Trowell Tipi Organ Kültürünün Diş Kök Hücrelerinin Düzenlenmesini Incelemek İçin Kullanılması

Özet

Trowell tipi organ kültürü yöntemi, diş gelişimini yöneten karmaşık sinyal ağlarını çözmek ve daha yakın zamanlarda, sürekli büyüyen fare kesici dişinin kök hücrelerinde yer alan düzenlemeleri incelemek için kullanılmıştır. Floresan muhabir hayvan modelleri ve canlı görüntüleme yöntemleri, dental kök hücrelerin ve bunların spesifik niş mikro çevrelerinin derinlemesine analizini kolaylaştırır.

Özet

Organ gelişimi, işlevi ve yenilenmesi, kök hücre nişleri adı verilen ayrı anatomik boşluklarda bulunan kök hücrelere bağlıdır. Sürekli büyüyen fare kesici dişi, dokuya özgü kök hücreleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. Kesici dişin epitel dokusuna özgü kök hücreleri, dişin proksimal ucunda, servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur. Dişin kendiliğinden keskinleşen ucunun sürekli aşınmasını dengelemek için sürekli bir hücre akışı sağlarlar. Burada, kök hücreleri ve nişlerini barındıran fare kesici dişinin proksimal ucunun izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu, doku parçalarının (eksplantlar) in vitro kültürünün yanı sıra metal bir ızgara tarafından desteklenen bir filtre üzerindeki sıvı/hava arayüzündeki kalın doku dilimlerini sağlayan modifiye edilmiş bir Trowell tipi organ kültürü protokolüdür. Burada açıklanan organ kültürü protokolü , in vivo olarak mümkün olmayan doku manipülasyonlarına olanak tanır ve floresan muhabir (ler) in kullanımı ile birleştirildiğinde, kök hücreler de dahil olmak üzere zaman içinde canlı dokulardaki ayrık hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izlenmesi için bir platform sağlar. Bu sistemde çeşitli düzenleyici moleküller ve farmakolojik bileşikler, kök hücreler ve nişleri üzerindeki etkileri açısından test edilebilir. Bu sonuçta kök hücre düzenleme ve bakımını incelemek için değerli bir araç sağlar.

Giriş

Fare kesici dişleri, diş bileşenlerinin kesintisiz üretimini destekleyen kök hücrelerin (SC) ömür boyu korunması nedeniyle sürekli büyür. Bunlar, diğer hücrelerin yanı sıra emaye üreten ameloblastlar üreten epitel SC'leri ve dentin üreten odontoblastlar üreten mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) içerir¹. Sürekli büyüyen kesici dişlerdeki epitel SC'leri başlangıçta etiket tutucu hücreler ^2,3 olarak tanımlandı ve o zamandan beri Sox2⁴ de dahil olmak üzere bir dizi iyi bilinen kök genini ifade ettiği gösterildi. Bu hücreler, diğer organlardaki epitel SC'leri ile ortak özellikleri paylaşır ve kesici dişin labial tarafında bulunan servikal döngü adı verilen SC nişi içinde bulunur. Niş, SC aktivitesini kontrol eden hücrelerden ve hücre dışı matristen oluşan dinamik bir varlıktır⁵. Soy izleme çalışmaları, Sox2+ epitel SC'lerinin dişin tüm epitel bölmesini yenileyebildiğini ve ardışık diş oluşumu için çok önemli olduğunu göstermiştir ^6,7. Dentin onarıcı veya rejeneratif potansiyeli olan MSC'ler büyük ölçüde organ dışından kan damarları ve sinirler yoluyla işe alınır 8,9,10,11, bu nedenle MSC popülasyonunun işe alımını^, göçünü ve barınmasını incelemek için uygun bir model sağlar.

SC'leri in vivo olarak incelemek her zaman mümkün değildir, çünkü genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonların çoğu organ homeostazını etkileyebilir ve / veya ölümcül sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, organ kültürü, SC'lerin ve nişlerinin in vitro olarak düzenlenmesini incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Metal bir ızgara kullanan organ kültürü sistemi başlangıçta organ gelişimini incelemek için Trowell¹² tarafından geliştirildi ve böbrek gelişiminde endüktif sinyalleri incelemek için Saxen¹³ tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, organın tamamını veya bir kısmını kültürlemek için bu in vitro yöntem, farklı alanlarda başarıyla uygulanmıştır. Diş gelişimi alanında, bu yöntem diş gelişimini yöneten epitel-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁴ ve ardışık diş oluşumu¹⁵. Thesleff laboratuvarının çalışması, bu sistemin diş büyümesi ve morfogenezinin zamansal analizi, çeşitli moleküllerin ve büyüme faktörlerinin diş büyümesi üzerindeki etkisinin analizi ve diş gelişiminin hızlandırılmış canlı görüntülenmesi için faydasını göstermiştir^16,17. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem kesici SC'lerin ve burada ayrıntılı olarak açıklanan niş^18,19'un düzenlenmesini incelemek için kullanılmıştır.

Protokol

Bu protokol hayvanların kullanımını içerir ve tüm prosedürler Helsinki Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulları ve Hayvan Tesisi tarafından onaylanmıştır.

1. Organ kültürü yemeğinin hazırlanması

1. Tüm prosedürleri laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirin. Çalışma yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin ve otoklavlanmış cam aletler ve çözeltiler kullanın. Makası ve diğer metal ekipmanları bir cam boncuk sterilizatöründe sterilize edin.
2. Etanol çıkarmak için normalde %70 etanolde depolanan filtreleri, 1x PBS'de üç kez yıkayarak hazırlayın (Şekil 1). Filtreleri dikdörtgen parçalar halinde kesin (3 x 3-5 x 5 mm).
   NOT: Yıkanmış filtre parçaları 4 °C'de 1x PBS'de birkaç gün saklanabilir.
3. Kültür ortamını hazırlayın (1:1 DMEM:F12, %0,85 NaCl'de %1 [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid, %10 [v/v] FBS, 150 μg/mL askorbik asit ve %0,2 [v/v] penisilin [10.000 I.U./mL] ve streptomisin [10.000 μg/mL]) ile desteklenir). 4 °C'de saklayın.
4. 30 mm'lik metal ızgaraları (doku görüntülemeyi mümkün kılan 1-2 mm çaplı deliklerle) 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Hava kabarcıkları üretmeden ızgara yüzeyine ulaşmak için yeterli ortam ekleyin. Hazırlanan kültür kabını, doku izole edilinceye ve kültüre hazır olana kadar 37 ° C'de önceden ısıtın (% 5 CO₂ ve% 90 -% 95 nem oranına sahip standart bir inkübatörde).

2. İnsizör diseksiyonu ve proksimal ucun izolasyonu

1. Onaylanmış bir hayvan bakım protokolünü izleyerek hayvanları kurban edin.
2. Farenin kafasını kesin ve mandibulayı parçalara ayırın. Bunu yapmak için, önce mandibulayı açığa çıkarmak için cildi çıkarın ve maksilladan ve başın geri kalanından ayırmak için masseter kaslarını kesin.
3. Mandibula izole edildikten sonra, dili ve mümkün olduğunca yumuşak dokuyu çıkarın.
4. Tüm mandibulaları toplayın ve buz üzerinde PBS içeren bir Petri kabında saklayın, çünkü bu dokuların yaşayabilirliğini arttırır.
5. Bir mandibulayı bir cam Petri kabına aktarın ve kesici parçayı bir stereomikroskop altında incelemek için tek kullanımlık 20/26 G hipodermik iğneler kullanın. Mandibulayı orta hatta bölün, simfizi kesin. Daha iyi görselleştirme için yumuşak ve kas dokusunu kemik yüzeyinden uzaklaştırın.
   NOT: Bir cam Petri kabı gereklidir, çünkü bu iğneleri köreltmez.
6. 10 günden küçük hayvanlardan elde edilen mandibulalar daha yumuşak ve daha kırılgandır, bu nedenle, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açmak için tek kullanımlık 20/26 G hipodermik iğneler kullanın. 10 günden eski fareler için, mandibulayı kavramak için cımbız kullanın ve dişi açığa çıkarmak için kemiği kırın.
7. Kesici kesiciyi çevreleyen kemikten yavaşça ayırın ve servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin.
8. Proksimal ucu kesin ve mineralize emaye ve dentin matrisini çıkarın.
9. Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

3. Kültür

1. Önceden ısıtılmış bir kültür kabına ızgaranın üstüne dikkatlice bir filtre dikdörtgeni yerleştirin.
2. Doku parçalarını düzgün bir şekilde yönlendirmek için bir stereomikroskop kullanın.
3. 37 °C'de %5 CO₂ ve %90-%95 nem oranına sahip standart bir inkübatöre yerleştirin.
4. Ortamı her gün değiştirin ve hava kabarcığı oluşumunu dikkatlice önleyerek taze ortamla değiştirin. Doku büyümesini izleyin ve stereomikroskopa bağlı bir kamera kullanarak günlük olarak fotoğraf çekin.

4. Kültüre çözünür faktörler eklemek

1. Kültür ortamını, SC'lerin düzenlenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için çözünür faktörler ve ilgilenilen moleküllerle destekleyin.
   NOT: Herhangi bir molekül için uygulama protokolü (büyüme faktörleri, sinyal molekülleri, bloke edici antikorlar, inhibitörler veya aktivatörler gibi farmakolojik bileşikler, vektörler, vb.) yarı ömrüne ve çözünürlüğüne bağlıdır. Bu parametreler aynı zamanda kullanılacak uygun kontrolü de belirler.

5. Moleküler ve histolojik analizler

1. Kültür ortamını kaldırın.
2. Filtrelerden ayrılmayı önlemek için dokulara buz gibi soğuk metanol ekleyin.
3. Metanolü 5 dakika bekletin.
4. Doku eksplantlarını numune alma tüplerine taşıyan filtreleri aktarın.
5. Eksplantları PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 4 ° C'de 10-24 saat sabitleyin.
6. Histolojik işlem (parafin, dondurulmuş, vb.) veya immün boyama için belirlenmiş protokollerle devam edin.

6. Doku dilimlerinin kültürü

NOT: Bu protokolde, hepsi eşit derecede başarılı olan ve kullanıcının hızına ve becerisine bağlı olarak kişisel seçim meselesi olan birkaç varyasyon vardır. Bunlar, doku canlılığını toplamak ve korumak için kullanılan tamponu ifade eder. Bu amaçla Krebs tamponu, %2 glikoz ve antibiyotik takviyeli PBS veya PBS kullanılabilir. Krebs tamponu kullanılıyorsa 1 gün önceden yapılmalı ve 4 °C'de tutulmalıdır.

1. Deneyden önce, 50 mL kaynama% 2 glikoz / PBS içinde 2-2.5 g düşük erime noktası agarozunu çözerek% 4-5 düşük erime noktası agarozu hazırlayın, daha sonra çözelti 45 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilmelidir.
2. Vibratomu ayarlayın,% 70 etanol ile yıkayın ve antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk% 2 glikoz / PBS ile doldurun (100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin).
3. Kesici dişin proksimal uçlarını inceleyin ve bunları antibiyotiklerle desteklenmiş buz soğuk% 2 glikoz / PBS'de toplayın.
4. Kesici dişin bir proksimal ucunu% 4 -% 5 düşük erime noktası agarozu içeren kalıba yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, parçayı istenen yöne yönlendirin ve agarozun sertleşmesi için buz üzerinde bırakın.
5. Sertleştirilmiş agaroz bloğunu kesin ve vibratoma yerleştirin. Kalın dilimleri (150-300 μm) kesin.
6. Dilimleri, antibiyotiklerle desteklenmiş% 2 glikoz / PBS içeren buz gibi soğuk% 2 glikoz / PBS içeren bir Petri kabında toplayın.
7. Kalın dilimleri, bölüm 1.3'te olduğu gibi hazırlanmış önceden ısıtılmış ızgara üzerine yerleştirilmiş bir filtre dikdörtgeni üzerine aktarmak için bir spatula kullanın.
8. İnkübatördeki kalın dilimleri inkübe edin ve görüntülemeye devam edin (Şekil 2).

Sonuçlar

Epitel SC'leri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur (Şekil 3A). Servikal döngüler, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan stellat retikulumu çevreleyen iç ve dış emaye epitelinden oluşan morfolojik olarak farklı yapılardır (Şekil 3B, C). Her kesici dişte iki servikal döngü vardır (Şekil 3A), ancak sadece labial servik...

Tartışmalar

İn vitro organ kültürü, organ büyümesini ve morfogenezi yöneten endüktif potansiyeli ve epitelyal-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Thesleff laboratuvarı, Trowell tipi organ kültürünün Saxén modifikasyonunun nasıl uyarlanacağını ve diş gelişimini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiştir¹⁴. Floresan muhabirlerindeki tekrarlanabilir koşullar ve ilerlemeler, bunu diş morfogenezini ve içindeki farklı hücre po...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors