Utilisation de la culture d’organes de type Trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires

Résumé

La méthode de culture d’organes de type Trowell a été utilisée pour démêler les réseaux de signalisation complexes qui régissent le développement des dents et, plus récemment, pour étudier la régulation impliquée dans les cellules souches de l’incisive de souris en croissance continue. Les modèles animaux fluorescents-rapporteurs et les méthodes d’imagerie en direct facilitent les analyses approfondies des cellules souches dentaires et de leur microenvironnement de niche spécifique.

Résumé

Le développement, la fonction et la régénération des organes dépendent des cellules souches, qui résident dans des espaces anatomiques discrets appelés niches de cellules souches. L’incisive de souris à croissance continue fournit un excellent modèle pour étudier les cellules souches spécifiques aux tissus. Les cellules souches spécifiques du tissu épithélial de l’incisive sont situées à l’extrémité proximale de la dent dans une niche appelée boucle cervicale. Ils fournissent un afflux continu de cellules pour contrebalancer l’abrasion constante de la pointe auto-affûtante de la dent. Un protocole détaillé pour l’isolement et la culture de l’extrémité proximale de l’incisive de souris qui abrite les cellules souches et leur niche est présenté ici. Il s’agit d’un protocole modifié de culture d’organes de type Trowell qui permet la culture in vitro de morceaux de tissus (explants), ainsi que les tranches de tissu épaisses à l’interface liquide/air sur un filtre soutenu par une grille métallique. Le protocole de culture d’organes décrit ici permet des manipulations tissulaires impossibles in vivo et, lorsqu’il est combiné à l’utilisation d’un ou de plusieurs rapporteurs fluorescents, il fournit une plate-forme pour l’identification et le suivi de populations cellulaires discrètes dans les tissus vivants au fil du temps, y compris les cellules souches. Diverses molécules régulatrices et composés pharmacologiques peuvent être testés dans ce système pour leur effet sur les cellules souches et leurs niches. Cela fournit en fin de compte un outil précieux pour étudier la régulation et le maintien des cellules souches.

Introduction

Les incisives de souris se développent continuellement en raison de la préservation à vie des cellules souches (SC) qui soutiennent la production incessante de composants dentaires. Il s’agit notamment des SC épithéliales, qui génèrent des améloblastes producteurs d’émail, et des cellules souches mésenchymateuses (CSM), qui génèrent des odontoblastes producteurs de dentine, entre autres cellules¹. Les SC épithéliaux dans les incisives en croissance continue ont été initialement identifiés comme des cellules retenant le marquage^2,3 et il a depuis été démontré qu’ils expriment un certain nombre de gènes souches bien connus^, y compris Sox2⁴. Ces cellules partagent des caractéristiques communes avec les SC épithéliaux dans d’autres organes et résident dans la niche SC appelée la boucle cervicale située sur le côté labial de l’incisive. La niche est une entité dynamique composée de cellules et de matrice extracellulaire qui contrôlent l’activité SC⁵. Des études de traçage de lignée ont démontré que les SC épithéliales Sox2+ peuvent régénérer tout le compartiment épithélial de la dent et qu’ils sont cruciaux pour la formation des dents successives ^6,7. Les CSM ayant un potentiel réparateur ou régénérateur de la dentine sont en grande partie recrutées à l’extérieur de l’organe par les vaisseaux sanguins et les nerfs 8,9,10,11^, fournissant ainsi un modèle approprié pour étudier le recrutement, la migration et le logement de la population des CSM.

Il n’est pas toujours possible d’étudier les SC in vivo, car de nombreuses manipulations génétiques et/ou pharmacologiques peuvent affecter l’homéostasie des organes et/ou avoir des conséquences mortelles. Par conséquent, la culture d’organes fournit un excellent outil pour étudier la régulation des SC et de leurs niches in vitro. Le système de culture d’organes qui utilise une grille métallique a été initialement développé par Trowell¹² pour étudier le développement des organes et a été modifié par Saxen¹³ pour étudier les signaux inductifs dans le développement des reins. Depuis lors, cette méthode in vitro de culture de tout ou partie de l’organe a été appliquée avec succès dans différents domaines. Dans le domaine du développement dentaire, cette méthode a été largement utilisée pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses qui régissent le développement des dents¹⁴ et la formation des dents successives¹⁵. Les travaux du laboratoire de Thesleff ont démontré l’utilité de ce système pour l’analyse temporelle de la croissance et de la morphogenèse des dents, pour l’analyse de l’effet de diverses molécules et facteurs de croissance sur la croissance des dents, et pour l’imagerie en direct du développement des dents^{en accéléré 16,17}. Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour étudier la régulation des SC incisives et de leur créneau^18,19, qui est décrit en détail ici.

Protocole

Ce protocole implique l’utilisation d’animaux et toutes les procédures ont été approuvées par les comités d’éthique sur l’utilisation et le soin des animaux et l’animalerie de l’Université d’Helsinki.

1. Préparation du plat de culture d’organes

1. Effectuer toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire. Nettoyez les surfaces de travail avec 70 % d’éthanol et utilisez des instruments et des solutions en verre autoclavé. Stérilisez les ciseaux et autres équipements métalliques dans un stérilisateur à billes de verre.
2. Préparer les filtres normalement stockés dans de l’éthanol à 70 % en les lavant trois fois dans 1x PBS pour éliminer l’éthanol (figure 1). Couper les filtres en morceaux rectangulaires (3 x 3-5 x 5 mm).
   REMARQUE: Les morceaux filtrants lavés peuvent être stockés pendant plusieurs jours dans 1x PBS à 4 ° C.
3. Préparer le milieu de culture (DMEM:F12 1:1 supplémenté avec 1 % [v/v] 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans 0,85 % de NaCl, 10 % [v/v] FBS, 150 μg/mL d’acide ascorbique et 0,2 % [v/v] de pénicilline [10 000 UI/mL] et de streptomycine [10 000 μg/mL]). Conserver à 4 °C.
4. Placez les grilles métalliques de 30 mm (avec des trous de 1 à 2 mm de diamètre qui permettent l’imagerie tissulaire) dans une boîte de Petri de 35 mm. Ajoutez suffisamment de média pour atteindre la surface du réseau sans produire de bulles d’air. Préchauffer la capsule de culture préparée à 37 °C jusqu’à ce que le tissu soit isolé et prêt pour la culture (dans un incubateur standard avec 5% de CO₂ et 90% - 95% d’humidité).

2. Dissection incisive et isolement de l’extrémité proximale

1. Sacrifiez les animaux en suivant un protocole de soins aux animaux approuvé.
2. Décapitaisez la souris et disséquez la mandibule. Pour ce faire, retirez d’abord la peau pour exposer la mandibule et coupez à travers les muscles masséters pour la séparer du maxillaire et du reste de la tête.
3. Une fois la mandibule isolée, retirez la langue et autant de tissus mous que possible.
4. Rassemblez toutes les mandibules et conservez-les dans une boîte de Petri contenant du PBS sur de la glace, car cela améliore la viabilité des tissus.
5. Transférer une mandibule dans une boîte de Petri en verre et utiliser des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour disséquer l’incisive au stéréomicroscope. Fendez la mandibule à la ligne médiane, coupant à travers la symphyse. Nettoyez le tissu mou et musculaire loin de la surface osseuse pour une meilleure visualisation.
   REMARQUE: Une boîte de Petri en verre est essentielle, car cela n’émoussera pas les aiguilles.
6. Les mandibules obtenues à partir d’animaux de moins de 10 jours sont plus molles et plus fragiles, par conséquent, utilisez des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour ouvrir chaque moitié de la mandibule longitudinalement afin d’exposer la dent incisive. Pour les souris de plus de 10 jours, utilisez une pince à épiler pour saisir la mandibule et casser l’os pour exposer la dent.
7. Détachez doucement l’incisive de l’os environnant et coupez l’extrémité proximale, qui contient la boucle cervicale.
8. Couper l’extrémité proximale et enlever l’émail minéralisé et la matrice dentine.
9. Conservez les extrémités proximales collectées dans le PBS de Dulbecco sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la culture.

3. La culture

1. Placez soigneusement un rectangle filtrant sur le dessus d’une grille dans un plat de culture préchauffé.
2. Utilisez un stéréomicroscope pour bien orienter les morceaux de tissu.
3. Placer dans un incubateur standard à 37 °C avec 5% de CO₂ et 90%-95% d’humidité.
4. Changez le milieu tous les deux jours et remplacez-le par un milieu frais, en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Surveillez la croissance des tissus et photographiez quotidiennement à l’aide d’une caméra fixée au stéréomicroscope.

4. Ajout de facteurs solubles à la culture

1. Compléter le milieu de culture avec des facteurs solubles et des molécules d’intérêt pour étudier leur effet sur la régulation des SC.
   NOTE: Le protocole d’administration de toute molécule (facteurs de croissance, molécules de signalisation, anticorps bloquants, composés pharmacologiques tels que inhibiteurs ou activateurs, vecteurs, etc.) dépend de sa demi-vie et de sa solubilité. Ces paramètres déterminent également le contrôle approprié à utiliser.

5. Analyses moléculaires et histologiques

1. Retirez le milieu de culture.
2. Ajoutez soigneusement du méthanol glacé aux tissus pour éviter le détachement des filtres.
3. Laisser agir le méthanol pendant 5 min.
4. Transférer les filtres transportant les explants de tissus dans des tubes de prélèvement.
5. Fixer les explants dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10-24 h à 4 °C.
6. Procéder avec les protocoles établis pour le traitement histologique (paraffine, congelé, etc.) ou les immunocolorations.

6. Culture de tranches de tissu

REMARQUE: Il existe plusieurs variantes de ce protocole, qui sont toutes aussi réussies et sont une question de choix personnel, en fonction de la vitesse et de la compétence de l’utilisateur. Ceux-ci se réfèrent au tampon utilisé pour recueillir et maintenir la viabilité des tissus. À cette fin, le tampon Krebs, le PBS complété par 2% de glucose et d’antibiotiques, ou PBS peuvent être utilisés. Si un tampon Krebs est utilisé, il doit être fabriqué 1 jour à l’avance et maintenu à 4 °C.

1. Avant l’expérience, préparer de l’agarose à bas point de fusion à 4 % à 5 % en dissolvant 2 à 2,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de glucose à 2 % bouillant/PBS, après quoi la solution doit être placée dans un bain-marie à 45 °C.
2. Installez le vibratome, lavez avec de l’éthanol à 70 % et remplissez de glucose / PBS à 2% glacé complété par des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline, 100 mg / mL de streptomycine).
3. Disséquez les extrémités proximales de l’incisive et recueillez-les dans le froid glacé 2% de glucose / PBS supplémenté en antibiotiques.
4. Placer une extrémité proximale de l’incisive dans le moule contenant 4% à 5% de bas point de fusion agarose. Sous un stéréomicroscope, orienter la pièce dans la direction souhaitée et laisser sur la glace pour que l’agarose durcisse.
5. Coupez le bloc d’agarose durci et placez-le dans le vibratome. Couper des tranches épaisses (150-300 μm).
6. Recueillir les tranches dans une boîte de Petri contenant 2% de glucose / PBS glacé complété par des antibiotiques.
7. Utiliser une spatule pour transférer les tranches épaisses sur un filtre rectangulaire placé sur la grille préchauffée préparée comme au point 1.3.
8. Incuber les tranches épaisses dans l’incubateur et procéder à l’imagerie (Figure 2).

Résultats

Les SC épithéliaux résident dans une niche appelée anse cervicale, située à l’extrémité proximale de l’incisive (Figure 3A). Les anses cervicales sont des structures morphologiquement distinctes composées d’épithélium d’émail interne et externe qui enveloppent le réticulum étoilé, un noyau de cellules épithéliales disposées de manière lâche (Figure 3B,C). Il y a deux anses cervicales dans chaque incisive (

Discussion

La culture d’organes in vitro a été largement utilisée pour étudier le potentiel inductif et les interactions épithélio-mésenchymateuses qui régissent la croissance et la morphogenèse des organes. Le laboratoire de Thesleff a montré comment adapter la modification Saxén de la culture d’organes de type Trowell et l’utiliser pour étudier le développement des dents¹⁴. Les conditions reproductibles et les progrès dans les rapporteurs fluorescents en ont fait une méthode u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors