Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

Resumo

Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

Resumo

O fígado é o maior órgão em mamíferos. Desempenha um papel importante no armazenamento de glicose, secreção de proteínas, metabolismo e desintoxicação. Como executor da maioria das funções hepáticas, hepatócitos primários têm capacidade de proliferação limitada. Isso requer o estabelecimento de modelos de expansão de hepatócitos ex vivo para pesquisa fisiológica e patológica hepática. Aqui, isolamos hepatócitos murinos por dois passos de perfusão de colagenase e estabelecemos uma cultura organoide 3D como o "mini-fígado" para recapitular interações célula-células e funções físicas. Os organoides consistem em populações de células heterogêneas, incluindo progenitores e hepatócitos maduros. Introduzimos o processo de forma detalhada para isolar e cultivar os hepatócitos murinos ou hepatócitos fetais para formar organoides dentro de 2-3 semanas e mostrar como passá-los mecanicamente tubos para cima e para baixo. Além disso, também introduziremos como digerir os organoides em células únicas para infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9. Os organoides podem ser usados para telas de drogas, modelagem de doenças e pesquisa hepática básica, modelando biologia hepática e patobiologia.

Introdução

Organoides são aglomerados in vitro auto-organizados, tridimensionais (3D) que incluem células-tronco auto-renovadores e células diferenciadas multi-linhagem1,2. Os organoides de muitos órgãos foram estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes ou adultas por fatores de nicho bem definidos, incluindo o intestino, o cérebro, o cólon, o rim, o fígado, o pâncreas, a tireoide, o estômago, a pele e o pulmão3,4,5,6,7 . Os organoides recapitulam funções celulares físicas imitando o desenvolvimento (originário de células-tronco pluripotentes embrionárias ou induzidas, PSCs) ou progressão de homeostase/regeneração (originária de células-tronco adultas, ASCs), o que abre novos caminhos na pesquisa e terapia de ^doenças8,9.

Como o maior órgão dos mamíferos, o fígado é o principal responsável pelo armazenamento, metabolismo e desintoxicação. Dois tipos de células epiteliais, hepatócitos e cholangiocitos, constroem a unidade básica de um lobule hepático. Hepatócitos são responsáveis por 70-80% da função ^hepática10. Embora o fígado tenha notável capacidade de regeneração, a perda rápida de características hepatócidas acontece durante a cultura tradicional de monocamadas por polarização celular disregulada e dediferenciação, o que aumenta a necessidade de pesquisadores e médicos construirem modelos hepáticos de "ponte de lacunas" em um prato. No entanto, até recentemente, os modelos de expansão ex vivo dos hepatócitos primários não tinham sido bem estabelecidos11,12,13,14,15. Organoides hepáticos podem ser estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias/induzidas, conversão de fibroblasto em células semelhantes a hepatócitos e células derivadas de tecidos. O desenvolvimento de organoides hepáticos aumenta a aplicação de um modelo in vitro para telas de drogas e ensaios de toxicidade ^{hepática16,17}.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para estabelecer organoides hepáticos de hepatócitos primários murinas. Usando este protocolo, criamos um sistema de cultura in vitro de organoides hepatocitos com duas perfusões de colagemnase. Esses organoides podem ser aprovados para expansão a longo prazo por meses. Sua função fisiológica é altamente consistente com hepatócitos. Além disso, também fornecemos uma descrição detalhada de como realizar manipulação genética, como infecção por lentivírus, transdução de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9 usando organoides. A propagação de organoides hepatocitos esclareceu a possibilidade de usar organoides para entender a biologia hepática e desenvolver abordagens personalizadas e translacionais de medicina.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Shandong e foram realizados de acordo com a Licença sob as diretrizes e regulamentos do Home Office (No. ECSBMSSDU2019-2-079).

NOTA: Este protocolo é usado principalmente para cultivar organoides 3D de hepatócitos primários isolados.

1. Estabelecimento da Cultura Organoide Hepatocito Murine

NOTA: Matriz extracelular como Matrigel ou BME são usadas como matriz de porão para cultura organoides. Armazene a matriz extracelular a -20 °C e pré-descongele a 4 °C ou no gelo. Mantenha a matriz extracelular no gelo durante os experimentos. O meio de lavagem é Avançado DMEM/F12 complementado com GlutaMAX, HEPES e penicilina/estreptomicina. Uma incubadora padrão (37 °C, atmosfera umidificada, 5% _CO2) é usada para cultura organoide.

1. Preparação de materiais
   1. Prepare os instrumentos necessários para o experimento: o travesseiro do rato, instrumentos cirúrgicos estéreis como pinça, tesoura, tubos e uma bomba com uma taxa de fluxo de 2-10 mL/min.
   2. Prepare os reagentes, incluindo o tampão de perfusão, o tampão de digestão e torná-los estéreis para o isolamento do hepatocitado. Adicione colagenase tipo IV fresco (0,10 mg/mL) e _CaCl2 (0,50 M) e pré-aqueça o tampão a 37 °C em banho-maria.
   3. Prepare o meio condicional para produzir R-spondin 1 e todos os estoques de fatores químicos e de crescimento de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Evite congelar e descongelar com frequência o meio condicional e os estoques. Prepare o meio de cultura fresco e use-o dentro de um mês. Isso é fundamental para a eficiência organoide.
2. Isolamento hepatócito murino por perfusão hepática e digestão
   NOTA: Camundongos machos ou fêmeas entre 12 semanas e 6 meses foram utilizados para a cultura organoide. Não foram encontradas diferenças óbvias na eficiência da formação organoide da idade do rato doador nessa faixa.
   1. Eutanize o rato com um método eticamente aprovado.
   2. Conserte o rato no travesseiro do rato e limpe a pele e a pele abdominal com 70% de álcool. Exponha o abdômen e levante o fígado acima do resto do corpo. Faça uma incisão no meio da linha para expor o fígado.
   3. Encha o tubo ligado à bomba com tampão de perfusão. Faça uma incisão da veia portal (cerca de 1/3 do diâmetro da veia) e coloque cuidadosamente um cateter nele. Levante os órgãos digestivos para ajudar a inserir a cânula. Uma gravata com a linha cirúrgica é opcional para evitar deslizar para fora e romper.
   4. Inicie a bomba e realize a perfusão a uma vazão de 5-7 mL/min com tampão de perfusão. Se o fígado ficar pálido imediatamente, corte a veia cava inferior para permitir que o tampão de perfusão flua através de todo o fígado e expulse o sangue.
   5. Quando o fluxo ficar limpo, remova a cânula. Leva cerca de 5-10 minutos.
   6. Altere o tampão de perfusão com tampão de digestão pré-aquecido a uma taxa de 5 mL/min. Não pare a bomba até que o fígado fique macio e incha. Remova o cateter quando o fígado parar de inchar.
      NOTA: É muito importante manter o tempo adequado de digestão para evitar a digestão excessiva e obter células hepáticas únicas.
   7. Corte o fígado e coloque-o em uma placa de 100 mm cheia com 15 mL de meio de lavagem a frio. Corte os ligamentos com uma tesoura pequena. Rasgue o fígado em pedaços com pontas de pipeta ou fórceps.
   8. Pipeta para cima e para baixo suavemente para liberar as células até que o buffer esteja saturado com células (12-15 vezes). Despeje a suspensão da célula em um tubo de 50 mL através de filtros de 70 μm.
   9. Centrifugar por 1-3 minutos a 50 x g e 4 °C. Decantar o supernatante. Opcionalmente, resuspensar as células com meio de lavagem ou resuspensar as células com meio de cultura diretamente. Conte as células com um hemacytómetro.
   10. Distinguir células vivas ou mortas pela máquina de contador celular após coloração de tingimento de células vivas.
       NOTA: É melhor purificar hepatócitos usando percoll frio de 40%. Após esta etapa, hepatócitos viáveis estarão na parte inferior dos tubos.
3. Cultura organoide e passagem
   1. Remova o supernatante e resuspende os hepatócitos com uma mistura de matriz extracelular e meio de cultura em uma razão de 3:1.
      NOTA: Recomenda-se 10.000-20.000 células em uma mistura de 50-60 μL por poço para uma placa de 24 poços. É importante trabalhar rapidamente e manter a mistura no gelo durante todo o processo. 200-500 organoides poderiam ser formados nesta concentração.
   2. Adicione a gota celular/mistura na placa com pequenas gotículas para evitar que a gota se conecte. Incubar a placa na incubadora celular a 37 °C, 5% de _CO2 por 5-10 min e, em seguida, retirar a placa por 20-25 min até que a matriz extracelular se torne sólida.
   3. Adicione meio de cultura (500 μL por poço para uma placa de 24 poços) nos poços e devolva a placa à incubadora para cultura organoide. Troque o meio a cada 3-4 dias. Observe os organoides até que sejam grandes o suficiente para serem passagemdos.
      NOTA: Um diâmetro com cerca de 400-500 μm é adequado para a passagem de organoides hepatocitados.
   4. Isolar organoides da matriz extracelular com o processo detalhado abaixo. Segure uma pipeta pasteur de vidro em uma chama para estreitar sua abertura (por ~1/2). Pipeta mecanicamente para cima e para baixo 5-10 vezes para dissociar os organoides em organoides menores durante a passagem.
      NOTA: Durante a passagem, prepare pontas e tubos de micropipette pré-lavados com tampão de lavagem de ponta para evitar a perda de organoides grudados nos tubos ou pontas.

2. Manipulação genética de organoides hepatocitados de murina

1. Células únicas de organoides hepatocitos
   1. Adicione 500 μL de solução de recuperação de lavagem a frio/célula para cada poço. Pipeta para cima e para baixo para destruir a mistura de matriz celular/extracelular com uma micropipette e, em seguida, transferir a suspensão organoide para um tubo centrífuga de 15 mL no gelo. Opcionalmente, gire o tubo para cima e para baixo de tempos em tempos para descongelar bem a mistura.
   2. Centrifugar por 5 min a 500-800 x g e 4 °C e descartar o supernatante. Adicione 1 mL de solução de trippsina à pelota e pipeta-a para misturar. Incubar a 37 °C por 5-10 min e, em seguida, parar de digestão adicionando um volume de 2x de meio de lavagem.
   3. Centrifugar por 5 min a 800 x g e 4 °C e descartar o supernaspeso. Resuspenda a pelota com meio de cultura e conte as células usando um hemacytómetro.
2. siRNA ou transfecção plasmida
   NOTA: Organoides menores com diâmetro inferior a 50 μm ou células únicas de organoides hepatocitados são transfecidos com siRNA usando lipofectamina ou plasmídeos usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Misture siRNA ou plasmídeos com reagente de transfecção. Adicione células únicas de organoides e a mistura Lipofectamina-RNA/Lipo-plasmid (por exemplo, RNAiMAX) em 1-2 poços na placa de 24 poços e centrífuga por 1 h a 500 x g e 32 °C. Após a centrifugação, incubar a placa na incubadora por 4-5 h a 37 °C.
   2. Coletar as células e sementes em matriz extracelular com meio de cultura a uma concentração de 10.000 células por poço. Altere o meio para a condição de seleção dois dias após a transfecção. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.
3. Infecção lentiviral
   NOTA: Pequenos organoides com diâmetro inferior a 50 μm ou células únicas de organoides hepatocitados são infectados por lentivírus usando reagentes infecções médios de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Misture 250 μL da suspensão unicelular do organoide e 250 μL de partículas virais em um tubo de 1,5 mL.
   2. Emplaque a mistura e centrífuga por 1h a 500 x g e 32 °C. Incubar por 4-5 h a 37 °C.
   3. Recolher as células e sementes em matriz extracelular com meio de cultura. Altere o meio para a condição de seleção dois dias após a transfecção. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.
4. Engenharia genética por CRISPR/Cas9
   NOTA: Fornecemos vídeo para este desempenho nos materiais suplementares. Células únicas de organoides foram infectadas com lentivírus ou transfectadas por plasmídeos portadores de sgRNA e Cas9.
   1. Digestão de células únicas de organoides hepatocitos cultivados e passagem de acordo com o método acima.
   2. Infecte células individuais com sgRNA usando reagentes médios e infecciosos Opti-MEM de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Misture 250 μL de uma suspensão unicelular e 250 μL de partículas virais em um tubo de 1,5 mL.
   4. Centrifugar a mistura de 500 μL por 1h a 500 x g e 32 °C e, em seguida, incubar por 4-5 h a 37 °C.
   5. Recolher a suspensão celular e a semente em matriz extracelular. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.

Resultados

Os organoides hepatocits do fêmea Alb-Cre; O rato Rosa26-GFP (8 semanas) foi observado cinco dias após a semeadura (Figura 1A). Os organoides estão proliferando com a coloração positiva ki67 (Figura 1B). A expressão de interferência de genes representativos em organoides hepatocitos, seja por transfecção de sirna ou infecção por lentivírus, foi examinada por qRT-PCR e mancha ocidental. Os resultados são mostrados nas Figuras 2A<...

Discussão

A capacidade de cultivar hepatócitos maduros por longos períodos é fundamental no estudo da ciência básica hepática, toxicologia medicamentosa e infecções hepatotrópicos de microbiologia hospedeira, como malária e vírus da hepatite. Com um nicho bem definido, o protocolo aqui cria um sistema de cultura para hepatócitos. Este protocolo leva hepatócitos maduros a expandir-se na cultura 3D com uma heterogeneidade que recapitula a interação célula-célula, a maioria da função hepatocita e modificações gen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C