Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Resumo

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Resumo

O desenvolvimento, a função e a regeneração dos órgãos dependem das células-tronco, que residem em espaços anatômicos discretos chamados nichos de células-tronco. O incisivo de camundongo em crescimento contínuo fornece um excelente modelo para estudar células-tronco específicas de tecidos. As células-tronco específicas do tecido epitelial do incisivo estão localizadas na extremidade proximal do dente em um nicho chamado alça cervical. Eles fornecem um influxo contínuo de células para contrabalançar a abrasão constante da ponta auto-afiada do dente. Apresenta-se aqui um protocolo detalhado para o isolamento e cultura da extremidade proximal do incisivo de camundongo que abriga células-tronco e seu nicho. Este é um protocolo de cultura de órgãos do tipo Trowell modificado que permite a cultura in vitro de pedaços de tecido (explantes), bem como as fatias de tecido espesso na interface líquido/ar em um filtro suportado por uma grade metálica. O protocolo de cultura de órgãos descrito aqui permite manipulações teciduais inviáveis in vivo e, quando combinado com o uso de um repórter fluorescente, fornece uma plataforma para a identificação e rastreamento de populações de células discretas em tecidos vivos ao longo do tempo, incluindo células-tronco. Várias moléculas reguladoras e compostos farmacológicos podem ser testados neste sistema quanto ao seu efeito sobre as células-tronco e seus nichos. Isso, em última análise, fornece uma ferramenta valiosa para estudar a regulação e a manutenção das células-tronco.

Introdução

Os incisivos de camundongos crescem continuamente devido à preservação ao longo da vida das células-tronco (SC) que suportam a produção incessante de componentes dentários. Estes incluem SCs epiteliais, que geram ameloblastos produtores de esmalte, e células-tronco mesenquimais (MSCs), que geram odontoblastos produtores de dentina, entre outras células¹. Os SCs epiteliais nos incisivos de crescimento contínuo foram inicialmente identificados como células de retenção de rótulo^2,3 e, desde então, demonstraram expressar uma série de genes de caule bem conhecidos^, incluindo Sox2⁴. Essas células compartilham características comuns com SCs epiteliais em outros órgãos e residem dentro do nicho SC chamado alça cervical localizado no lado labial do incisivo. O nicho é uma entidade dinâmica composta por células e matriz extracelular que controlam a atividade da SC⁵. Estudos de traçado de linhagem demonstraram que os SCs epiteliais Sox2+ podem regenerar todo o compartimento epitelial do dente e que são cruciais para a formação sucessional do dente ^6,7. As CTMs com potencial reparador ou regenerativo dentinário são em grande parte recrutadas de fora do órgão através de vasos sanguíneos e nervos 8,9,10,11, fornecendo, portanto, um modelo adequado para estudar o recrutamento^, a migração e o alojamento da população de CTM.

Estudar SCs in vivo nem sempre é viável, uma vez que muitas das manipulações genéticas e/ou farmacológicas podem afetar a homeostase dos órgãos e/ou ter consequências letais. Portanto, a cultura de órgãos fornece uma excelente ferramenta para estudar a regulação das SCs e seus nichos in vitro. O sistema de cultura de órgãos que utiliza uma grade de metal foi inicialmente desenvolvido por Trowell¹² para estudar o desenvolvimento de órgãos e foi modificado por Saxen¹³ para estudar sinais indutivos no desenvolvimento renal. Desde então, este método in vitro de cultura da totalidade ou parte do órgão tem sido aplicado com sucesso em diferentes campos. No campo do desenvolvimento dentário, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar as interações epitelial-mesenquimais que regem o desenvolvimento dentário¹⁴ e a formação sucessional dentária¹⁵. O trabalho do laboratório Thesleff demonstrou a utilidade desse sistema para a análise temporal do crescimento e morfogênese dentária, para a análise do efeito de várias moléculas e fatores de crescimento no crescimento dentário e para a imagem ao vivo em tempo de lapso temporal do desenvolvimento dentário^16,17. Mais recentemente, esse método tem sido utilizado para estudar a regulação de SCs incisivos e seu nicho^18,19, o que é descrito em detalhes aqui.

Protocolo

Este protocolo envolve o uso de animais e todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Ética sobre o Uso e Cuidado de Animais e o Animal Facility da Universidade de Helsinque.

1. Preparação do prato de cultura de órgãos

1. Realizar todos os procedimentos em um exaustor de fluxo laminar. Limpe as superfícies de trabalho com etanol a 70% e utilize instrumentos e soluções de vidro autoclavado. Esterilize tesouras e outros equipamentos de metal em um esterilizador de contas de vidro.
2. Preparar filtros normalmente armazenados em etanol a 70%, lavando-os três vezes em 1x PBS para retirada do etanol (Figura 1). Corte os filtros em pedaços retangulares (3 x 3-5 x 5 mm).
   NOTA: As peças de filtro lavadas podem ser armazenadas por vários dias em 1x PBS a 4 °C.
3. Preparar o meio de cultura (1:1 DMEM:F12 suplementado com 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo em 0,85% de NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL de ácido ascórbico e 0,2% [v/v] de penicilina [10.000 UI/mL] e estreptomicina [10.000 μg/mL]). Conservar a 4 °C.
4. Coloque as grades metálicas de 30 mm (com orifícios de 1-2 mm de diâmetro que permitam a imagem do tecido) em uma placa de Petri de 35 mm. Adicione meios suficientes para alcançar a superfície da grade sem produzir bolhas de ar. Pré-aqueça o prato de cultura preparado a 37 °C até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura (em incubadora padrão com 5% de CO₂ e 90%-95% de umidade).

2. Dissecção do incisivo e isolamento da extremidade proximal

1. Sacrificar os animais de acordo com um protocolo de cuidados com os animais aprovado.
2. Decapitar o rato e dissecar a mandíbula. Para fazer isso, primeiro remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separá-la da maxila e do resto da cabeça.
3. Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecido mole possível.
4. Colete todas as mandíbulas e mantenha-as em uma placa de Petri contendo PBS no gelo, pois isso aumenta a viabilidade dos tecidos.
5. Transfira uma mandíbula para uma placa de Petri de vidro e use agulhas hipodérmicas descartáveis 20/26 G para dissecar o incisivo sob um estereomicroscópio. Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Limpe o tecido mole e muscular longe da superfície óssea para uma melhor visualização.
   NOTA: Uma placa de Petri de vidro é essencial, pois isso não embotará as agulhas.
6. As mandíbulas obtidas de animais com menos de 10 dias são mais macias e frágeis, portanto, use agulhas hipodérmicas descartáveis de 20/26 G para abrir cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo. Para ratos com mais de 10 dias, use uma pinça para segurar a mandíbula e quebrar o osso para expor o dente.
7. Desprenda suavemente o incisivo do osso circundante e corte a extremidade proximal, que contém a alça cervical.
8. Corte a extremidade proximal e remova o esmalte mineralizado e a matriz dentinária.
9. Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura.

3. Cultura

1. Coloque cuidadosamente um retângulo de filtro no topo de uma grade em um prato de cultura pré-aquecido.
2. Use um estereomicroscópio para orientar adequadamente as peças de tecido.
3. Colocar numa incubadora padrão a 37 °C com 5% de CO₂ e 90%-95% de humidade.
4. Troque o meio a cada dois dias e substitua por meio fresco, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Monitore o crescimento do tecido e fotografe diariamente usando uma câmera conectada ao estereomicroscópio.

4. Adição de fatores solúveis à cultura

1. Complementar o meio de cultura com fatores solúveis e moléculas de interesse para estudar seu efeito na regulação de SCs.
   NOTA: O protocolo de administração para qualquer molécula (fatores de crescimento, moléculas de sinalização, anticorpos bloqueadores, compostos farmacológicos, como inibidores ou ativadores, vetores, etc.) depende de sua meia-vida e solubilidade. Esses parâmetros também determinam o controle apropriado a ser usado.

5. Análises moleculares e histológicas

1. Remova o meio de cultura.
2. Adicione cuidadosamente metanol gelado aos tecidos para evitar o descolamento dos filtros.
3. Deixe metanol por 5 min.
4. Filtros de transferência que transportam explantes de tecidos para tubos de amostragem.
5. Fixar os explantes em paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-24 h a 4 °C.
6. Prossiga com protocolos estabelecidos para processamento histológico (parafina, congelado, etc.) ou imunocolorações.

6. Cultura de fatias de tecido

NOTA: Existem várias variações para este protocolo, que são todas igualmente bem sucedidas e são uma questão de escolha pessoal, dependendo da velocidade e da habilidade do usuário. Estes referem-se ao tampão usado para coletar e manter a viabilidade do tecido. Para este propósito, o tampão de Krebs, PBS suplementado com 2% de glicose e antibióticos, ou PBS pode ser usado. Se for utilizado tampão de Krebs, este deve ser fabricado com 1 dia de antecedência e mantido a 4 °C.

1. Antes do experimento, preparar agarose de baixo ponto de fusão a 4%-5% dissolvendo 2-2,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 mL de glicose a 2% de ebulição/PBS, após o que a solução deve ser colocada em banho-maria de 45 °C.
2. Configure o vibratome, lave com etanol a 70% e encha com 2% de glicose/PBS gelado suplementado com antibióticos (100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina).
3. Dissecar as extremidades proximais do incisivo e coletá-las no gelado 2% de glicose/PBS suplementado com antibióticos.
4. Coloque uma extremidade proximal do incisivo no molde contendo 4% a 5% de agarose de baixo ponto de fusão. Sob um estereomicroscópio, oriente a peça na direção desejada e deixe no gelo para que a agarose endureça.
5. Apare o bloco de agarose endurecido e coloque-o no vibratome. Corte fatias grossas (150-300 μm).
6. Colete as fatias em uma placa de Petri contendo 2% de glicose gelada / PBS suplementada com antibióticos.
7. Utilizar uma espátula para transferir as fatias grossas num rectângulo de filtro colocado na grelha pré-aquecida preparada como no ponto 1.3.
8. Incubar os cortes espessos na incubadora e proceder à imagem (Figura 2).

Resultados

Os SCs epiteliais residem em um nicho denominado alça cervical, que se localiza na extremidade proximal do incisivo (Figura 3A). As alças cervicais são estruturas morfologicamente distintas compostas de epitélio interno e externo do esmalte que envolvem o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente dispostas (Figura 3B,C). Existem duas alças cervicais em cada incisivo (Figura 3A), mas ape...

Discussão

A cultura de órgãos in vitro tem sido amplamente utilizada para estudar o potencial indutivo e as interações epitelial-mesenquimais que governam o crescimento e a morfogênese dos órgãos. O laboratório Thesleff demonstrou como adaptar a modificação de Saxén da cultura de órgãos do tipo Trowell e usá-la para estudar o desenvolvimento dentário¹⁴. As condições reprodutíveis e os avanços nos repórteres fluorescentes tornaram este um método útil para monitorar a morfogêne...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors