使用Trowell型器官培养研究牙科干细胞的调节

摘要

Trowell型器官培养方法已被用于解开控制牙齿发育的复杂信号网络，最近还用于研究与持续生长的小鼠门牙干细胞有关的调节。荧光报告动物模型和实时成像方法有助于对牙科干细胞及其特定的生态位微环境进行深入分析。

摘要

器官发育、功能和再生取决于干细胞，干细胞存在于称为干细胞生态位的离散解剖空间内。不断生长的小鼠门牙为研究组织特异性干细胞提供了一个极好的模型。门牙的上皮组织特异性干细胞位于牙齿的近端，位于称为颈环的壁龛中。它们提供持续的细胞流入，以抵消牙齿自锐尖端的持续磨损。这里介绍的是小鼠门牙近端分离和培养的详细方案，该门牙容纳干细胞及其生态位。这是一种改进的Trowell型器官培养方案，可以对组织碎片（外植体）以及由金属网格支撑的过滤器上的液体/空气界面处的厚组织切片进行 体外 培养。这里描述的器官培养方案使组织操作在 体内 不可行，并且当与荧光报告基因结合使用时，它为随着时间的推移鉴定和跟踪活组织中的离散细胞群（包括干细胞）提供了一个平台。可以在该系统中测试各种调节分子和药理化合物对干细胞及其生态位的影响。这最终为研究干细胞调控和维持提供了有价值的工具。

引言

由于干细胞（SC）的终身保存，小鼠门牙持续生长，这些干细胞支持牙齿成分的不断生产。这些包括产生产生牙釉质的釉质母细胞的上皮SCs和产生产生牙本质的牙母细胞的间充质干细胞（MSCs）以及其他细胞¹。连续生长的门牙中的上皮SCs最初被鉴定为标记保留细胞²，^3，此后已被证明表达许多众所周知的干性基因^，包括Sox2⁴。这些细胞与其他器官中的上皮SC具有共同特征，并且位于门牙唇侧称为颈环的SC壁龛内。生态位是由细胞和细胞外基质组成的动态实体，控制SC活性⁵。谱系追踪研究表明，Sox2+上皮SCs可以再生牙齿的整个上皮隔室，并且它们对于连续^{牙齿的形成}至关重要6^，7。具有牙本质修复或再生潜力的间充质干细胞主要通过血管和神经从器官外部招募8，⁹，¹⁰，¹¹，因此^，为研究MSC人群的招募，迁移和住房提供了合适的模型。

在体内研究SCs并不总是可行的，因为许多遗传和/或药物操作会影响器官稳态和/或具有致命的后果。因此，器官培养为体外研究SCs及其生态位的调控提供了极好的工具。利用金属网格的器官培养系统最初由Trowell¹²开发，用于研究器官发育，并由Saxen¹³进一步修改以研究肾脏发育中的感应信号。从那时起，这种培养整个或部分器官的体外方法已成功应用于不同领域。在牙齿发育领域，该方法已被广泛用于研究控制牙齿发育¹⁴和连续牙齿形成的上皮 - 间充质相互作用¹⁵。Thesleff实验室的工作已经证明了该系统在牙齿生长和形态发生的时间分析，分析各种分子和生长因子对牙齿生长的影响以及牙齿发育的延时实时成像方面的实用性^16，17。最近，该方法已被用于研究门牙SC及其生态位¹⁸，¹⁹的调节^，本文对此进行了详细描述。

研究方案

该协议涉及动物的使用，所有程序均已获得赫尔辛基大学动物使用和护理伦理委员会以及动物设施的批准。

1. 器官培养皿的制备

1. 在层流罩中执行所有程序。用70%乙醇清洁工作表面，并使用高压灭菌的玻璃仪器和溶液。在玻璃珠消毒器中对剪刀和其他金属设备进行消毒。
2. 通过在1x PBS中洗涤三次来制备通常储存在70%乙醇中的过滤器以除去乙醇（图1）。将过滤器切成矩形块（3 x 3-5 x 5 毫米）。
   注意:清洗过的滤片可以在4°C的1x PBS中储存数天。
3. 制备培养基（1:1 DMEM:F12 补充有 1% [v/v] 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，加入 0.85% NaCl、10% [v/v] FBS、150 μg/mL 抗坏血酸和 0.2% [v/v] 青霉素 [10，000 国际单位/mL] 和链霉素 [10，000 μg/mL]）。储存在4°C。
4. 将30 mm金属网格（具有1-2 mm直径的孔，可实现组织成像）置于35 mm培养皿中。添加足够的介质以到达网格表面而不会产生气泡。将制备好的培养皿在37°C下预热，直到组织被分离并准备培养（在具有5%CO₂ 和90%-95%湿度的标准培养箱中）。

2.门牙解剖和近端隔离

1. 按照批准的动物护理方案牺牲动物。
2. 斩首鼠标并解剖下颌骨。为此，首先去除皮肤以露出下颌骨，并切开咬肌以将其与上颌骨和头部其余部分分开。
3. 一旦下颌骨被分离，请尽可能多地去除舌头和软组织。
4. 收集所有下颌骨并将它们保存在含有PBS的培养皿中，因为这可以增强组织的活力。
5. 将一个下颌骨转移到玻璃培养皿中，并使用一次性20/26 G皮下注射针在体视显微镜下解剖门牙。在中线分开下颌骨，切开联合。清洁骨骼表面的柔软组织和肌肉组织，以获得更好的可视化效果。
   注意:玻璃培养皿是必不可少的，因为这不会使针头变钝。
6. 从10天以下的动物获得的下颌骨更柔软，更脆弱，因此，使用一次性20/26 G皮下注射针纵向打开下颌骨的每一半以露出门牙。对于10天以上的小鼠，用镊子夹住下颌骨并折断骨头以露出牙齿。
7. 轻轻地将门牙与周围的骨头分离，并切断包含颈环的近端。
8. 切开近端，去除矿化牙釉质和牙本质基质。
9. 将收集的近端保存在Dulbecco的PBS中，直到准备好培养。

3. 文化

1. 小心地将一个过滤器矩形放在预热培养皿中的网格顶部。
2. 使用体视显微镜正确定位组织碎片。
3. 置于37°C的标准培养箱中，CO₂ 为5%，湿度为90%-95%。
4. 每隔一天更换一次培养基，并更换为新鲜培养基，小心避免形成气泡。监测组织生长并使用连接到体视显微镜的相机每天拍照。

4. 在培养物中添加可溶性因子

1. 用感兴趣的可溶性因子和分子补充培养基，以研究它们对SC调节的影响。
   注意:任何分子（生长因子，信号分子，封闭抗体，药理化合物（例如抑制剂或激活剂，载体等）的给药方案取决于其半衰期和溶解度。这些参数还确定要使用的相应控件。

5. 分子和组织学分析

1. 取出培养基。
2. 小心地将冰冷的甲醇添加到组织中，以防止从过滤器上脱落。
3. 将甲醇放置5分钟。
4. 将携带组织外植体的过滤器转移到采样管中。
5. 将外植体固定在PBS中的4%多聚甲醛中，在4°C下10-24小时。
6. 继续进行已建立的组织学处理方案（石蜡、冷冻等）或免疫染色。

6. 组织切片培养

注意:此协议有几种变体，它们都同样成功，并且是个人选择的问题，具体取决于用户的速度和技能。这些是指用于收集和维持组织活力的缓冲液。为此，可以使用克雷布斯缓冲液，补充有2%葡萄糖和抗生素的PBS或PBS。如果使用克雷布斯缓冲液，应提前1天制作并保持在4°C。

1. 实验前，将2-2.5g低熔点琼脂糖溶解在50mL沸腾的2%葡萄糖/ PBS中制备4%-5%低熔点琼脂糖，然后将溶液置于45°C水浴中。
2. 设置振动切片机，用 70% 乙醇洗涤，并填充补充抗生素（100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素）的冰冷的 2% 葡萄糖/PBS。
3. 解剖门牙的近端，并将它们收集在补充抗生素的冰冷的2%葡萄糖/ PBS中。
4. 将门牙的一个近端放入含有4%-5%低熔点琼脂糖的模具中。在体视显微镜下，将工件定向到所需方向，并留在冰上让琼脂糖硬化。
5. 修剪硬化的琼脂糖块并将其放入振动切开器中。切厚片（150-300μm）。
6. 将切片收集在含有补充抗生素的冰冷 2% 葡萄糖/PBS 的培养皿中。
7. 使用刮刀将厚切片转移到放置在预热网格上的过滤器矩形上，如第 1.3 节所述。
8. 在培养箱中孵育厚切片并继续成像（图2）。

结果

上皮SCs位于称为颈环的壁龛中，该壁龛位于门牙的近端（图3A）。颈袢是形态上不同的结构，由内部和外部牙釉质上皮组成，包裹着星状网，星状网是松散排列的上皮细胞的核心（图3B，C）。每个门牙有两个颈袢（图3A），但只有唇颈袢包含SC。上皮SCs定位于星状网和颈袢尖端的相邻珐琅质上皮^20?...

讨论

体外 器官培养已被广泛用于研究控制器官生长和形态发生的诱导电位和上皮-间充质相互作用。Thesleff实验室已经展示了如何适应Trowell型器官培养的Saxén修饰，并将其用于研究牙齿发育¹⁴。荧光报告基因的可重复条件和进步使其成为监测牙齿形态发生和其中不同细胞群的有用方法。本文描述了如何应用该协议来研究上皮干细胞及其所在的微环境。

本文?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors