Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Resumen

El método de cultivo de órganos tipo Trowell se ha utilizado para desentrañar redes de señalización complejas que gobiernan el desarrollo de los dientes y, más recientemente, para estudiar la regulación involucrada en las células madre del incisivo de ratón en continuo crecimiento. Los modelos animales de reporteros fluorescentes y los métodos de imágenes en vivo facilitan los análisis en profundidad de las células madre dentales y su microambiente de nicho específico.

Resumen

El desarrollo, la función y la regeneración de órganos dependen de las células madre, que residen dentro de espacios anatómicos discretos llamados nichos de células madre. El incisivo de ratón en continuo crecimiento proporciona un excelente modelo para estudiar células madre específicas de tejido. Las células madre específicas del tejido epitelial del incisivo se encuentran en el extremo proximal del diente en un nicho llamado asa cervical. Proporcionan una afluencia continua de células para contrarrestar la abrasión constante de la punta autoafilada del diente. Aquí se presenta un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo del extremo proximal del incisivo de ratón que alberga células madre y su nicho. Este es un protocolo modificado de cultivo de órganos tipo Trowell que permite el cultivo in vitro de piezas de tejido (explantes), así como los cortes gruesos de tejido en la interfaz líquido / aire en un filtro soportado por una rejilla metálica. El protocolo de cultivo de órganos descrito aquí permite manipulaciones de tejidos no factibles in vivo , y cuando se combina con el uso de un informador fluorescente, proporciona una plataforma para la identificación y el seguimiento de poblaciones de células discretas en tejidos vivos a lo largo del tiempo, incluidas las células madre. Varias moléculas reguladoras y compuestos farmacológicos pueden ser probados en este sistema por su efecto sobre las células madre y sus nichos. En última instancia, esto proporciona una herramienta valiosa para estudiar la regulación y el mantenimiento de las células madre.

Introducción

Los incisivos de ratón crecen continuamente debido a la preservación de por vida de las células madre (SC) que apoyan la producción incesante de componentes dentales. Estos incluyen SC epiteliales, que generan amemeloblastos productores de esmalte, y células madre mesenquimales (MSC), que generan odontoblastos productores de dentina, entre otras células¹. Los SC epiteliales en los incisivos de crecimiento continuo se identificaron inicialmente como células que retienen la etiqueta^2,3 y desde entonces se ha demostrado que expresan una serie de genes de tallo bien conocidos^, incluido Sox2⁴. Estas células comparten características comunes con los SC epiteliales en otros órganos y residen dentro del nicho SC llamado asa cervical ubicada en el lado labial del incisivo. El nicho es una entidad dinámica compuesta por células y matriz extracelular que controlan la actividad SC⁵. Los estudios de rastreo de linaje han demostrado que los SC epiteliales Sox2+ pueden regenerar todo el compartimiento epitelial del diente y que son cruciales para la formación de dientes sucesionales ^6,7. Las MSC con potencial reparador o regenerativo de dentina son reclutadas en gran medida desde fuera del órgano a través de vasos sanguíneos y nervios 8,9,10,11^, por lo tanto, proporcionando un modelo adecuado para estudiar el reclutamiento, la migración y el alojamiento de la población de MSC.

Estudiar SCs in vivo no siempre es factible, ya que muchas de las manipulaciones genéticas y/o farmacológicas pueden afectar a la homeostasis de los órganos y/o tener consecuencias letales. Por lo tanto, el cultivo de órganos proporciona una excelente herramienta para estudiar la regulación de SC y sus nichos in vitro. El sistema de cultivo de órganos que utiliza una rejilla metálica fue desarrollado inicialmente por Trowell¹² para estudiar el desarrollo de órganos y ha sido modificado por Saxen¹³ para estudiar las señales inductivas en el desarrollo renal. Desde entonces, este método in vitro de cultivo de la totalidad o parte del órgano se ha aplicado con éxito en diferentes campos. En el campo del desarrollo dental, este método ha sido ampliamente utilizado para estudiar las interacciones epitelial-mesenquimales que gobiernan el desarrollo dental¹⁴ y la formación de dientes sucesionales¹⁵. El trabajo del laboratorio de Thesleff ha demostrado la utilidad de este sistema para el análisis temporal del crecimiento y la morfogénesis dental, para el análisis del efecto de varias moléculas y factores de crecimiento en el crecimiento dental, y para la imagen en vivo de lapso de tiempo del desarrollo dental^16,17. Más recientemente, este método ha sido utilizado para estudiar la regulación de los SC incisivos y su nicho^18,19, que se describe en detalle aquí.

Protocolo

Este protocolo implica el uso de animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de Ética sobre el Uso y Cuidado de Animales y el Animalario de la Universidad de Helsinki.

1. Preparación de la placa de cultivo de órganos

1. Realice todos los procedimientos en una campana de flujo laminar. Limpie las superficies de trabajo con etanol al 70% y utilice instrumentos y soluciones de vidrio esterilizados en autoclave. Esterilice las tijeras y otros equipos metálicos en un esterilizador de cuentas de vidrio.
2. Prepare filtros normalmente almacenados en etanol al 70% lavándolos tres veces en 1x PBS para eliminar el etanol (Figura 1). Corte los filtros en trozos rectangulares (3 x 3-5 x 5 mm).
   NOTA: Las piezas filtrantes lavadas se pueden almacenar durante varios días en 1x PBS a 4 °C.
3. Preparar el medio de cultivo (DMEM:F12 1:1 suplementado con 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido en NaCl al 0,85%, FBS al 10%, ácido ascórbico 150 μg/ml y penicilina [10.000 UI/ml] al 0,2% y estreptomicina [10.000 μg/ml]). Conservar a 4 °C.
4. Coloque las rejillas metálicas de 30 mm (con orificios de 1-2 mm de diámetro que permiten obtener imágenes de tejidos) en una placa de Petri de 35 mm. Agregue suficientes medios para llegar a la superficie de la rejilla sin producir burbujas de aire. Precaliente la placa de cultivo preparada a 37 °C hasta que el tejido esté aislado y listo para el cultivo (en una incubadora estándar con 5% de_CO2 y 90%-95% de humedad).

2. Disección incisiva y aislamiento del extremo proximal

1. Sacrificar a los animales siguiendo un protocolo aprobado de cuidado de los animales.
2. Decapitar al ratón y diseccionar la mandíbula. Para ello, primero retira la piel para exponer la mandíbula y corta a través de los músculos maseteros para separarla del maxilar y del resto de la cabeza.
3. Una vez aislada la mandíbula, retire la lengua y la mayor cantidad de tejido blando posible.
4. Recoja todas las mandíbulas y manténgalas en una placa de Petri que contenga PBS en hielo, ya que esto mejora la viabilidad de los tejidos.
5. Transfiera una mandíbula a una placa de Petri de vidrio y use agujas hipodérmicas desechables de 20/26 G para diseccionar el incisivo bajo un microscopio estereoscópico. Dividir la mandíbula en la línea media, cortando a través de la sínfisis. Limpie el tejido blando y muscular lejos de la superficie ósea para una mejor visualización.
   NOTA: Una placa de Petri de vidrio es esencial, ya que esto no embotará las agujas.
6. Las mandíbulas obtenidas de animales menores de 10 días son más suaves y frágiles, por lo tanto, use agujas hipodérmicas desechables de 20/26 G para abrir cada mitad de la mandíbula longitudinalmente para exponer el diente incisivo. Para ratones mayores de 10 días, use pinzas para agarrar la mandíbula y romper el hueso para exponer el diente.
7. Separe suavemente el incisivo del hueso circundante y corte el extremo proximal, que contiene el asa cervical.
8. Corte el extremo proximal y retire el esmalte mineralizado y la matriz de dentina.
9. Mantenga los extremos proximales recolectados en el PBS de Dulbecco en hielo hasta que estén listos para el cultivo.

3. Cultura

1. Coloque cuidadosamente un rectángulo de filtro en la parte superior de una rejilla en un plato de cultivo precalentado.
2. Use un microscopio estereoscópico para orientar adecuadamente las piezas de tejido.
3. Colocar en una incubadora estándar a 37 °C con 5% de_CO2 y 90%-95% de humedad.
4. Cambie el medio cada dos días y reemplácelo con un medio fresco, evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Controle el crecimiento del tejido y fotografíe diariamente con una cámara conectada al estereomicroscopio.

4. Adición de factores solubles al cultivo

1. Complementar el medio de cultivo con factores solubles y moléculas de interés para estudiar su efecto sobre la regulación de SCs.
   NOTA: El protocolo de administración de cualquier molécula (factores de crecimiento, moléculas de señalización, anticuerpos bloqueadores, compuestos farmacológicos como inhibidores o activadores, vectores, etc.) depende de su vida media y solubilidad. Estos parámetros también determinan el control apropiado que se utilizará.

5. Análisis moleculares e histológicos

1. Retire el medio de cultivo.
2. Agregue cuidadosamente metanol helado a los tejidos para evitar que se desprendan de los filtros.
3. Dejar el metanol durante 5 min.
4. Transfiera los filtros que transportan los explantes de tejido a los tubos de muestreo.
5. Fijar los explantes en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-24 h a 4 °C.
6. Proceder con los protocolos establecidos para el procesamiento histológico (parafina, congelado, etc.) o inmunotinciones.

6. Cultivo de rodajas de tejido

NOTA: Hay varias variaciones de este protocolo, que son igualmente exitosas y son una cuestión de elección personal, dependiendo de la velocidad y la habilidad del usuario. Estos se refieren al tampón utilizado para recolectar y mantener la viabilidad del tejido. Para este propósito, se puede usar el tampón de Krebs, PBS suplementado con 2% de glucosa y antibióticos, o PBS. Si se utiliza tampón Krebs, debe hacerse con 1 día de antelación y mantenerse a 4 °C.

1. Antes del experimento, prepare una agarosa de bajo punto de fusión al 4% -5% disolviendo 2-2.5 g de agarosa de bajo punto de fusión en 50 ml de glucosa / PBS al 2% hirviendo, después de lo cual la solución debe colocarse en un baño maría a 45 ° C.
2. Configure el vibratomo, lávelo con etanol al 70% y llénelo con glucosa/PBS al 2% suplementado con antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina).
3. Diseccionar los extremos proximales del incisivo y recogerlos en el 2% de glucosa/PBS helado suplementado con antibióticos.
4. Coloque un extremo proximal del incisivo en el molde que contenga 4% -5% de agarosa de bajo punto de fusión. Bajo un microscopio estereoscópico, oriente la pieza en la dirección deseada y déjela en hielo para que la agarosa se endurezca.
5. Recorte el bloque de agarosa endurecido y colóquelo en el vibratomo. Cortar rodajas gruesas (150-300 μm).
6. Recoja las rodajas en una placa de Petri que contenga 2% de glucosa/PBS helada suplementada con antibióticos.
7. Utilizar una espátula para transferir las rodajas gruesas en un rectángulo filtrante colocado en la rejilla precalentada preparada como en la sección 1.3.
8. Incubar las rodajas gruesas en la incubadora y proceder con la obtención de imágenes (Figura 2).

Resultados

Los SC epiteliales residen en un nicho llamado asa cervical, que se encuentra en el extremo proximal del incisivo (Figura 3A). Los asas cervicales son estructuras morfológicamente distintas compuestas de epitelio del esmalte interno y externo que encierran el retículo estrellado, un núcleo de células epiteliales poco dispuestas (Figura 3B, C). Hay dos asas cervicales en cada incisivo (Figura 3A), pero solo el as...

Discusión

El cultivo de órganos in vitro se ha utilizado ampliamente para estudiar el potencial inductivo y las interacciones epitelial-mesenquimales que gobiernan el crecimiento de los órganos y la morfogénesis. El laboratorio de Thesleff ha demostrado cómo adaptar la modificación de Saxén del cultivo de órganos tipo Trowell y utilizarla para estudiar el desarrollo dental¹⁴. Las condiciones reproducibles y los avances en los reporteros fluorescentes han hecho de este un método útil para m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors