivirale Infektion
   HINWEIS: Kleine Organoide mit einem Durchmesser von weniger als 50 μm oder einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden werden mit Lentivirus unter Verwendung von Infektionsreagenzien medium gemäß den Anweisungen des Herstellers infiziert.
   1. Mischen Sie 250 μL der Einzelzellsuspension aus dem Organoid und 250 μL virale Partikel in einem 1,5 ml Röhrchen.
   2. Das Gemisch und die Zentrifuge für 1 h bei 500 x g und 32 °C zentrifugieren. 4-5 h bei 37 °C inkubieren.
   3. Sammeln Sie die Zellen und samen Sie in extrazellulärer Matrix mit Kulturmedium. Ändern Sie das Medium zwei Tage nach der Transfektion in die Selektionsbedingung. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.
4. Gentechnik von CRISPR/Cas9
   HINWEIS: Wir stellen ein Video zu dieser Aufführung in den ergänzenden Materialien zur Verfügung. Einzelne Zellen von Organoiden wurden mit Lentivirus infiziert oder durch Plasmide transfiziert, die sgRNA und Cas9 trugen.
   1. Verdauen Sie einzelne Zellen aus Hepatozyten-Organoiden, die nach der oben genannten Methode kultiviert und durchlaufen werden.
   2. Infizieren Sie einzelne Zellen mit sgRNA unter Verwendung von Opti-MEM-Medium und Infektionsreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Mischen Sie 250 μL einer Einzelzellsuspension und 250 μL virale Partikel in einem 1,5 ml Röhrchen zusammen.
   4. Zentrifugieren Sie die 500 μL-Mischung für 1 h bei 500 x g und 32 °C und inkubieren Sie dann für 4-5 h bei 37 °C.
   5. Sammeln Sie die Zellsuspension und den Samen in extrazellulärer Matrix. Beurteilen Sie die Organoidbildungseffizienz nach 10 Tagen.

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Ergebnisse

Die Hepatozyten-Organoide von weiblichen Alb-Cre; Rosa26-GFP-Maus (8 Wochen) wurde fünf Tage nach der Aussaat beobachtet (Abbildung 1A). Die Organoide vermehren sich mit Ki67-positiver Färbung (Abbildung 1B). Die interferierende Expression repräsentativer Gene in Hepatozyten-Organoiden entweder durch siRNA-Transfektion oder Lentivirus-Infektion wurde mittels qRT-PCR und Western Blot untersucht. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2A

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Diskussion

Die Fähigkeit, reife Hepatozyten über lange Zeiträume zu kultivieren, ist von grundlegender Bedeutung für das Studium der Lebergrundforschung, der Arzneimitteltoxikologie und der hepatotropen Wirtsmikrobiologie-Infektionen wie Malaria und Hepatitis-Viren. Mit einer klar definierten Nische richtet das Protokoll hier ein Kultursystem für Hepatozyten ein. Dieses Protokoll treibt reife Hepatozyten dazu, sich in 3D-Kultur mit einer Heterogenität auszudehnen, die die Zell-Zell-Interaktion, die meisten Hepatozytenfunktion...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C