小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

摘要

从小鼠肝细胞建立了长期 的体外 3D类器官培养系统。这些类器官可以通过shRNA/异位构建的慢病毒感染，siRNA转染和CRISPR-Cas9工程进行遗传和遗传操纵。

摘要

肝脏是哺乳动物最大的器官。它在葡萄糖储存，蛋白质分泌，代谢和解毒中起重要作用。作为大多数肝功能的执行者，原代肝细胞的增殖能力有限。这就需要建立 离体 肝细胞扩增模型，用于肝脏生理和病理研究。在这里，我们通过两步胶原酶灌注分离小鼠肝细胞，并建立了3D类器官培养物作为"迷你肝脏"，以概括细胞 - 细胞相互作用和物理功能。类器官由异质细胞群组成，包括祖细胞和成熟肝细胞。我们详细介绍了分离和培养小鼠肝细胞或胎儿肝细胞在2-3周内形成类器官的过程，并展示了如何通过机械上下移液来通过它们。此外，我们还将介绍如何将类器官消化成单细胞，用于shRNA/异位构建的慢病毒感染，siRNA转染和CRISPR-Cas9工程。类器官可用于药物筛选，疾病建模和基础肝脏研究，通过模拟肝脏生物学和病理生物学。

引言

类器官是自组织的三维（3D） 体外 簇，包括自我更新的干细胞和多系分化细胞^1，2。许多器官的类器官已经通过明确定义的利基因素从多能或成体干细胞中建立，包括肠道，大脑，结肠，肾脏，肝脏，胰腺，甲状腺，胃，皮肤和肺^{3，4，5，6，7}.类器官通过模仿发育（源自胚胎或诱导多能干细胞，PSC）或稳态/再生进展（源自成体干细胞，ASCs）来概括物理细胞功能，这为疾病研究和治疗开辟了新的途径^8，9。

作为哺乳动物最大的器官，肝脏主要负责储存，代谢和解毒。两种上皮细胞类型，肝细胞和胆管细胞，构建肝小叶的基本单位。肝细胞负责70-80%的肝功能¹⁰。虽然肝脏具有显着的再生能力，但在传统的单层培养过程中，肝细胞特征的快速丧失发生在失调的细胞极化和去分化，这增加了研究人员和临床医生在培养皿中建立"间隙桥接"肝脏模型的需求。然而，直到最近，来自原代肝细胞的 离体 扩增模型尚未得到很好的建立^{11，12，13，14，15}。肝脏类器官可以从胚胎/诱导多能干细胞、成纤维细胞转化为肝细胞样细胞和组织衍生细胞中建立。肝脏类器官的发展促进了体外模型在药物筛选和肝毒性测定中的应用^16，17。

在这里，我们描述了从小鼠原发性肝细胞建立肝脏类器官的详细方案。通过使用该协议，我们建立了具有两种胶原酶灌注的肝细胞类器官的 体外 培养系统。这些类器官可以长期扩增数月。它们的生理功能与肝细胞高度一致。此外，我们还详细介绍了如何使用类器官进行遗传操作，例如慢病毒感染，siRNA转导和CRISPR-Cas9工程。肝细胞类器官的繁殖揭示了使用类器官来理解肝脏生物学并开发个性化和转化医学方法的可能性。

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研究方案

所有小鼠实验均经山东大学基础医学院动物护理与使用委员会批准，并根据内政部指南和规定（No.ECSBMSSDU2019-2-079）。

注意:该方案主要用于从分离的原代肝细胞中培养3D类器官。

1. 建立小鼠肝细胞类器官培养

注意:细胞外基质（如基质胶或BME）用作培养类器官的基底基质。将细胞外基质储存在-20°C，并在4°C或冰上预解冻。在实验过程中将细胞外基质保持在冰上。洗涤培养基是高级DMEM / F12，补充了GlutaMAX，HEPES和青霉素/链霉素。标准培养箱（37°C，加湿气氛，5%CO ₂）用于类器官培养。

1. 材料准备
   1. 准备实验所需的器械:鼠标枕，无菌手术器械，如镊子，剪刀，管子和流速为2-10 mL / min的泵。
   2. 准备试剂，包括灌注缓冲液，消化缓冲液，并使其无菌以进行肝细胞分离。加入新鲜的IV型胶原酶（0.10mg / mL）和_CaCl2 （0.50 M），并在水浴中将缓冲液预热至37°C。
   3. 根据制造商的说明准备条件培养基以生产R-spondin 1以及所有化学和生长因子库存。
      注意:避免频繁冻结和解冻有条件的培养基和高汤。新鲜准备培养基，并在一个月内使用。这对于类器官形成效率至关重要。
2. 通过肝脏灌注和消化分离小鼠肝细胞
   注意:年龄在12周至6个月之间的雄性或雌性小鼠用于类器官培养。在此范围内，与供体小鼠年龄相比，类器官形成效率没有发现明显差异。
   1. 用道德认可的方法对老鼠实施安乐死。
   2. 将鼠标固定在鼠标枕头上，用70%的酒精清洁腹部毛皮和皮肤。暴露腹部，将肝脏提升到身体其他部位以上。做一个中线切口以暴露肝脏。
   3. 用灌注缓冲液填充连接到泵的管子。做一个门静脉切口（约静脉直径的1/3），并小心地将导管插入其中。抬起消化器官以帮助插入插管。与手术线的系带是可选的，以避免滑出和破裂。
   4. 启动泵，用灌注缓冲液以 5-7 mL/min 的流速进行灌注。如果肝脏立即变白，切除下腔静脉，让灌注缓冲液流过整个肝脏并将血液排出。
   5. 当流出物变得干净时，取出套管。大约需要5-10分钟。
   6. 用预热的消化缓冲液以5 mL / min的速率改变灌注缓冲液。不要停止泵，直到肝脏变软和肿胀。当肝脏停止肿胀时，取出导管。
      注意:保持适当的消化时间以避免过度消化并获得单个肝细胞非常重要。
   7. 切掉肝脏并将其置于充满15 mL冷洗介质的100毫米板中。用小剪刀剪断韧带。用移液器吸头或镊子将肝脏撕成碎片。
   8. 轻轻地上下移液以释放细胞，直到缓冲液被细胞饱和（12-15次）。通过70μm过滤器将细胞悬浮液倒入50mL管中。
   9. 在50× g 和4°C下离心1-3分钟。 倾析上清液。或者，用洗涤培养基重悬细胞或直接用培养基重悬细胞。用血细胞计数器计数细胞。
   10. 活细胞染料染色后，通过细胞计数器区分活细胞或死细胞。
       注意:最好使用冷的40%Percoll纯化肝细胞。在此步骤之后，活的肝细胞将位于管的底部。
3. 类器官培养和传代
   1. 除去上清液，并以3:1的比例将细胞外基质和培养基的混合物重悬肝细胞。
      注意:对于24孔板，建议在每孔50-60μL混合物中加入10，000-20，000个细胞。重要的是要快速工作，并在整个过程中将混合物保持在冰上。在这种浓度下可以形成200-500个类器官。
   2. 将细胞/混合物滴加入带有小液滴的平板上，以防止液滴连接在一起。将板在37°C，5%CO ₂ 的细胞培养箱中孵育5-10分钟，然后将板取出20-25分钟，直到细胞外基质变为固体。
   3. 将培养基（24孔板每孔500μL）加入孔中，并将板返回培养箱进行类器官培养。每3-4天更换一次培养基。观察类器官，直到它们足够大，可以传代。
      注意:直径约为400-500μm适合肝细胞类器官的通过。
   4. 使用下面的详细过程从细胞外基质中分离出类器官。将玻璃巴斯德移液器放在火焰中以缩小其孔径（约1/2）。机械地上下移液5-10次，以在传代过程中将类器官解离成更小的类器官。
      注意:在传代过程中，准备预洗的微量移液管尖端和带有尖端洗涤缓冲液的管子，以避免器官粘附在管子或尖端上。

2. 小鼠肝细胞类器官的遗传操作

1. 来自肝细胞类器官的单细胞
   1. 向每个孔中加入500μL冷洗培养基/细胞回收溶液。用微量移液管上下移液以破坏细胞/细胞外基质混合物，然后将类器官悬浮液转移到冰上的15mL离心管中。或者，不时上下转动管子以彻底解冻混合物。
   2. 在500-800× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入1mL胰蛋白酶溶液，并移取以混合。在37°C下孵育5-10分钟，然后通过加入2倍体积的洗涤介质停止消化。
   3. 在800×g和4°C下离心5分钟，弃去上清液。用培养基重悬沉淀并使用血细胞计数器计数细胞。
2. siRNA 或质粒转染
   注意:根据制造商的说明，使用脂质酰胺转染直径小于50μm的较小类器官或来自肝细胞类器官的单细胞或使用转染试剂的质粒转染siRNA。
   1. 将siRNA或质粒与转染试剂混合。将来自类器官的单细胞和脂质素-RNA/脂质粒混合物（例如RNAiMAX）加入24孔板中的1-2孔中，并在500×g和32°C下离心1小时。 离心后，将板在37°C下在培养箱中孵育4-5小时。
   2. 将细胞和种子收集在细胞外基质中，培养基浓度为每孔10，000个细胞。转染后两天将培养基更换为选择条件。评估10天后类器官形成效率。
3. 慢病毒感染
   注意:直径小于50μm的小类器官或来自肝细胞类器官的单细胞根据制造商的说明使用感染试剂培养基感染慢病毒。
   1. 将来自类器官的250μL单细胞悬浮液和250μL病毒颗粒混合在1.5mL管中。
   2. 将混合物平板并在500×g和32°C下离心1小时。 在37°C下孵育4-5小时。
   3. 用培养基将细胞和种子收集在细胞外基质中。转染后两天将培养基更换为选择条件。评估10天后类器官形成效率。
4. CRISPR/Cas9的基因工程
   注:我们在补充材料中提供了此性能的视频。来自类器官的单细胞感染慢病毒或被携带sgRNA和Cas9的质粒转染。
   1. 根据上述方法从肝细胞类器官中消化单细胞并传代。
   2. 根据制造商的说明，使用 Opti-MEM 培养基和感染试剂用 sgRNA 感染单个细胞。
   3. 将250μL单细胞悬浮液和250μL病毒颗粒混合在1.5mL管中。
   4. 将500μL混合物在500×g和32°C下离心1小时，然后在37°C下孵育4-5小时。
   5. 收集细胞悬浮液并在细胞外基质中播种。评估10天后类器官形成效率。

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结果

来自女性Alb-Cre的肝细胞类器官;在播种后五天观察Rosa26-GFP小鼠（8周）（图1A）。类器官随着Ki67阳性染色而增殖（图1B）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹检查通过siRNA转染或慢病毒感染在肝细胞类器官中代表性基因的干扰表达。结果如图 2A 和 2B所示。 图2C 显示了用RSL-3和CRISPR / Cas9基因组文库筛选治疗14?...

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讨论

长期培养成熟肝细胞的能力是研究肝脏基础科学，药物毒理学和嗜肝性宿主微生物学感染（如疟疾和肝炎病毒）的基础。通过明确定义的生态位，这里的方案为肝细胞建立了一个培养系统。该协议驱动成熟肝细胞在3D培养物中扩增，具有异质性，概括了细胞 - 细胞相互作用，大多数肝细胞功能和遗传修饰，允许设计基因功能研究和新的治疗途径进行再生治疗。

高质量的肝细?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C