מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

Summary

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

Abstract

הכבד הוא האיבר הגדול ביותר ביונקים. הוא ממלא תפקיד חשוב באחסון גלוקוז, הפרשת חלבונים, חילוף חומרים וניקוי רעלים. כמוציא לפועל של רוב תפקודי הכבד, להפטוציטים ראשוניים יש יכולת התפשטות מוגבלת. זה דורש הקמת מודלים להרחבת האקס ויוו הפטוצית למחקר פיזיולוגי ופתולוגי בכבד. כאן בודדנו את הפטוציטים של מורין בשני שלבים של זלוף קולגנאז וביססנו תרבות אורגנויד תלת-ממדית כ'כבד מיני 'כדי לשחזר אינטראקציות בין תאים ותפקודים פיזיים. האורגנוידים מורכבים מאוכלוסיות תאים הטרוגניות כולל אבות והפטוציטים בוגרים. אנו מציגים את התהליך בפירוט כדי לבודד ולתרבות את הפטוציטים מורין או hepatocyte עוברי כדי ליצור organoids בתוך 2-3 שבועות ולהראות כיצד להעביר אותם על ידי צינורות מכניים למעלה ולמטה. בנוסף, נציג גם כיצד לעכל את האורגנוידים לתאים בודדים לזיהום לנטיוירוס של בנייה של שרנ"א/חוץ רחמי, טרנספקטיון siRNA והנדסת CRISPR-Cas9. האורגנוידים יכולים לשמש למסכי סמים, מידול מחלות ומחקר כבד בסיסי על ידי מידול ביולוגיה של הכבד ופתוביולוגיה.

Introduction

Organoids הם מאורגנים בעצמם, תלת מימדי (3D) באשכולות במבחנה הכוללים תאי גזע מתחדשים עצמית ותאים מובחנים מרובי ^{שושלת1,2}. האורגנוידים של איברים רבים הוקמו מתאי גזע פלוריפוטנטיים או בוגרים על ידי גורמי נישה מוגדרים היטב כולל המעי, המוח, המעי הגס, הכליה, הכבד, הלבלב, בלוטת התריס, הקיבה, העור והריאה3,4,5,6,7 . האורגנוידים מסכמים מחדש את תפקודי התא הפיזי על ידי חיקוי התפתחות (שמקורה בתאי גזע עובריים או מושרים, מחשבים אישיים) או התקדמות הומאוסטזיס/התחדשות (שמקורה בתאי גזע בוגרים, ASCs), אשר פותח אפיקים חדשים במחקר מחלות ^{וטיפול8,9}.

בתור האיבר הגדול ביותר ביונקים, הכבד אחראי בעיקר לאחסון, חילוף חומרים וניקוי רעלים. שני סוגים של סוגי תאי אפיתל, hepatocytes ו cholangiocytes, לבנות את היחידה הבסיסית של lobule כבד. Hepatocytes אחראים 70-80% של תפקוד ^הכבד10. למרות הכבד יש יכולת התחדשות יוצאת דופן, אובדן מהיר של תכונות hepatocyte קורה במהלך פולחן monolayer המסורתי על ידי קיטוב תאים dysregulated דיפרנציה, אשר מגביר את הצורך של חוקרים ורופאים לבנות מודלים כבד "גישור פער" בצלחת. עם זאת, עד לאחרונה מודלי הרחבת ex vivo מהפטוציטים ראשוניים לא היו מבוססים היטב11,12,13,14,15. אורגנוידים בכבד ניתן להקים מתאי גזע עובריים/מושרה pluripotent, המרה פיברובלסט לתאים דמויי hepatocyte, ותאים נגזר רקמות. הפיתוח של organoids כבד מגביר את היישום של מודל במבחנה עבור מסכי סמים ורעילות בכבד בדיקות ^16,17.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להקמת organoids כבד מן הפטוציטים ראשוניים מורין. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, הקמנו מערכת תרבות הפריה חוץ גופית של אורגנוידים hepatocyte עם שני זלוף של collagenase. אורגנוידים אלה ניתן לעבור להתרחבות ארוכת טווח במשך חודשים. התפקוד הפיזיולוגי שלהם עולה בקנה אחד עם hepatocytes. יתר על כן, אנו מספקים גם תיאור מפורט של כיצד לבצע מניפולציה גנטית, כגון זיהום lentivirus, התמלת siRNA, ו הנדסת CRISPR-Cas9 באמצעות organoids. התפשטות האורגנוידים של הפטוציטים שופכה אור על האפשרות להשתמש באורגנוידים כדי להבין ביולוגיה של הכבד ולפתח גישות לרפואה מותאמת אישית ותרגומית.

Protocol

כל ניסויי העכברים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת שאנדונג ובוצעו על פי הרישיון על פי הנחיות ותקנות משרד הפנים (לא. ECSBMSSDU2019-2-079).

הערה: פרוטוקול זה משמש בעיקר לתרבות אורגנוידים תלת-ממדיים מהפטיציטים ראשוניים מבודדים.

1. הקמת תרבות האורגנוידים של מורין הפטוציט

הערה: מטריצה חוץ תאית כגון מטריגל או BME משמשים כמטריצת המרתף לאורגנואידים תרבותיים. יש לאחסן את המטריצה החוץ-תאית ב-20 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותה מראש ב-4 מעלות צלזיוס או על קרח. שמור את המטריצה החוץ-תאית על קרח במהלך הניסויים. מדיום הכביסה הוא מתקדם DMEM / F12 בתוספת גלוטמקס, HEPES ופניצילין / סטרפטומיצין. אינקובטור סטנדרטי (37 °C (37 °C,5% _CO2) משמש לתרבות האורגנויד.

1. הכנת חומרים
   1. הכן את המכשירים הנדרשים לניסוי: כרית העכבר, מכשירים כירורגיים סטריליים כמו פינצטה, מספריים, צינורות ומשאבה עם קצב זרימה של 2-10 מ"ל / דקה.
   2. הכן את ריאגנטים כולל חיץ זלוף, חוצץ העיכול ולהפוך אותם סטריליים לבידוד hepatocyte. יש להוסיף קולגנאז מסוג IV טרי (0.10 מ"ג/מ"ל) ו-CaCl2 (0.50 מ') ולחמם מראש את החיץ במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
   3. הכן את המדיום המותנה כדי לייצר R-spondin 1 ואת כל הכימיקלים ואת המניות גורם צמיחה על פי הוראות היצרן.
      הערה: הימנע מהקפאה תכופה והפשרה של המדיום המותנה והמניות. מכינים את התרבות בינונית טרייה ומשתמשים בה תוך חודש. זה קריטי ליעילות יצירת האורגנויד.
2. בידוד הפטוצ'ית מורין על ידי זלוף בכבד ועיכול
   הערה: עכברים זכר או נקבה בין הגילאים 12 שבועות ו 6 חודשים שימשו לתרבות organoid. לא נמצאו הבדלים ברורים ביעילות היווצרות האורגנויד מעידן העכבר התורם בטווח זה.
   1. המתת חסד את העכבר בשיטה מאושרת מבחינה אתית.
   2. תקן את העכבר על כרית העכבר ונקה את פרוות הבטן והעור עם 70% אלכוהול. לחשוף את הבטן ולהרים את הכבד מעל שאר הגוף. לעשות חבטה בקו האמצע כדי לחשוף את הכבד.
   3. מלאו את הצינור המחובר למשאבה במאגר זלוף. הפוך חותך של וריד הפורטל (על 1/3 של קוטר הווריד) ולהניח בזהירות קטטר לתוכו. הרם את איברי העיכול כדי לעזור להכניס את הצינורית. עניבה עם הקו הכירורגי היא אופציונלית כדי למנוע החלקה החוצה וקרע.
   4. התחל את המשאבה ולבצע זלוף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה עם חיץ זלוף. אם הכבד הופך חיוור מיד, לחתוך את הוועד הנתון הנחות כדי לאפשר חוצץ זלוף לזרום דרך הכבד כולו ולהוציא את הדם.
   5. כאשר הזרימה החוצה הופכת נקייה, הסר את הצינורית. זה לוקח בערך 5-10 דקות.
   6. שנה את חיץ זלוף עם חיץ עיכול מחומם מראש בקצב של 5 מ"ל / דקה. אין לעצור את המשאבה עד שהכבד הופך רך ומתנפח. הסר את הצנתר כאשר הכבד מפסיק נפיחות.
      הערה: חשוב מאוד לשמור על זמן עיכול תקין כדי למנוע עיכול מוגזם ולקבל תאי כבד בודדים.
   7. חותכים את הכבד ומניחים אותו בצלחת 100 מ"מ מלאה ב 15 מ"ל של שטיפה קרה בינונית. חותכים את הרצועות עם מספריים קטנים. לקרוע את הכבד לחתיכות עם טיפים פיפטה או מלקחיים.
   8. Pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי לשחרר את התאים עד המאגר רווי בתאים (12-15 פעמים). יוצקים את ההשעיה לתא לתוך צינור 50 מ"ל דרך מסנני 70 מיקרומטר.
   9. צנטריפוגה במשך 1-3 דקות ב 50 x g ו 4 °C (5 °F). דקאנט סופר-טבעי. לחלופין, resuspend התאים עם לשטוף בינוני או resuspend התאים עם מדיום תרבית ישירות. תספור את התאים עם המציטומיטר.
   10. להבחין בין תאים חיים או מתים על ידי מכונת מונה התא לאחר כתמי צבע תא חי.
       הערה: עדיף לטהר hepatocytes באמצעות קר 40% פרקול. לאחר שלב זה, hepatocytes קיימא יהיה בתחתית הצינורות.
3. תרבות אורגניואידית ומעבר
   1. הסר את supernatant ו resuspend את hepatocytes עם תערובת של מטריצה חוץ תאית ומדיום תרבות ביחס של 3:1.
      הערה: 10,000-20,000 תאים בתערובת 50-60 μL לבאר עבור צלחת 24-well מומלץ. חשוב לעבוד במהירות ולשמור את התערובת על קרח לאורך כל התהליך. 200-500 organoids יכול להיווצר בריכוז זה.
   2. מוסיפים את טיפת התא/התערובת על הצלחת עם טיפות קטנות כדי למנוע מהטיפה להתחבר יחד. לדגור את הצלחת באינקובטור התא ב 37 °C (5 °F), 5% _CO2 במשך 5-10 דקות ולאחר מכן להוציא את הצלחת במשך 20-25 דקות עד מטריצה חוץ תאית הופך מוצק.
   3. מוסיפים מדיום תרבות (500 μL לבאר עבור צלחת 24-well) לתוך בארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור לתרבות האורגנויד. לשנות את המדיום כל 3-4 ימים. שימו לב לאורגנואידים עד שהם גדולים מספיק כדי לעבור.
      הערה: קוטר עם סביב 400-500 מיקרומטר מתאים למעבר של organoids hepatocyte.
   4. לבודד organoids מן המטריצה החוץ תאית עם התהליך המפורט להלן. החזק פיפטת פסטר זכוכית בלהבה כדי לצמצם את הצמצם שלה (על ידי ~ 1/2). באופן מכני pipette למעלה ולמטה 5-10 פעמים כדי לנתק את organoids לתוך organoids קטן יותר במהלך passaging.
      הערה: במהלך המעבר, להכין טיפים micropipette שטוף מראש צינורות עם חוצץ לשטוף קצה כדי למנוע אובדן organoids דבק צינורות או טיפים.

2. מניפולציה גנטית של אורגנוידים הפטוציטים מורין

1. תאים בודדים מאורגנואידים של הפטוציטים
   1. הוסף 500 μL של קר לשטוף בינוני / פתרון שחזור תא לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה כדי להרוס את תערובת המטריצה החוץ תאית/תאית עם מיקרופיפט ולאחר מכן להעביר את ההשעיה האורגנוידית לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל על קרח. לחלופינית, להפוך את הצינור למעלה ולמטה מעת לעת כדי להפשיר את התערובת ביסודיות.
   2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500-800 x g ו 4 °C (7 °F) להשליך את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של פתרון טריפסין לכדור ולצינור אותו לערבב. דגירה ב 37 °C (5-10 דקות) ולאחר מכן להפסיק את העיכול על ידי הוספת נפח 2x של לשטוף בינוני.
   3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 800 x g ו 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant. resuspend הכדור עם מדיום תרבית ולספור את התאים באמצעות hemacytometer.
2. תעתיק siRNA או plasmid
   הערה: organoids קטן יותר עם קוטר של פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte הם transfected עם siRNA באמצעות Lipofectamine או plasmids באמצעות ריאגנט transfection על פי הוראות היצרן.
   1. מערבבים siRNA או פלסמידים עם ריאגנט טרנספקטיון. הוסף תאים בודדים מאורגנואידים ותערובת ליפופקטמין-RNA/ליפו-פלסמיד (למשל, RNAiMAX) ל-1-2 בארות בצלחת 24-well וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-500 x גרם ו-32 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לדגור את הצלחת באינקובטור במשך 4-5 שעות ב 37 °C (77 °F).
   2. לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבית בריכוז של 10,000 תאים לבאר. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
3. זיהום לנטיוויראלי
   הערה: organoids קטן עם קוטר פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte נגועים lentivirus באמצעות ריאגנטים זיהום בינוני על פי הוראות היצרן.
   1. לערבב 250 μL של השעיית תא יחיד מן organoid ו 250 μL של חלקיקים ויראליים בצינור 1.5 מ"ל.
   2. צלחת את התערובת צנטריפוגה במשך 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (70 °F). דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
   3. לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבות. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
4. הנדסה גנטית מאת CRISPR/Cas9
   הערה: אנו מספקים וידאו עבור ביצועים אלה בחומרים משלימים. תאים בודדים מאורגנואידים נדבקו בלנטיוירוס או הועברו על ידי פלסמידים שנשאו sgRNA ו- Cas9.
   1. לעכל תאים בודדים מן האורגנוידים hepatocyte תרבית ומעבר על פי השיטה לעיל.
   2. להדביק תאים בודדים עם sgRNA באמצעות Opti-MEM בינוני ריאגנטים זיהום על פי הוראות היצרן.
   3. לערבב 250 μL של השעיה של תא יחיד ו 250 μL של חלקיקים ויראליים יחד בצינור 1.5 מ"ל.
   4. צנטריפוגות תערובת 500 μL עבור 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (5 °F) ולאחר מכן דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
   5. לאסוף את השעיית התא וזרע במטריצה חוץ תאית. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.

תוצאות

האורגנוידים הפטוציטים מנקבה אלב-Cre; עכבר Rosa26-GFP (8 שבועות) נצפו חמישה ימים לאחר זריעה (איור 1A). האורגנוידים מתרבים עם כתמים חיוביים של Ki67 (איור 1B). ביטוי מפריע של גנים מייצגים באורגנוידים hepatocyte או על ידי transfection siRNA או זיהום lentivirus נבדק על ידי qRT-PCR ו כתם מערבי. התוצ?...

Discussion

היכולת לתרבות הפטוסיטים בוגרים לאורך תקופות ארוכות היא בסיסית בחקר מדע בסיסי בכבד, טוקסיקולוגיה של תרופות וזיהומים של פונדקאי-מיקרוביולוגיה הפטטרופית כגון מלריה ווירוסי הפטיטיס. עם נישה מוגדרת היטב, הפרוטוקול כאן מקים מערכת תרבות להפטוציטים. פרוטוקול זה מניע hepatocytes בוגרים להתרחב בתרבות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C