استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان

Summary

تم استخدام طريقة زراعة الأعضاء من نوع Trowell لكشف شبكات الإشارات المعقدة التي تحكم نمو الأسنان ، ومؤخرا ، لدراسة التنظيم الذي ينطوي عليه الخلايا الجذعية لقاطعة الفأر التي تنمو باستمرار. تسهل النماذج الحيوانية الفلورية وطرق التصوير الحي التحليلات المتعمقة للخلايا الجذعية للأسنان وبيئتها المكروية المتخصصة.

Abstract

يعتمد نمو الأعضاء ووظيفتها وتجديدها على الخلايا الجذعية ، والتي تتواجد داخل مساحات تشريحية منفصلة تسمى منافذ الخلايا الجذعية. توفر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. توجد الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة الظهارية للقاطعة في الطرف القريب من السن في مكان يسمى حلقة عنق الرحم. أنها توفر تدفقا مستمرا للخلايا لموازنة التآكل المستمر لطرف السن ذاتي الشحذ. يظهر هنا بروتوكول مفصل لعزل وثقافة الطرف القريب من قاطعة الفأر التي تضم الخلايا الجذعية ومكانتها. هذا هو بروتوكول زراعة الأعضاء المعدل من نوع Trowell الذي يتيح زراعة قطع الأنسجة في المختبر (explants) ، بالإضافة إلى شرائح الأنسجة السميكة في واجهة السائل / الهواء على مرشح مدعوم بشبكة معدنية. يتيح بروتوكول زراعة الأعضاء الموصوف هنا التلاعب بالأنسجة غير الممكنة في الجسم الحي ، وعندما يقترن باستخدام مراسل (مراسلين) فلوري ، فإنه يوفر منصة لتحديد وتتبع مجموعات الخلايا المنفصلة في الأنسجة الحية بمرور الوقت ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. يمكن اختبار الجزيئات التنظيمية المختلفة والمركبات الدوائية في هذا النظام لتأثيرها على الخلايا الجذعية ومنافذها. يوفر هذا في النهاية أداة قيمة لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية وصيانتها.

Introduction

تنمو قواطع الفأر باستمرار بسبب الحفاظ مدى الحياة على الخلايا الجذعية (SC) التي تدعم الإنتاج المستمر لمكونات الأسنان. وتشمل هذه SCs الظهارية ، التي تولد الأرومات المينائية المنتجة للمينا ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تولد الأرومات السنية المنتجة للعاج ، من بين خلايا أخرى¹. تم تحديد SCs الظهارية في القواطع المتنامية باستمرار في البداية على أنها خلايا تحتفظ بالتسمية ^2,3 ومنذ ذلك الحين ثبت أنها تعبر عن عدد من جينات الجذعية المعروفة ، بما في ذلك Sox2⁴. تشترك هذه الخلايا في سمات مشتركة مع SCs الظهارية في الأعضاء الأخرى وتتواجد داخل مكانة SC تسمى حلقة عنق الرحم الموجودة على الجانب الشفوي من القاطعة. المكانة هي كيان ديناميكي يتكون من خلايا ومصفوفة خارج الخلية تتحكم في نشاط SC⁵. أظهرت دراسات تتبع النسب أن Sox2+ SCs الظهارية يمكنها تجديد المقصورة الظهارية بأكملها من السن وأنها ضرورية لتشكيل الأسنان المتتالية ^6,7. يتم تجنيد MSCs ذات إمكانات إصلاح العاج أو التجدد إلى حد كبير من خارج العضو من خلال الأوعية الدموية والأعصاب⁸،⁹،¹⁰،¹¹ ، وبالتالي ^، توفير نموذج مناسب لدراسة التوظيف والهجرة والإسكان لسكان MSC.

إن دراسة SCs في الجسم الحي ليست ممكنة دائما ، لأن العديد من التلاعب الجيني و / أو الدوائي يمكن أن يؤثر على توازن الأعضاء و / أو يكون له عواقب مميتة. لذلك ، توفر زراعة الأعضاء أداة ممتازة لدراسة تنظيم SCs ومنافذها في المختبر. تم تطوير نظام زراعة الأعضاء الذي يستخدم شبكة معدنية في البداية بواسطة Trowell¹² لدراسة تطور الأعضاء وتم تعديله بواسطة Saxen¹³ لدراسة الإشارات الاستقرائية في تطور الكلى. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه الطريقة في المختبر لزراعة كل أو جزء من العضو بنجاح في مجالات مختلفة. في مجال تطور الأسنان ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأسنان¹⁴ وتشكيل الأسنان المتتالية¹⁵. أظهر عمل مختبر Thesleff فائدة هذا النظام للتحليل الزمني لنمو الأسنان وتكوينها ، لتحليل تأثير الجزيئات المختلفة وعوامل النمو على نمو الأسنان ، وللتصوير الحي بفاصل زمني لتطور الأسنان^16,17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تنظيم SCs القاطعة ومكانتها¹⁸،^{19 ،} والتي تم وصفها بالتفصيل هنا.

Protocol

يتضمن هذا البروتوكول استخدام الحيوانات وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان الأخلاقية المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها ومرفق الحيوانات في جامعة هلسنكي.

1. إعداد طبق ثقافة الجهاز

1. تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء التدفق الصفحي. نظف أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم أدوات وحلول الزجاج المعقم. تعقيم المقص والمعدات المعدنية الأخرى في معقم حبة زجاجية.
2. قم بإعداد المرشحات المخزنة عادة في 70٪ من الإيثانول عن طريق غسلها ثلاث مرات في 1x PBS لإزالة الإيثانول (الشكل 1). قطع المرشحات إلى قطع مستطيلة (3 × 3-5 × 5 مم).
   ملاحظة: يمكن تخزين قطع الفلتر المغسولة لعدة أيام في 1x PBS عند 4 درجات مئوية.
3. تحضير وسط الاستزراع (1: 1 DMEM: F12 مكمل ب 1٪ [v / v] 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide في 0.85٪ NaCl ، 10٪ [v / v] FBS ، 150 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.2٪ [v / v] البنسلين [10000 وحدة دولية / مل] والستربتومايسين [10000 ميكروغرام / مل]). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. ضع الشبكات المعدنية مقاس 30 مم (مع فتحات قطرها 1-2 مم تتيح تصوير الأنسجة) في طبق بتري 35 مم. أضف وسائط كافية للوصول إلى سطح الشبكة دون إنتاج فقاعات هواء. قم بتسخين طبق الاستزراع المحضر مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى يتم عزل الأنسجة وجاهزة للثقافة (في حاضنة قياسية بها 5٪ CO₂ و 90٪ -95٪ رطوبة).

2. تشريح القاطعة وعزل النهاية القريبة

1. التضحية بالحيوانات باتباع بروتوكول رعاية الحيوان المعتمد.
2. قطع رأس الماوس وتشريح الفك السفلي. للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة الجلد لفضح الفك السفلي وقطع عضلات المفصل لفصله عن الفك العلوي وبقية الرأس.
3. بمجرد عزل الفك السفلي ، قم بإزالة اللسان وأكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
4. جمع كل الفك السفلي والاحتفاظ بها في طبق بتري يحتوي على PBS على الجليد ، لأن هذا يعزز صلاحية الأنسجة.
5. انقل أحد الفك السفلي إلى طبق بتري زجاجي واستخدم إبر تحت الجلد يمكن التخلص منها 20/26 جم لتشريح القاطعة تحت المجهر المجسم. تقسيم الفك السفلي في خط الوسط ، وقطع من خلال الارتفاق . نظف الأنسجة الرخوة والعضلية بعيدا عن سطح العظام للحصول على تصور أفضل.
   ملاحظة: طبق بتري الزجاجي ضروري ، لأن هذا لن يضعف الإبر.
6. الفك السفلي الذي يتم الحصول عليه من الحيوانات التي تقل أعمارها عن 10 أيام أكثر ليونة وهشاشة ، لذلك ، استخدم إبر تحت الجلد 20/26 جم يمكن التخلص منها لفتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 10 أيام ، استخدم الملقط للإمساك بالفك السفلي وكسر العظم لكشف السن.
7. افصل القاطعة برفق عن العظم المحيط واقطع الطرف القريب الذي يحتوي على حلقة عنق الرحم.
8. قطع الطرف القريب وإزالة المينا المعدنية ومصفوفة العاج.
9. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني دولبيكو على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع.

3. الثقافة

1. ضع بعناية مستطيل مرشح على الجزء العلوي من الشبكة في طبق ثقافة تم تسخينه مسبقا.
2. استخدم مجهرا مجسما لتوجيه قطع الأنسجة بشكل صحيح.
3. ضعه في حاضنة قياسية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ و 90٪ -95٪ رطوبة.
4. قم بتغيير الوسيط كل يوم واستبدله بوسط جديد ، وتجنب بعناية تكوين فقاعات الهواء. راقب نمو الأنسجة وقم بالتصوير يوميا باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر المجسم.

4. إضافة عوامل قابلة للذوبان في الثقافة

1. استكمل وسط الاستزراع بعوامل قابلة للذوبان وجزيئات ذات أهمية لدراسة تأثيرها على تنظيم SCs.
   ملاحظة: يعتمد بروتوكول الإدارة لأي جزيء (عوامل النمو ، جزيئات الإشارات ، الأجسام المضادة المانعة ، المركبات الدوائية مثل المثبطات أو المنشطات ، النواقل ، إلخ) على عمر النصف والذوبان. تحدد هذه المعلمات أيضا عنصر التحكم المناسب الذي سيتم استخدامه.

5. التحليلات الجزيئية والنسيجية

1. إزالة وسط الثقافة.
2. أضف بعناية الميثانول المثلج البارد إلى الأنسجة لمنع الانفصال عن المرشحات.
3. اترك الميثانول لمدة 5 دقائق.
4. نقل المرشحات التي تحمل الأنسجة إلى أنابيب أخذ العينات.
5. ثبت النباتات الخارجية في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
6. المضي قدما في البروتوكولات المعمول بها للمعالجة النسيجية (البارافين ، المجمدة ، إلخ) أو البقع المناعية.

6. ثقافة شرائح الأنسجة

ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات في هذا البروتوكول ، والتي تكون جميعها ناجحة بنفس القدر وهي مسألة اختيار شخصي ، اعتمادا على سرعة ومهارة المستخدم. تشير هذه إلى المخزن المؤقت المستخدم لجمع والحفاظ على صلاحية الأنسجة. لهذا الغرض ، يمكن استخدام Krebs buffer ، PBS المكمل ب 2٪ من الجلوكوز والمضادات الحيوية ، أو PBS. إذا تم استخدام المخزن المؤقت Krebs ، فيجب أن يتم ذلك قبل يوم واحد والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية.

1. قبل التجربة ، قم بإعداد 4٪ -5٪ أغاروز منخفض نقطة انصهار عن طريق إذابة 2-2.5 جم من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار في 50 مل من الجلوكوز المغلي 2٪ / PBS ، وبعد ذلك يجب وضع المحلول في حمام مائي 45 درجة مئوية.
2. قم بإعداد الاهتزاز ، واغسله بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واملأه بجلوكوز 2٪ / PBS بارد مع المضادات الحيوية (100 وحدة / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين).
3. قم بتشريح الأطراف القريبة من القاطعة واجمعها في الجلوكوز البارد 2٪ / PBS المكمل بالمضادات الحيوية.
4. ضع نهاية واحدة قريبة من القاطعة في القالب الذي يحتوي على 4٪ -5٪ من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار. تحت المجهر المجسم ، قم بتوجيه القطعة في الاتجاه المطلوب واتركها على الجليد حتى تصلب الأغاروز.
5. تقليم كتلة agarose تصلب ووضعها في vibratome. قطع شرائح سميكة (150-300 ميكرومتر).
6. اجمع الشرائح في طبق بتري يحتوي على جلوكوز مثلج 2٪ / PBS مكمل بالمضادات الحيوية.
7. استخدم ملعقة لنقل الشرائح السميكة على مستطيل مرشح يوضع على الشبكة التي تم تسخينها مسبقا كما في القسم 1.3.
8. احتضان الشرائح السميكة في الحاضنة والمضي قدما في التصوير (الشكل 2).

النتائج

توجد SCs الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، والذي يقع في الطرف القريب من القاطعة (الشكل 3 أ). حلقات عنق الرحم هي هياكل متميزة شكليا تتكون من ظهارة المينا الداخلية والخارجية التي تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض (الشكل 3 ب

Discussion

تم استخدام زراعة الأعضاء في المختبر على نطاق واسع لدراسة الإمكانات الاستقرائية والتفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأعضاء والتشكل. أظهر مختبر Thesleff كيفية تكييف تعديل Saxén لثقافة الأعضاء من نوع Trowell واستخدامها لدراسة تطور الأسنان¹⁴. جعلت الظروف والتطورات القابلة لل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors