שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

Summary

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

Abstract

התפתחותם, תפקודם והתחדשותם של איברים תלויים בתאי גזע, השוכנים בתוך מרחבים אנטומיים בדידים הנקראים נישות תאי גזע. חותך העכבר הגדל ללא הרף מספק מודל מצוין לחקר תאי גזע ספציפיים לרקמות. תאי הגזע הספציפיים לרקמת האפיתל של החותך ממוקמים בקצה הפרוקסימלי של השן בנישה הנקראת לולאת צוואר הרחם. הם מספקים זרם מתמשך של תאים כדי לאזן את השחיקה המתמדת של קצה ההשחזה העצמית של השן. מוצג כאן פרוטוקול מפורט לבידוד ולתרבית של הקצה הפרוקסימלי של חותך העכבר המכיל תאי גזע ונישתם. זהו פרוטוקול תרבית איברים שונה מסוג Trowell המאפשר תרבית in vitro של חתיכות רקמה (explants), כמו גם את פרוסות הרקמה העבות בממשק נוזל/אוויר על מסנן הנתמך על ידי רשת מתכת. פרוטוקול תרבית האיברים המתואר כאן מאפשר מניפולציות רקמה שאינן ניתנות לביצוע in vivo , ובשילוב עם שימוש בכתב(ים) פלואורסצנטיים, הוא מספק פלטפורמה לזיהוי ומעקב אחר אוכלוסיות תאים בדידים ברקמות חיות לאורך זמן, כולל תאי גזע. ניתן לבדוק במערכת זו מולקולות רגולטוריות שונות ותרכובות פרמקולוגיות להשפעתן על תאי גזע ועל הנישות שלהם. זה בסופו של דבר מספק כלי רב ערך לחקר ויסות ותחזוקה של תאי גזע.

Introduction

החותכות של העכברים גדלות ברציפות הודות לשימור לכל החיים של תאי הגזע (SC) התומכים בייצור בלתי פוסק של רכיבי השן. אלה כוללים SCs אפיתל, אשר מייצרים אמלובלסטים המייצרים אמייל, ותאי גזע מזנכימליים (MSCs), אשר מייצרים אודונטובלסטים המייצרים דנטין, בין תאים אחרים¹. ה-SCs האפיתליאליים בחותכות הגדלות ברציפות זוהו בתחילה כתאים שומרי תווית^2,3 ומאז הוכחו כמבטאים מספר גני גזע ידועים^, כולל Sox2⁴. תאים אלה חולקים תכונות משותפות עם SCs אפיתל באיברים אחרים ושוכנים בתוך נישה SC הנקראת לולאת צוואר הרחם הממוקמת בצד הלאברי של החותך. הנישה היא ישות דינמית המורכבת מתאים ומטריצה חוץ-תאית השולטים בפעילות SC⁵. מחקרי מעקב אחר שושלת הראו כי Sox2+ אפיתל SCs יכול לחדש את כל תא האפיתל של השן וכי הם חיוניים ליצירת שן^{רציפה 6,7}. MSCs עם פוטנציאל תיקון או התחדשות של דנטין מגויסים ברובם מחוץ לאיבר דרך כלי דם ועצבים ^8,9,10,11, ולכן, מספקים מודל מתאים לחקר גיוס^, הגירה ודיור של אוכלוסיית MSC.

מחקר SCs in vivo אינו תמיד אפשרי, שכן רבות מהמניפולציות הגנטיות ו / או הפרמקולוגיות יכולות להשפיע על הומאוסטזיס איברים ו / או להיות בעלות השלכות קטלניות. לכן, תרבות איברים מספקת כלי מצוין לחקר הרגולציה של SCs ואת הנישות שלהם במבחנה. מערכת תרבית האיברים המשתמשת ברשת מתכת פותחה בתחילה על ידי Trowell¹² כדי לחקור את התפתחות האיברים ושונתה עוד יותר על ידי Saxen¹³ כדי לחקור אותות אינדוקטיביים בהתפתחות הכליות. מאז, שיטה זו במבחנה של culturing את כל או חלק של האיבר כבר מיושם בהצלחה בתחומים שונים. בתחום התפתחות השן, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות השולטות בהתפתחות השן¹⁴ והיווצרות שן עוקבת¹⁵. עבודתה של מעבדת Thesleff הדגימה את התועלת של מערכת זו לניתוח זמני של צמיחת שיניים ומורפוגנזה, לניתוח ההשפעה של מולקולות שונות וגורמי גדילה על צמיחת השן, ולהדמיה חיה בהילוך מהיר של התפתחות השן^16,17. לאחרונה, שיטה זו שימשה כדי ללמוד רגולציה של SCs חותך ואת הנישה שלהם^18,19, אשר מתואר בפירוט כאן.

Protocol

פרוטוקול זה כולל שימוש בבעלי חיים וכל הנהלים אושרו על ידי ועדות אתיות לשימוש וטיפול בבעלי חיים ומתקן בעלי חיים באוניברסיטת הלסינקי.

1. הכנת מנת תרבית האיברים

1. בצע את כל ההליכים במכסה מנוע זרימה למינרית. נקו משטחי עבודה עם 70% אתנול והשתמשו בכלי זכוכית ותמיסות אוטומטיות. לעקר מספריים וציוד מתכת אחר במעקר חרוזי זכוכית.
2. הכינו מסננים שבדרך כלל מאוחסנים ב-70% אתנול על-ידי שטיפתם שלוש פעמים ב-PBS אחד כדי להסיר אתנול (איור 1). חותכים מסננים לחתיכות מלבניות (3 x 3-5 x 5 מ"מ).
   הערה: ניתן לאחסן חתיכות מסנן שטופות במשך מספר ימים ב- PBS אחד ב- 4 °C.
3. הכן את מדיום התרבית (1:1 DMEM:F12 בתוספת 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד ב-0.85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ו-0.2% [v/v] פניצילין [10,000 I.U./mL] וסטרפטומיצין [10,000 מיקרוגרם/מ"ל]). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. מניחים את רשתות המתכת בקוטר 30 מ"מ (עם חורים בקוטר 1-2 מ"מ המאפשרים הדמיית רקמות) בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. הוסיפו מספיק מדיה כדי להגיע למשטח הרשת מבלי לייצר בועות אוויר. מחממים מראש את צלחת התרבית המוכנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהרקמה מבודדת ומוכנה לתרבית (באינקובטור סטנדרטי עם 5% CO₂ ו-90%-95% לחות).

2. דיסקציה חותכת ובידוד של הקצה הפרוקסימלי

1. להקריב את בעלי החיים בהתאם לפרוטוקול מאושר לטיפול בבעלי חיים.
2. ערפו את העכבר ונתחו את המנדיבל. כדי לעשות זאת, תחילה להסיר את העור כדי לחשוף את mandible לחתוך דרך שרירי maasseter כדי להפריד אותו מן maxilla ואת שאר הראש.
3. לאחר שהמנדיבל מבודד, הסר את הלשון וכמה שיותר רקמות רכות.
4. לאסוף את כל mandibles ולשמור אותם בצלחת פטרי המכיל PBS על קרח, כמו זה משפר את הכדאיות של הרקמות.
5. מעבירים מנדיבל אחד לצלחת פטרי זכוכית ומשתמשים במחטים היפודרמיות חד פעמיות של 20/26 גרם כדי לנתח את החותך תחת סטריאומיקרוסקופ. מפצלים את המנדיבל בקו האמצע, חותכים דרך הסימפיזה. נקו את הרקמה הרכה והשרירית הרחק משטח העצם להדמיה טובה יותר.
   הערה: צלחת פטרי זכוכית היא חיונית, מכיוון שזה לא יקהה את המחטים.
6. מנדיבלים המתקבלים מבעלי חיים מתחת לגיל 10 ימים הם רכים ושבריריים יותר, ולכן, השתמש במחטים חד פעמיות של 20/26 G hypodermic כדי לפתוח כל מחצית של המנדיבל לאורך כדי לחשוף את השן החותכת. לעכברים מעל גיל 10 ימים, השתמשו בפינצטה כדי לאחוז במנדיבל ולשבור את העצם כדי לחשוף את השן.
7. מנתקים בעדינות את החותך מהעצם שמסביב וחותכים את הקצה הפרוקסימלי, המכיל את לולאת צוואר הרחם.
8. חותכים את הקצה הפרוקסימלי ומסירים את האמייל המינרלי ואת מטריצת הדנטין.
9. שמור את הקצוות הפרוקסימליים שנאספו ב- PBS של דולבקו על הקרח עד שיהיה מוכן לתרבית.

3. תרבות

1. הניחו בזהירות מלבן מסנן על החלק העליון של הרשת בצלחת תרבית שחוממה מראש.
2. השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לכוון כראוי את חלקי הרקמה.
3. מניחים באינקובטור סטנדרטי ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ו-90%-95% לחות.
4. שנה את המדיום כל יומיים והחלף במדיום טרי, תוך הימנעות בזהירות מהיווצרות בועות אוויר. עקוב אחר צמיחת הרקמות וצלם מדי יום באמצעות מצלמה המחוברת לסטריאומיקרוסקופ.

4. הוספת גורמים מסיסים לתרבות

1. השלימו את מדיום התרבית עם גורמים מסיסים ומולקולות מעניינות כדי לחקור את השפעתם על ויסות ה-SCs.
   הערה: פרוטוקול הניהול של כל מולקולה (גורמי גדילה, מולקולות איתות, נוגדנים חוסמים, תרכובות פרמקולוגיות כגון מעכבים או אקטיבטורים, וקטורים וכו ') תלוי במחצית החיים ובמסיסות שלה. פרמטרים אלה קובעים גם את הפקד המתאים לשימוש.

5. ניתוחים מולקולריים והיסטולוגיים

1. הסר את מדיום התרבות.
2. הוסיפו בזהירות מתנול קר כקרח לרקמות כדי למנוע ניתוק מהמסננים.
3. השאירו מתנול למשך 5 דקות.
4. מסנני העברה הנושאים צמחי רקמה לצינורות דגימה.
5. לתקן את explants ב 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10-24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. המשך עם פרוטוקולים מבוססים לעיבוד היסטולוגי (פרפין, קפוא וכו ') או immunostainings.

6. תרבית של פרוסות רקמה

הערה: ישנן מספר וריאציות לפרוטוקול זה, שכולן מוצלחות באותה מידה והן עניין של בחירה אישית, בהתאם למהירות ולמיומנות של המשתמש. אלה מתייחסים למאגר המשמש לאיסוף ושמירה על כדאיות הרקמות. לשם כך, חיץ קרבס, PBS בתוספת 2% גלוקוז ואנטיביוטיקה, או PBS ניתן להשתמש. אם נעשה שימוש בחיץ קרבס, יש להכין אותו יום אחד מראש ולשמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

1. לפני הניסוי, הכינו 4%-5% אגרוז נקודת התכה נמוכה על ידי המסת 2-2.5 גרם של אגרוז נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של 2% גלוקוז/PBS רותחים, ולאחר מכן יש למקם את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס.
2. הניחו את הוויברטומה, שטפו ב-70% אתנול ומלאו ב-2% גלוקוז/PBS קרים כקרח בתוספת אנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין).
3. נתחו את הקצוות הפרוקסימליים של החותך ואספו אותם ב-2% גלוקוז/PBS קרים כקרח בתוספת אנטיביוטיקה.
4. מניחים קצה פרוקסימלי אחד של החותך בתבנית המכיל 4%-5% נקודת התכה נמוכה. תחת סטריאומיקרוסקופ, לכוון את היצירה בכיוון הרצוי ולהשאיר על הקרח עבור agarose להתקשות.
5. חותכים את גוש האגרוז הקשוח ומניחים אותו ברטט. חותכים פרוסות עבות (150-300 מיקרומטר).
6. אספו את הפרוסות בצלחת פטרי המכילה 2% גלוקוז/PBS קרים כקרח בתוספת אנטיביוטיקה.
7. השתמשו במרית כדי להעביר את הפרוסות העבות על מלבן מסנן המונח על הרשת המחוממת מראש שהוכנה כמו בסעיף 1.3.
8. דגרו את הפרוסות העבות באינקובטור והמשיכו בהדמיה (איור 2).

תוצאות

ה-SCs האפיתליאליים שוכנים בגומחה שנקראת לולאת צוואר הרחם, שנמצאת בקצה הפרוקסימלי של החותך (איור 3A). לולאות צוואר הרחם הן מבנים נבדלים מבחינה מורפולוגית המורכבים מאפיתל אמייל פנימי וחיצוני שעוטפים את הרשתית הכוכבית, ליבה של תאי אפיתל המסודרים באופן רופף (איור 3B,C

Discussion

תרבית איברים במבחנה שימשה באופן נרחב לחקר פוטנציאל אינדוקטיבי ואינטראקציות אפיתל-מזנכימליות השולטות בגדילת איברים ובמורפוגנזה. מעבדת Thesleff הדגימה כיצד להתאים את שינוי הסקסן של תרבית איברים מסוג טרוול ולהשתמש בה כדי לחקור את התפתחות השיניים¹⁴. התנאים הניתנים לשחזור וההת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors