Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

Résumé

Un système de culture organoïde 3D ex vitro à long terme a été établi à partir d’hépatocytes de souris. Ces organoïdes peuvent être passés et génétiquement manipulés par l’infection à lentivirus de la construction shRNA/ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9.

Résumé

Le foie est le plus grand organe chez les mammifères. Il joue un rôle important dans le stockage du glucose, la sécrétion de protéines, le métabolisme et la désintoxication. En tant qu’exécuteur testamentaire de la plupart des fonctions hépatiques, les hépatocytes primaires ont une capacité de prolifération limitée. Cela nécessite l’établissement de modèles d’expansion des hépatocytes ex vivo pour la recherche physiologique et pathologique du foie. Ici, nous avons isolé les hépatocytes murins par deux étapes de perfusion de collagénase et établi une culture organoïde 3D en tant que « mini-foie » pour récapituler les interactions cellule-cellule et les fonctions physiques. Les organoïdes sont constitués de populations cellulaires hétérogènes comprenant des progéniteurs et des hépatocytes matures. Nous présentons le processus en détail pour isoler et cultiver les hépatocytes murins ou les hépatocytes fœtaux pour former des organoïdes dans les 2-3 semaines et montrer comment les passer en les piquant mécaniquement de haut en bas. En outre, nous présenterons également comment digérer les organoïdes en cellules individuelles pour l’infection lentivirus de la construction shRNA / ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9. Les organoïdes peuvent être utilisés pour les dépistages de médicaments, la modélisation des maladies et la recherche fondamentale sur le foie en modélisant la biologie et la pathobiologie du foie.

Introduction

Les organoïdes sont des grappes in vitro tridimensionnelles (3D) auto-organisées qui comprennent des cellules souches auto-renouvelées et des cellules différenciées ^{multi-lignées1,2}. Les organoïdes de nombreux organes ont été établis à partir de cellules souches pluripotentes ou adultes par des facteurs de niche bien définis, notamment l’intestin, le cerveau, le côlon, les reins, le foie, le pancréas, la thyroïde, l’estomac, la peau et les poumons3,4,5,6,7 . Les organoïdes récapitulent les fonctions cellulaires physiques en imitant soit le développement (provenant de cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites, PSC), soit la progression de l’homéostasie/régénération (provenant de cellules souches adultes, ASC), ce qui ouvre de nouvelles voies dans la recherche et le traitement des ^maladies8,9.

En tant que plus grand organe chez les mammifères, le foie est principalement responsable du stockage, du métabolisme et de la désintoxication. Deux types de cellules épithéliales, les hépatocytes et les cholangiocytes, construisent l’unité de base d’un lobule hépatique. Les hépatocytes sont responsables de 70 à 80 % de la fonction ^hépatique10. Bien que le foie ait une capacité de régénération remarquable, la perte rapide des caractéristiques hépatocytaires se produit lors de la culture traditionnelle de monocouches par polarisation et dédifférenciation cellulaires dérégulées, ce qui augmente le besoin des chercheurs et des cliniciens de construire des modèles hépatiques « pontant les lacunes » dans un plat. Cependant, jusqu’à récemment, les modèles d’expansion ex vivo des hépatocytes primaires n’avaient pas été bien établis11,12,13,14,15. Les organoïdes hépatiques peuvent être établis à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires / induites, de la conversion des fibroblastes en cellules de type hépatocytaire et de cellules dérivées de tissus. Le développement d’organoïdes hépatiques stimule l’application d’un modèle in vitro pour les dépistages de médicaments et les tests de toxicité ^{hépatique16,17}.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour établir des organoïdes hépatiques à partir d’hépatocytes primaires murins. En utilisant ce protocole, nous avons mis en place un système de culture in vitro d’organoïdes hépatocytaires avec deux perfusions de collagénase. Ces organoïdes peuvent être passés pour une expansion à long terme pendant des mois. Leur fonction physiologique est très cohérente avec les hépatocytes. En outre, nous fournissons également une description détaillée de la façon d’effectuer des manipulations génétiques, telles que l’infection à lentivirus, la transduction de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9 à l’aide d’organoïdes. La propagation des organoïdes hépatocytaires a mis en lumière la possibilité d’utiliser des organoïdes pour comprendre la biologie du foie et développer des approches de médecine personnalisée et translationnelle.

Protocole

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’École des sciences médicales fondamentales de l’Université du Shandong et ont été réalisées conformément à la licence en vertu des directives et règlements du ministère de l’Intérieur (No. ECSBMSSDU2019-2-079).

REMARQUE: Ce protocole est principalement utilisé pour cultiver des organoïdes 3D à partir d’hépatocytes primaires isolés.

1. Établissement de la culture d’organoïdes d’hépatocytes murins

REMARQUE: Les matrices extracellulaires telles que Matrigel ou BME sont utilisées comme matrice de base pour la culture d’organoïdes. Stocker la matrice extracellulaire à -20 °C et la pré-décongeler à 4 °C ou sur de la glace. Gardez la matrice extracellulaire sur la glace pendant les expériences. Le milieu de lavage est Advanced DMEM/F12 complété par GlutaMAX, HEPES et pénicilline/streptomycine. Un incubateur standard (37 °C, atmosphère humidifiée, 5% de _CO2) est utilisé pour la culture organoïde.

1. Préparation des matériaux
   1. Préparez les instruments nécessaires à l’expérience: l’oreiller de souris, des instruments chirurgicaux stériles comme une pince à épiler, des ciseaux, des tubes et une pompe avec un débit de 2 à 10 mL / min.
   2. Préparez les réactifs, y compris le tampon de perfusion, le tampon de digestion et rendez-les stériles pour l’isolement des hépatocytes. Ajouter la collagénase fraîche de type IV (0,10 mg/mL) et le _CaCl2 (0,50 M) et préchauffer le tampon à 37 °C au bain-marie.
   3. Préparer le milieu conditionnel pour produire R-spondin 1 et tous les stocks de produits chimiques et de facteurs de croissance conformément aux instructions du fabricant.
      REMARQUE: Évitez de congeler et de décongeler fréquemment le milieu conditionnel et les stocks. Préparez le milieu de culture frais et utilisez-le dans un délai d’un mois. Ceci est essentiel pour l’efficacité de la formation organoïde.
2. Isolement des hépatocytes murins par perfusion hépatique et digestion
   REMARQUE: Des souris mâles ou femelles âgées de 12 semaines à 6 mois ont été utilisées pour la culture organoïde. Aucune différence évidente n’a été trouvée dans l’efficacité de la formation organoïde par rapport à l’âge de la souris donneuse dans cette plage.
   1. Euthanasier la souris avec une méthode approuvée par l’éthique.
   2. Fixez la souris sur l’oreiller de la souris et nettoyez la fourrure abdominale et la peau avec 70% d’alcool. Exposez l’abdomen et soulevez le foie au-dessus du reste du corps. Faites une incision médiane pour exposer le foie.
   3. Remplissez le tube fixé à la pompe avec un tampon de perfusion. Faites une incision de la veine porte (environ 1/3 du diamètre de la veine) et placez-y soigneusement un cathéter. Soulevez les organes digestifs pour aider à insérer la canule. Une attache avec la ligne chirurgicale est facultative pour éviter de glisser et de se rompre.
   4. Démarrez la pompe et effectuez la perfusion à un débit de 5-7 mL / min avec tampon de perfusion. Si le foie pâlit immédiatement, coupez la veine cave inférieure pour permettre au tampon de perfusion de circuler dans tout le foie et de chasser le sang.
   5. Lorsque l’écoulement devient propre, retirez la canule. Cela prend environ 5-10 minutes.
   6. Changer le tampon de perfusion avec un tampon de digestion préchauffé à raison de 5 mL/min. N’arrêtez pas la pompe jusqu’à ce que le foie devienne mou et gonfle. Retirez le cathéter lorsque le foie cesse de gonfler.
      REMARQUE: Il est très important de garder un temps de digestion approprié pour éviter une digestion excessive et obtenir des cellules hépatiques uniques.
   7. Coupez le foie et placez-le dans une plaque de 100 mm remplie de 15 mL de milieu de lavage à froid. Coupez les ligaments avec de petits ciseaux. Déchirez le foie en morceaux avec des pointes de pipette ou des pinces.
   8. Pipettez doucement de haut en bas pour libérer les cellules jusqu’à ce que le tampon soit saturé de cellules (12-15 fois). Versez la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL à travers des filtres de 70 μm.
   9. Centrifuger pendant 1-3 minutes à 50 x g et 4 °C. Décantez le surnageant. Éventuellement, remettez en suspension les cellules avec un milieu de lavage ou remettez en suspension directement les cellules avec un milieu de culture. Comptez les cellules avec un hémacytomètre.
   10. Distinguer les cellules vivantes ou mortes par la machine de compteur de cellules après la coloration des colorants cellulaires vivants.
       REMARQUE: Il est préférable de purifier les hépatocytes en utilisant 40% de Percoll froid. Après cette étape, des hépatocytes viables seront au fond des tubes.
3. Culture et passage organoïdes
   1. Retirez le surnageant et remettez en suspension les hépatocytes avec un mélange de matrice extracellulaire et de milieu de culture dans un rapport de 3:1.
      REMARQUE: 10 000 à 20 000 cellules dans un mélange de 50 à 60 μL par puits pour une plaque de 24 puits sont recommandées. Il est important de travailler rapidement et de garder le mélange sur la glace tout au long du processus. 200 à 500 organoïdes pourraient se former à cette concentration.
   2. Ajouter la goutte de cellule/mélange sur la plaque avec de petites gouttelettes pour empêcher la gouttelette de se connecter entre elles. Incuber la plaque dans l’incubateur cellulaire à 37 °C, 5% de _CO2 pendant 5-10 min, puis retirer la plaque pendant 20-25 min jusqu’à ce que la matrice extracellulaire devienne solide.
   3. Ajouter le milieu de culture (500 μL par puits pour une plaque de 24 puits) dans les puits et remettre la plaque à l’incubateur pour la culture organoïde. Changez le support tous les 3-4 jours. Observez les organoïdes jusqu’à ce qu’ils soient assez grands pour être passés.
      REMARQUE: Un diamètre d’environ 400-500 μm convient au passage des organoïdes hépatocytaires.
   4. Isolez les organoïdes de la matrice extracellulaire avec le processus détaillé ci-dessous. Tenez une pipette Pasteur en verre dans une flamme pour réduire son ouverture (d’environ 1/2). Pipetter mécaniquement de haut en bas 5 à 10 fois pour dissocier les organoïdes en organoïdes plus petits pendant le passage.
      REMARQUE: Pendant le passage, préparez des embouts et des tubes de micropipette prélavés avec un tampon de lavage de pointe pour éviter la perte d’organoïdes collant aux tubes ou aux pointes.

2. Manipulation génétique des organoïdes des hépatocytes murins

1. Cellules uniques d’organoïdes hépatocytaires
   1. Ajouter 500 μL de milieu de lavage à froid/solution de récupération cellulaire à chaque puits. Pipette de haut en bas pour détruire le mélange cellule/matrice extracellulaire avec une micropipette, puis transférer la suspension organoïde dans un tube de centrifugeuse de 15 mL sur de la glace. En option, tournez le tube de haut en bas de temps en temps pour décongeler le mélange à fond.
   2. Centrifuger pendant 5 min à 500-800 x g et 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à la pastille et pipeter pour mélanger. Incuber à 37 °C pendant 5-10 min, puis arrêter la digestion en ajoutant un volume 2x de milieu de lavage.
   3. Centrifuger pendant 5 min à 800 x g et 4 °C et jeter le surnageant. Resuspendez la pastille avec un milieu de culture et comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
2. transfection de siRNA ou de plasmides
   REMARQUE: Les organoïdes plus petits d’un diamètre inférieur à 50 μm ou les cellules individuelles d’organoïdes hépatocytaires sont transfectés avec de l’ARNsi à l’aide de lipofectamine ou de plasmides à l’aide d’un réactif de transfection conformément aux instructions du fabricant.
   1. Mélanger l’ARNsi ou les plasmides avec un réactif de transfection. Ajouter des cellules individuelles provenant d’organoïdes et le mélange Lipofectamine-ARN/Lipo-plasmide (p. ex. RNAiMAX) dans 1 à 2 puits dans la plaque de 24 puits et centrifuger pendant 1 h à 500 x g et 32 °C. Après centrifugation, incuber la plaque dans l’incubateur pendant 4-5 h à 37 °C.
   2. Recueillir les cellules et les ensemencer dans une matrice extracellulaire avec un milieu de culture à une concentration de 10 000 cellules par puits. Remplacez le milieu par la condition de sélection deux jours après la transfection. Évaluez l’efficacité de la formation d’organoïdes après 10 jours.
3. Infection lentivirale
   REMARQUE: Les petits organoïdes d’un diamètre inférieur à 50 μm ou les cellules individuelles des organoïdes hépatocytaires sont infectés par le lentivirus à l’aide de réactifs infectieux moyens conformément aux instructions du fabricant.
   1. Mélanger 250 μL de la suspension unicellulaire de l’organoïde et 250 μL de particules virales dans un tube de 1,5 mL.
   2. Plaquer le mélange et centrifuger pendant 1 h à 500 x g et 32 °C. Incuber pendant 4-5 h à 37 °C.
   3. Recueillir les cellules et les graines dans une matrice extracellulaire avec un milieu de culture. Remplacez le milieu par la condition de sélection deux jours après la transfection. Évaluez l’efficacité de la formation d’organoïdes après 10 jours.
4. Génie génétique par CRISPR/Cas9
   REMARQUE: Nous fournissons des vidéos pour cette performance dans les documents supplémentaires. Des cellules individuelles d’organoïdes ont été infectées par le lentivirus ou transfectées par des plasmides porteurs d’ARNg et de Cas9.
   1. Digérer des cellules individuelles à partir d’organoïdes hépatocytaires cultivés et passés selon la méthode ci-dessus.
   2. Infecter des cellules individuelles avec de l’ARNg à l’aide d’un milieu Opti-MEM et de réactifs d’infection conformément aux instructions du fabricant.
   3. Mélanger 250 μL d’une suspension unicellulaire et 250 μL de particules virales dans un tube de 1,5 mL.
   4. Centrifuger le mélange de 500 μL pendant 1 h à 500 x g et 32 °C, puis incuber pendant 4-5 h à 37 °C.
   5. Recueillir la suspension cellulaire et la graine dans la matrice extracellulaire. Évaluez l’efficacité de la formation d’organoïdes après 10 jours.

Résultats

Les organoïdes hépatocytaires de la femelle Alb-Cre; La souris Rosa26-GFP (8 semaines) a été observée cinq jours après l’ensemencement (Figure 1A). Les organoïdes prolifèrent avec une coloration Ki67 positive (Figure 1B). L’expression interférente de gènes représentatifs dans les organoïdes hépatocytaires, soit par transfection de siRNA, soit par infection à lentivirus, a été examinée par qRT-PCR et western blot. Les résultats sont présent...

Discussion

La capacité de cultiver des hépatocytes matures sur de longues périodes est fondamentale dans l’étude de la science fondamentale du foie, de la toxicologie des médicaments et des infections hépatotropes en microbiologie de l’hôte telles que le paludisme et les virus de l’hépatite. Avec une niche bien définie, le protocole met ici en place un système de culture pour les hépatocytes. Ce protocole pousse les hépatocytes matures à se développer en culture 3D avec une hétérogénéité qui récapitule l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C