Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Riepilogo

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Abstract

Il fegato è l'organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo importante nella conservazione del glucosio, nella secrezione proteica, nel metabolismo e nella disintossicazione. Come esecutore per la maggior parte delle funzioni epatiche, gli epatociti primari hanno una capacità proliferante limitata. Ciò richiede l'istituzione di modelli di espansione epatocitaria ex vivo per la ricerca fisiologica e patologica epatica. Qui, abbiamo isolato gli epatociti murini mediante due fasi di perfusione di collagenasi e stabilito una coltura organoide 3D come "mini-fegato" per ricapitolare le interazioni cellula-cellula e le funzioni fisiche. Gli organoidi sono costituiti da popolazioni cellulari eterogenee tra cui progenitori ed epatociti maturi. Introduciamo il processo in dettaglio per isolare e coltivare gli epatociti murini o gli epatociti fetali per formare organoidi entro 2-3 settimane e mostriamo come passarli con il pipettaggio meccanico su e giù. Inoltre, introdurremo anche come digerire gli organoidi in singole cellule per l'infezione da lentivirus di costruzione shRNA / ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9. Gli organoidi possono essere utilizzati per schermi farmacologici, modelli di malattie e ricerca epatica di base modellando la biologia epatica e la patobiologia.

Introduzione

Gli organoidi sono cluster in vitro auto-organizzati, tridimensionali (3D) che includono cellule staminali auto-rinnovanti e cellule differenziate multi-linea1,2. Gli organoidi di molti organi sono stati stabiliti da cellule staminali pluripotenti o adulte da fattori di nicchia ben definiti tra cui l'intestino, il cervello, il colon, il rene, il fegato, il pancreas, la tiroide, lo stomaco, la pelle e il polmone3,4,5,6,7 . Gli organoidi ricapitolano le funzioni fisiche delle cellule imitando lo sviluppo (originato da cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, PSC) o la progressione dell'omeostasi/rigenerazione (originata da cellule staminali adulte, ASC), che apre nuove strade nella ricerca e nella terapia delle ^malattie8,9.

Essendo il più grande organo dei mammiferi, il fegato è principalmente responsabile della conservazione, del metabolismo e della disintossicazione. Due tipi di cellule epiteliali, epatociti e colangiociti, costruiscono l'unità di base di un lobulo epatico. Gli epatociti sono responsabili del 70-80% della funzionalità ^epatica10. Sebbene il fegato abbia una notevole capacità di rigenerazione, la rapida perdita delle caratteristiche degli epatociti si verifica durante la tradizionale coltura monostrato mediante polarizzazione cellulare disregolata e dedifferenziazione, il che aumenta la necessità di ricercatori e medici di costruire modelli epatici "gap-bridging" in un piatto. Tuttavia, fino a poco tempo fa i modelli di espansione ex vivo degli epatociti primari non erano stati ben stabiliti11,12,13,14,15. Gli organoidi epatici possono essere stabiliti da cellule staminali pluripotenti embrionali / indotte, conversione dei fibroblasti in cellule simili agli epatociti e cellule derivate dai tessuti. Lo sviluppo di organoidi epatici stimola l'applicazione di un modello in vitro per screening farmacologici e saggi di tossicità ^epatica16,17.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per stabilire organoidi epatici da epatociti primari murini. Utilizzando questo protocollo, abbiamo creato un sistema di coltura in vitro di organoidi epatocitari con due perfusioni di collagenasi. Questi organoidi possono essere passati per un'espansione a lungo termine per mesi. La loro funzione fisiologica è altamente coerente con gli epatociti. Inoltre, forniamo anche una descrizione dettagliata di come eseguire la manipolazione genetica, come l'infezione da lentivirus, la trasduzione del siRNA e l'ingegneria CRISPR-Cas9 utilizzando organoidi. La propagazione degli organoidi epatocitari fa luce sulla possibilità di utilizzare gli organoidi per comprendere la biologia epatica e sviluppare approcci di medicina personalizzati e traslazionali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della School of Basic Medical Sciences dell'Università di Shandong e sono stati effettuati secondo la Licenza secondo le linee guida e i regolamenti del Ministero degli Interni (No. ECSBMSSDU2019-2-079).

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato principalmente per la coltura di organoidi 3D da epatociti primari isolati.

1. Istituzione della coltura di epatociti murini

NOTA: La matrice extracellulare come Matrigel o BME viene utilizzata come matrice basale per la coltura di organoidi. Conservare la matrice extracellulare a -20 °C e pre-scongelarla a 4 °C o sul ghiaccio. Mantenere la matrice extracellulare sul ghiaccio durante gli esperimenti. Il mezzo di lavaggio è Advanced DMEM/F12 integrato con GlutaMAX, HEPES e penicillina/streptomicina. Un incubatore standard (37 °C, atmosfera umidificata, 5% di _CO2) viene utilizzato per la coltura di organoidi.

1. Preparazione dei materiali
   1. Preparare gli strumenti necessari per l'esperimento: il cuscino del mouse, strumenti chirurgici sterili come pinzette, forbici, tubi e una pompa con una portata di 2-10 ml / min.
   2. Preparare i reagenti compreso il tampone di perfusione, il tampone di digestione e renderli sterili per l'isolamento degli epatociti. Aggiungere collagenasi fresca di tipo IV (0,10 mg/ml) e _CaCl2 (0,50 M) e preriscaldare il tampone a 37 °C a bagnomaria.
   3. Preparare il mezzo condizionale per produrre R-spondin 1 e tutte le scorte chimiche e dei fattori di crescita secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Evitare di congelare e scongelare frequentemente il mezzo condizionale e le scorte. Preparare la coltura media fresca e utilizzarla entro un mese. Questo è fondamentale per l'efficienza di formatura degli organoidi.
2. Isolamento degli epatociti murini mediante perfusione epatica e digestione
   NOTA: Topi maschi o femmine di età compresa tra 12 settimane e 6 mesi sono stati utilizzati per la coltura di organoidi. Non sono state riscontrate differenze evidenti nell'efficienza di formazione degli organoidi rispetto all'età del topo donatore all'interno di questo intervallo.
   1. Eutanasia del topo con un metodo eticamente approvato.
   2. Fissare il mouse sul cuscino del mouse e pulire la pelliccia addominale e la pelle con alcol al 70%. Esporre l'addome e sollevare il fegato sopra il resto del corpo. Fai un'incisione della linea mediana per esporre il fegato.
   3. Riempire il tubo collegato alla pompa con tampone di perfusione. Fare un'incisione della vena porta (circa 1/3 del diametro della vena) e posizionare con cura un catetere in esso. Sollevare gli organi digestivi per aiutare a inserire la cannula. Una cravatta con la linea chirurgica è opzionale per evitare scivolamenti e rotture.
   4. Avviare la pompa ed eseguire la perfusione ad una portata di 5-7 ml/min con tampone di perfusione. Se il fegato diventa pallido immediatamente, tagliare la vena cava inferiore per consentire al tampone di perfusione di fluire attraverso tutto il fegato e scacciare il sangue.
   5. Quando il flusso in uscita diventa pulito, rimuovere la cannula. Ci vogliono circa 5-10 minuti.
   6. Cambiare il tampone di perfusione con tampone di digestione preriscaldato ad una velocità di 5 ml/min. Non interrompere la pompa fino a quando il fegato diventa morbido e si gonfia. Rimuovere il catetere quando il fegato smette di gonfiarsi.
      NOTA: È molto importante mantenere un tempo di digestione adeguato per evitare una digestione eccessiva e ottenere singole cellule del fegato.
   7. Tagliare il fegato e metterlo in una piastra da 100 mm riempita con 15 ml di mezzo di lavaggio a freddo. Tagliare i legamenti con piccole forbici. Strappare il fegato a pezzi con punte di pipetta o pinza.
   8. Pipettare su e giù delicatamente per rilasciare le cellule fino a quando il tampone è saturo di cellule (12-15 volte). Versare la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml attraverso filtri da 70 μm.
   9. Centrifugare per 1-3 minuti a 50 x g e 4 °C. Decantare il surnatante. Facoltativamente, risospesere le cellule con il mezzo di lavaggio o risospescere direttamente le cellule con il terreno di coltura. Conta le cellule con un emacitometro.
   10. Distinguere le cellule vive o morte dalla macchina contacellulare dopo la colorazione del colorante cellulare vivo.
       NOTA: È meglio purificare gli epatociti usando il freddo 40% di Percoll. Dopo questo passaggio, gli epatociti vitali saranno nella parte inferiore dei tubi.
3. Coltura e passaggio di organoidi
   1. Rimuovere il surnatante e risospese gli epatociti con una miscela di matrice extracellulare e terreno di coltura in un rapporto di 3:1.
      NOTA: si consigliano 10.000-20.000 cellule in una miscela da 50-60 μL per pozzetto per una piastra da 24 pozzetti. È importante lavorare rapidamente e mantenere la miscela su ghiaccio durante tutto il processo. A questa concentrazione si potrebbero formare 200-500 organoidi.
   2. Aggiungere la goccia di cella / miscela sulla piastra con piccole goccioline per evitare che la goccia si colleghi insieme. Incubare la piastra nell'incubatore cellulare a 37 °C, 5% DI _CO2 per 5-10 minuti e quindi estrarre la piastra per 20-25 minuti fino a quando la matrice extracellulare diventa solida.
   3. Aggiungere il terreno di coltura (500 μL per pozzetto per una piastra a 24 pozzetti) nei pozzetti e restituire la piastra all'incubatore per la coltura organoide. Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni. Osservare gli organoidi fino a quando non sono abbastanza grandi da essere passati.
      NOTA: Un diametro con circa 400-500 μm è adatto per il passaggio di organoidi epatocitari.
   4. Isolare gli organoidi dalla matrice extracellulare con il processo dettagliato di seguito. Tenere una pipetta Pasteur di vetro in una fiamma per restringerne l'apertura (di ~1/2). Pipettare meccanicamente su e giù 5-10 volte per dissociare gli organoidi in organoidi più piccoli durante il passaggio.
      NOTA: Durante il passaggio, preparare le punte e i tubi in micropipette prelavati con tampone di lavaggio a punta per evitare la perdita di organoidi che si attaccano ai tubi o alle punte.

2. Manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

1. Cellule singole da organoidi epatociti
   1. Aggiungere 500 μL di soluzione di recupero a freddo medio/cellulare a ciascun pozzetto. Pipettare su e giù per distruggere la miscela di matrice cellulare / extracellulare con una micropipetta e quindi trasferire la sospensione organoide in un tubo centrifugo da 15 ml su ghiaccio. Facoltativamente, ruotare il tubo su e giù di tanto in tanto per scongelare accuratamente la miscela.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 500-800 x g e 4 °C ed eliminare il surnatante. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina al pellet e pipettarlo per mescolare. Incubare a 37 °C per 5-10 minuti e quindi interrompere la digestione aggiungendo un volume 2x di mezzo di lavaggio.
   3. Centrifugare per 5 minuti a 800 x g e 4 °C ed eliminare il surnatante. Risospesciare il pellet con terreno di coltura e contare le cellule usando un emacitometro.
2. trasfezione di siRNA o plasmidi
   NOTA: gli organoidi più piccoli con un diametro inferiore a 50 μm o le singole cellule di organoidi epatocitari vengono trasfettati con siRNA usando lipofectamine o plasmidi usando reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.
   1. Mescolare siRNA o plasmidi con reagente di trasfezione. Aggiungere singole cellule da organoidi e la miscela Lipofectamine-RNA/Lipo-plasmide (ad esempio, RNAiMAX) in 1-2 pozzetti nella piastra a 24 pozzetti e centrifugare per 1 ora a 500 x g e 32 °C. Dopo la centrifugazione, incubare la piastra nell'incubatore per 4-5 ore a 37 °C.
   2. Raccogliere le cellule e il seme in matrice extracellulare con terreno di coltura ad una concentrazione di 10.000 cellule per pozzetto. Cambiare il mezzo nella condizione di selezione due giorni dopo la trasfezione. Valutare l'efficienza di formazione degli organoidi dopo 10 giorni.
3. Infezione lentivirale
   NOTA: piccoli organoidi con un diametro inferiore a 50 μm o singole cellule di organoidi epatociti sono infettati da lentivirus utilizzando reagenti di infezione secondo le istruzioni del produttore.
   1. Mescolare 250 μL della sospensione unicellulare dall'organoide e 250 μL di particelle virali in un tubo da 1,5 mL.
   2. Impiattare la miscela e centrifugare per 1 ora a 500 x g e 32 °C. Incubare per 4-5 ore a 37 °C.
   3. Raccogliere le cellule e il seme in matrice extracellulare con terreno di coltura. Cambiare il mezzo nella condizione di selezione due giorni dopo la trasfezione. Valutare l'efficienza di formazione degli organoidi dopo 10 giorni.
4. Ingegneria genetica di CRISPR/Cas9
   NOTA: Forniamo video per questa performance nei materiali supplementari. Singole cellule di organoidi sono state infettate da lentivirus o trasfettate da plasmidi portatori di sgRNA e Cas9.
   1. Digerire singole cellule da organoidi epatociti coltivati e passaggio secondo il metodo di cui sopra.
   2. Infettare singole cellule con sgRNA utilizzando il mezzo Opti-MEM e reagenti di infezione secondo le istruzioni del produttore.
   3. Mescolare 250 μL di una sospensione unicellulare e 250 μL di particelle virali insieme in un tubo da 1,5 mL.
   4. Centrifugare la miscela da 500 μL per 1 ora a 500 x g e 32 °C e quindi incubare per 4-5 ore a 37 °C.
   5. Raccogliere la sospensione cellulare e il seme in matrice extracellulare. Valutare l'efficienza di formazione degli organoidi dopo 10 giorni.

Risultati

Gli organoidi epatociti della femmina Alb-Cre; Il topo Rosa26-GFP (8 settimane) è stato osservato cinque giorni dopo la semina (Figura 1A). Gli organoidi proliferano con la colorazione positiva Ki67 (Figura 1B). L'espressione interferente di geni rappresentativi negli organoidi epatocitari mediante trasfezione di siRNA o infezione da lentivirus è stata esaminata mediante qRT-PCR e western blot. I risultati sono mostrati nelle Figure 2A

Discussione

La capacità di coltivare epatociti maturi per lunghi periodi è fondamentale nello studio della scienza di base del fegato, della tossicologia dei farmaci e delle infezioni epatotropiche di microbiologia dell'ospite come la malaria e i virus dell'epatite. Con una nicchia ben definita, il protocollo qui imposta un sistema di coltura per gli epatociti. Questo protocollo spinge gli epatociti maturi ad espandersi in coltura 3D con un'eterogeneità che ricapitola l'interazione cellula-cellula, la maggior parte delle funzioni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C