Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Riepilogo

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Abstract

Lo sviluppo, la funzione e la rigenerazione degli organi dipendono dalle cellule staminali, che risiedono all'interno di spazi anatomici discreti chiamati nicchie di cellule staminali. L'incisivo di topo in continua crescita fornisce un modello eccellente per studiare le cellule staminali tessuto-specifiche. Le cellule staminali epiteliali tessuto-specifiche dell'incisivo si trovano all'estremità prossimale del dente in una nicchia chiamata ansa cervicale. Forniscono un afflusso continuo di cellule per controbilanciare la costante abrasione della punta autoaffilante del dente. Presentato qui è un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura dell'estremità prossimale dell'incisivo del topo che ospita le cellule staminali e la loro nicchia. Si tratta di un protocollo di coltura di organi di tipo Trowell modificato che consente la coltura in vitro di pezzi di tessuto (espianti), nonché le fette di tessuto spesso all'interfaccia liquido / aria su un filtro supportato da una griglia metallica. Il protocollo di coltura degli organi qui descritto consente manipolazioni tissutali non fattibili in vivo e, se combinato con l'uso di uno o più reporter fluorescenti, fornisce una piattaforma per l'identificazione e il monitoraggio di popolazioni cellulari discrete nei tessuti vivi nel tempo, comprese le cellule staminali. Varie molecole regolatorie e composti farmacologici possono essere testati in questo sistema per il loro effetto sulle cellule staminali e le loro nicchie. Questo in definitiva fornisce uno strumento prezioso per studiare la regolazione e il mantenimento delle cellule staminali.

Introduzione

Gli incisivi di topo crescono continuamente grazie alla conservazione permanente delle cellule staminali (SC) che supportano la produzione incessante di componenti dentali. Questi includono SC epiteliali, che generano ameloblasti che producono smalto, e cellule staminali mesenchimali (MSC), che generano odontoblasti che producono dentina, tra le altre cellule¹. Le SC epiteliali negli incisivi a crescita continua sono state inizialmente identificate^{come cellule 2,3} che mantengono l'etichetta e da allora hanno dimostrato di esprimere un certo numero di geni staminali ben noti^, tra cui Sox2⁴. Queste cellule condividono caratteristiche comuni con SC epiteliali in altri organi e risiedono all'interno della nicchia SC chiamata ansa cervicale situata sul lato labiale dell'incisivo. La nicchia è un'entità dinamica composta da cellule e matrice extracellulare che controllano l'attività SC⁵. Studi di lineage tracing hanno dimostrato che le SC epiteliali Sox2+ possono rigenerare l'intero compartimento epiteliale del dente e che sono cruciali per la formazione dei denti di successione ^6,7. Le MSC con potenziale riparativo o rigenerativo della dentina sono in gran parte reclutate dall'esterno dell'organo attraverso i vasi sanguigni e i nervi 8,9,10,11^, fornendo quindi un modello adatto per studiare il reclutamento, la migrazione e l'alloggiamento della popolazione MSC.

Studiare le SC in vivo non è sempre fattibile, poiché molte delle manipolazioni genetiche e/o farmacologiche possono influenzare l'omeostasi degli organi e/o avere conseguenze letali. Pertanto, la coltura di organi fornisce uno strumento eccellente per studiare la regolazione delle SC e delle loro nicchie in vitro. Il sistema di coltura degli organi che utilizza una griglia metallica è stato inizialmente sviluppato da Trowell¹² per studiare lo sviluppo degli organi ed è stato ulteriormente modificato da Saxen¹³ per studiare i segnali induttivi nello sviluppo renale. Da allora, questo metodo in vitro di coltura dell'intero organo o parte di esso è stato applicato con successo in diversi campi. Nel campo dello sviluppo dei denti, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano lo sviluppo dei denti¹⁴ e la formazione dei denti di successione¹⁵. Il lavoro del laboratorio Thesleff ha dimostrato l'utilità di questo sistema per l'analisi temporale della crescita e della morfogenesi dei denti, per l'analisi dell'effetto di varie molecole e fattori di crescita sulla crescita dei denti e per l'imaging live time-lapse dello sviluppo dei denti^16,17. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per studiare la regolazione degli incisivi SC e la loro nicchia^18,19, che è descritta in dettaglio qui.

Protocollo

Questo protocollo prevede l'uso di animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati etici per l'uso e la cura degli animali e dalla struttura per animali dell'Università di Helsinki.

1. Preparazione del piatto di coltura dell'organo

1. Eseguire tutte le procedure in una cappa a flusso laminare. Pulire le superfici di lavoro con etanolo al 70% e utilizzare strumenti e soluzioni in vetro autoclavato. Sterilizzare le forbici e altre attrezzature metalliche in uno sterilizzatore a perline di vetro.
2. Preparare i filtri normalmente conservati in etanolo al 70% lavandoli tre volte in 1x PBS per rimuovere l'etanolo (Figura 1). Tagliare i filtri in pezzi rettangolari (3 x 3-5 x 5 mm).
   NOTA: I pezzi filtranti lavati possono essere conservati per diversi giorni in 1x PBS a 4 °C.
3. Preparare il terreno di coltura (1:1 DMEM:F12 integrato con 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutammina dipeptide in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL acido ascorbico e 0,2% [v/v] penicillina [10.000 UI/mL] e streptomicina [10.000 μg/mL]). Conservare a 4 °C.
4. Posizionare le griglie metalliche da 30 mm (con fori di 1-2 mm di diametro che consentono l'imaging dei tessuti) in una capsula di Petri da 35 mm. Aggiungere un supporto sufficiente per raggiungere la superficie della griglia senza produrre bolle d'aria. Preriscaldare il piatto di coltura preparato a 37 °C fino a quando il tessuto non è isolato e pronto per la coltura (in un'incubatrice standard con 5% di CO₂ e 90%-95% di umidità).

2. Dissezione incisiva e isolamento dell'estremità prossimale

1. Sacrificare gli animali seguendo un protocollo di cura degli animali approvato.
2. Decapitare il topo e sezionare la mandibola. Per fare ciò, prima rimuovere la pelle per esporre la mandibola e tagliare i muscoli masseteri per separarla dalla mascella e dal resto della testa.
3. Una volta isolata la mandibola, rimuovere la lingua e quanto più tessuto molle possibile.
4. Raccogliere tutte le mandibole e tenerle in una capsula di Petri contenente PBS sul ghiaccio, in quanto ciò migliora la vitalità dei tessuti.
5. Trasferire una mandibola su una capsula di Petri di vetro e utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per sezionare l'incisivo sotto uno stereomicroscopio. Dividere la mandibola sulla linea mediana, tagliando la sinfisi. Pulire il tessuto molle e muscolare lontano dalla superficie ossea per una migliore visualizzazione.
   NOTA: Una capsula di Petri di vetro è essenziale, in quanto ciò non smusserà gli aghi.
6. Le mandibole ottenute da animali di età inferiore ai 10 giorni sono più morbide e fragili, quindi utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per aprire longitudinalmente ogni metà della mandibola per esporre il dente incisivo. Per i topi di età superiore a 10 giorni, utilizzare una pinzetta per afferrare la mandibola e rompere l'osso per esporre il dente.
7. Staccare delicatamente l'incisivo dall'osso circostante e tagliare l'estremità prossimale, che contiene l'ansa cervicale.
8. Tagliare l'estremità prossimale e rimuovere lo smalto mineralizzato e la matrice dentinica.
9. Tenere le estremità prossimali raccolte nel PBS di Dulbecco sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per la cultura.

3. Cultura

1. Posizionare con attenzione un rettangolo di filtro sulla parte superiore di una griglia in un piatto di coltura preriscaldato.
2. Utilizzare uno stereomicroscopio per orientare correttamente i pezzi di tessuto.
3. Collocare in un'incubatrice standard a 37 °C con 5% di CO₂ e 90%-95% di umidità.
4. Cambiare il terreno a giorni alterni e sostituirlo con un terreno fresco, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Monitorare la crescita dei tessuti e fotografare quotidianamente utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio.

4. Aggiunta di fattori solubili alla coltura

1. Integrare il terreno di coltura con fattori solubili e molecole di interesse per studiare il loro effetto sulla regolazione delle SC.
   NOTA: Il protocollo di somministrazione di qualsiasi molecola (fattori di crescita, molecole di segnalazione, anticorpi bloccanti, composti farmacologici come inibitori o attivatori, vettori, ecc.) dipende dalla sua emivita e solubilità. Questi parametri determinano anche il controllo appropriato da utilizzare.

5. Analisi molecolari e istologiche

1. Rimuovere il terreno di coltura.
2. Aggiungere con attenzione metanolo ghiacciato ai tessuti per evitare il distacco dai filtri.
3. Lasciare metanolo per 5 min.
4. Trasferire i filtri che trasportano gli espianti di tessuto alle provette di campionamento.
5. Fissare gli espianti in paraformaldeide al 4% in PBS per 10-24 h a 4 °C.
6. Procedere con protocolli stabiliti per l'elaborazione istologica (paraffina, congelati, ecc.) o immunocolorazioni.

6. Coltura di fette di tessuto

NOTA: Esistono diverse varianti a questo protocollo, che hanno tutte lo stesso successo e sono una questione di scelta personale, a seconda della velocità e dell'abilità dell'utente. Questi si riferiscono al tampone utilizzato per raccogliere e mantenere la vitalità dei tessuti. A tale scopo è possibile utilizzare il tampone di Krebs, PBS integrato con glucosio al 2% e antibiotici o PBS. Se si utilizza il tampone Krebs, deve essere preparato con 1 giorno di anticipo e mantenuto a 4 °C.

1. Prima dell'esperimento, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4%-5% sciogliendo 2-2,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 ml di glucosio/PBS bollente al 2%, dopodiché la soluzione deve essere posta a bagnomaria a 45 °C.
2. Impostare il vibratomo, lavare con etanolo al 70% e riempire con glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici (100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina).
3. Sezionare le estremità prossimali dell'incisivo e raccoglierle nel glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.
4. Posizionare un'estremità prossimale dell'incisivo nello stampo contenente il 4% -5% di agarosio a basso punto di fusione. Sotto uno stereomicroscopio, orientare il pezzo nella direzione desiderata e lasciare sul ghiaccio per l'agarosio per indurirsi.
5. Rifilate il blocco di agarosio indurito e posizionatelo nel vibratomo. Tagliare fette spesse (150-300 μm).
6. Raccogliere le fette in una capsula di Petri contenente glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.
7. Utilizzare una spatola per trasferire le fette spesse su un rettangolo di filtro posto sulla griglia preriscaldata preparata come al punto 1.3.
8. Incubare le fette spesse nell'incubatore e procedere con l'imaging (Figura 2).

Risultati

Le SC epiteliali risiedono in una nicchia chiamata ansa cervicale, che si trova all'estremità prossimale dell'incisivo (Figura 3A). Le anse cervicali sono strutture morfologicamente distinte composte da epitelio smaltato interno ed esterno che racchiudono il reticolo stellato, un nucleo di cellule epiteliali disposte liberamente (Figura 3B,C). Ci sono due anse cervicali in ogni incisivo (Figura 3A), ma solo l'ansa ...

Discussione

La coltura d'organo in vitro è stata ampiamente utilizzata per studiare il potenziale induttivo e le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano la crescita e la morfogenesi degli organi. Il laboratorio Thesleff ha dimostrato come adattare la modifica di Saxén della coltura di organi di tipo Trowell e usarla per studiare lo sviluppo dei denti¹⁴. Le condizioni riproducibili e i progressi nei reporter fluorescenti hanno reso questo un metodo utile per monitorare la morfogenesi dei d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors