Использование культуры органов типа Trowell для изучения регуляции стоматологических стволовых клеток

Резюме

Метод культуры органов типа Троуэлла был использован для разгадки сложных сигнальных сетей, которые управляют развитием зубов, и, в последнее время, для изучения регуляции, связанной со стволовыми клетками постоянно растущего мышиного резца. Флуоресцентно-репортерные животные модели и методы визуализации в реальном времени облегчают углубленный анализ стоматологических стволовых клеток и их конкретной нишевой микросреды.

Аннотация

Развитие, функция и регенерация органов зависят от стволовых клеток, которые находятся в дискретных анатомических пространствах, называемых нишами стволовых клеток. Постоянно растущий мышиный резец обеспечивает отличную модель для изучения тканеспецифических стволовых клеток. Эпителиальные тканеспецифические стволовые клетки резца расположены на проксимальном конце зуба в нише, называемой шейной петлей. Они обеспечивают непрерывный приток клеток для уравновешивания постоянного истирания самозатачивающегося кончика зуба. Здесь представлен подробный протокол выделения и культивирования проксимального конца мышиного резца, в котором находятся стволовые клетки и их ниша. Это модифицированный протокол посева органов типа Trowell, который позволяет выращивать in vitro кусочки ткани (экспланты), а также толстые срезы ткани на границе раздела жидкость/воздух на фильтре, поддерживаемом металлической сеткой. Протокол посева органов, описанный здесь, позволяет проводить манипуляции с тканями, невозможные in vivo, и в сочетании с использованием флуоресцентного репортера (репортеров) он обеспечивает платформу для идентификации и отслеживания дискретных популяций клеток в живых тканях с течением времени, включая стволовые клетки. Различные регуляторные молекулы и фармакологические соединения могут быть протестированы в этой системе на предмет их влияния на стволовые клетки и их ниши. Это в конечном итоге обеспечивает ценный инструмент для изучения регуляции и поддержания стволовых клеток.

Введение

Мышиные резцы непрерывно растут благодаря пожизненному сохранению стволовых клеток (SC), которые поддерживают непрерывное производство компонентов зуба. К ним относятся эпителиальные СК, которые генерируют эмал-продуцирующие амелобласты, и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые генерируют дентин-продуцирующие одонтобласты, среди других клеток¹. Эпителиальные СК в непрерывно растущих резцах были первоначально идентифицированы как клетки, удерживающие метку ^2,3, и с тех пор было показано, что они экспрессируют ряд хорошо известных генов стволовости, включая Sox2⁴. Эти клетки имеют общие черты с эпителиальными СК в других органах и находятся в нише SC, называемой шейной петлей, расположенной на губной стороне резца. Ниша представляет собой динамическую сущность, состоящую из клеток и внеклеточного матрикса, которые контролируют активность SC⁵. Исследования по отслеживанию линии показали, что эпителиальные СК Sox2+ могут регенерировать весь эпителиальный компартмент зуба и что они имеют решающее значение для формирования сукцессионного зуба ^6,7. МСК с репаративным или регенеративным потенциалом дентина в значительной степени набираются извне органа через кровеносные сосуды и нервы ^8,9,10,11, что обеспечивает подходящую модель для изучения вербовки, миграции и жилья популяции MSC.

Изучить СК in vivo не всегда возможно, так как многие генетические и/или фармакологические манипуляции могут влиять на гомеостаз органов и/или иметь летальные последствия. Поэтому органная культура является отличным инструментом для изучения регуляции СК и их ниш in vitro. Система культуры органов, которая использует металлическую сетку, была первоначально разработана Trowell¹² для изучения развития органов и была дополнительно модифицирована Saxen¹³ для изучения индуктивных сигналов в развитии почек. С тех пор этот метод культивирования всего или части органа in vitro успешно применяется в разных областях. В области развития зубов этот метод широко используется для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют развитием зуба¹⁴ и сукцессионным формированием зубов¹⁵. Работа лаборатории Thesleff продемонстрировала полезность этой системы для временного анализа роста и морфогенеза зубов, для анализа влияния различных молекул и факторов роста на рост зубов, а также для покадровой живой визуализации развития зубов^16,17. Совсем недавно этот метод был использован для изучения регулирования резцовых СК и их ниши^18,19, которая подробно описана здесь.

протокол

Этот протокол включает в себя использование животных, и все процедуры были одобрены Этическими комитетами по использованию и уходу за животными и Учреждением по защите животных в Университете Хельсинки.

1. Приготовление блюда для органной культуры

1. Выполняйте все процедуры в ламинарной вытяжке. Очищайте рабочие поверхности 70% этанолом и используйте инструменты и растворы из автоклавного стекла. Стерилизуйте ножницы и другое металлическое оборудование в стерилизаторе из стеклянных шариков.
2. Подготовьте фильтры, обычно хранящиеся в 70% этаноле, промыв их три раза в 1x PBS для удаления этанола (рисунок 1). Нарежьте фильтры на прямоугольные куски (3 x 3-5 x 5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промытые части фильтра могут храниться в течение нескольких дней в 1x PBS при 4 °C.
3. Готовят культуральную среду (1:1 DMEM:F12 с добавлением 1% [v/v] 200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 0,2% [v/v] пенициллина [10 000 I.U./мл] и стрептомицина [10 000 мкг/мл]). Хранить при температуре 4 °C.
4. Поместите металлические сетки диаметром 30 мм (с отверстиями диаметром 1-2 мм, которые позволяют визуализировать ткани) в чашку Петри толщиной 35 мм. Добавьте достаточное количество среды, чтобы достичь поверхности сетки без образования пузырьков воздуха. Предварительно разогрейте приготовленную чашку для культивирования при 37 °C до тех пор, пока ткань не будет выделена и готова к культивированию (в стандартном инкубаторе с 5%_CO2 и влажностью 90%-95%).

2. Рассечение резца и изоляция проксимального конца

1. Приносите в жертву животных в соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными.
2. Обезглавить мышь и рассечь нижнюю челюсть. Для этого сначала удалите кожу, чтобы обнажить нижнюю челюсть и прорежьте мышцы массажера, чтобы отделить ее от верхней челюсти и остальной части головы.
3. Как только нижняя челюсть выделена, удалите язык и как можно больше мягких тканей.
4. Соберите все нижние челюсти и храните их в чашке Петри, содержащей PBS на льду, так как это повышает жизнеспособность тканей.
5. Переложите одну нижнюю челюсть в стеклянную чашку Петри и используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г для рассечения резца под стереомикроскопом. Расколите нижнюю челюсть по средней линии, разрезав симфиз. Очистите мягкую и мышечную ткань от поверхности кости для лучшей визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная чашка Петри необходима, так как это не притупит иглы.
6. Нижние челюсти, полученные от животных моложе 10 дней, мягче и хрупче, поэтому используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г, чтобы открыть каждую половину нижней челюсти продольно, чтобы обнажить резцовый зуб. Для мышей старше 10 дней используйте пинцет, чтобы схватить нижнюю челюсть и сломать кость, чтобы обнажить зуб.
7. Аккуратно отсоедините резец от окружающей кости и отрежьте проксимальный конец, в котором находится шейная петля.
8. Вырежьте проксимальный конец и удалите минерализованную эмаль и дентиновый матрикс.
9. Храните собранные проксимальные концы в PBS Дульбекко на льду до тех пор, пока они не будут готовы к культуре.

3. Культура

1. Аккуратно поместите прямоугольник фильтра поверх сетки в предварительно подогретую культурную посуду.
2. Используйте стереомикроскоп, чтобы правильно сориентировать кусочки ткани.
3. Поместите в стандартный инкубатор при температуре 37 °C с влажностью 5% CO₂ и влажностью 90-95%.
4. Меняйте среду через день и заменяйте свежей средой, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Следите за ростом тканей и ежедневно фотографируйте с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу.

4. Добавление растворимых факторов в культуру

1. Дополнить питательную среду растворимыми факторами и молекулами, представляющими интерес, для изучения их влияния на регуляцию СК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол введения для любой молекулы (факторы роста, сигнальные молекулы, блокирующие антитела, фармакологические соединения, такие как ингибиторы или активаторы, векторы и т.д.) зависит от ее периода полувыведения и растворимости. Эти параметры также определяют соответствующий элемент управления, который будет использоваться.

5. Молекулярный и гистологический анализ

1. Удалите культуральную среду.
2. Осторожно добавляйте ледяной метанол в ткани, чтобы предотвратить отслоение от фильтров.
3. Оставить метанол на 5 мин.
4. Перенос фильтров, несущих тканевые экспланты, в пробоотборные пробирки.
5. Зафиксируйте экспланты в 4% параформальдегиде в PBS в течение 10-24 ч при 4 °C.
6. Приступают к установленным протоколам гистологической обработки (парафин, замороженность и т.д.) или иммуноокрашениям.

6. Культивирование срезов тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько вариантов этого протокола, которые все одинаково успешны и являются вопросом личного выбора, в зависимости от скорости и мастерства пользователя. Они относятся к буферу, используемому для сбора и поддержания жизнеспособности тканей. Для этого можно использовать буфер Кребса, PBS, дополненный 2% глюкозой и антибиотиками, или PBS. Если используется буфер Кребса, его следует сделать за 1 день и держать при 4 °C.

1. Перед экспериментом готовят 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления путем растворения 2-2,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл кипячения 2% глюкозы/ПБС, после чего раствор следует поместить на водяную баню при температуре 45 °С.
2. Установите вибратом, промыть 70% этанолом и наполнить ледяным холодом 2% глюкозы / PBS, дополненным антибиотиками (100 ЕД / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина).
3. Рассекните проксимальные концы резца и соберите их в ледяной 2% глюкозы / PBS, дополненной антибиотиками.
4. Поместите один проксимальный конец резца в форму, содержащую 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления. Под стереомикроскопом сориентируйте кусок в нужном направлении и оставьте на льду, чтобы агароза затвердела.
5. Обрежьте затвердевший блок агарозы и поместите его в вибратом. Нарезать толстыми ломтиками (150-300 мкм).
6. Соберите ломтики в чашку Петри, содержащую холодные 2% глюкозы / PBS, дополненные антибиотиками.
7. Используйте шпатель для переноса толстых ломтиков на фильтрующий прямоугольник, помещенный на предварительно нагретую сетку, подготовленную, как в разделе 1.3.
8. Инкубируйте толстые срезы в инкубаторе и приступайте к визуализации (рисунок 2).

Результаты

Эпителиальные СК находятся в нише, называемой шейной петлей, которая расположена на проксимальном конце резца (рисунок 3А). Шейные петли представляют собой морфологически различные структуры, состоящие из внутреннего и наружного эпителия эмали, которые заключают в себ?...

Обсуждение

Культура органов in vitro широко используется для изучения индуктивного потенциала и эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют ростом органов и морфогенезом. Лаборатория Thesleff продемонстрировала, как адаптировать саксенскую модификацию культуры органов типа Т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors