حقن ناقلات AAV لعلم البصريات الوراثي في الدماغ الرئيسيات غير البشرية المخدر والمستيقظ

Summary

وكما هو مطبق حاليا، فإن علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية يتطلب حقن النواقل الفيروسية في الدماغ. يجب أن تكون طريقة الحقن المثلى موثوقة ، وبالنسبة للعديد من التطبيقات ، قادرة على استهداف المواقع الفردية ذات العمق التعسفي التي يتم تحديدها بسهولة وبشكل لا لبس فيه في علم الأنسجة بعد الوفاة. يتم تقديم طريقة حقن مع هذه الخصائص.

Abstract

أحدثت التقنيات البصرية الجينية ثورة في أبحاث علم الأعصاب وهي على وشك أن تفعل الشيء نفسه في العلاج الجيني العصبي. ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لعلم البصريات الوراثي يتطلب إثبات السلامة والفعالية في النماذج الحيوانية ، ومن الناحية المثالية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) ، بسبب تشابهها العصبي مع البشر. عدد المتجهات المرشحة التي يحتمل أن تكون مفيدة لعلم الأعصاب والطب هائل ، ولا توجد حتى الآن وسائل عالية الإنتاجية لاختبار هذه النواقل. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات لإجراء حقن متعددة دقيقة مكانيا وحجميا للناقلات الفيروسية في دماغ NHP والتي يمكن تحديدها بشكل لا لبس فيه من خلال علم الأنسجة بعد الوفاة. الموصوفة هنا هي مثل هذه الطريقة. يتم تصنيع قنيات الحقن من أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين وأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ. هذه القنيبات قابلة للتعقيم ، ويمكن التخلص منها ، ولها أحجام تحميل منخفضة ، مما يجعلها مثالية لحقن محاليل ناقلات فيروسية باهظة الثمن وعالية التركيز. يملأ الزيت المعدني الخامل المصبوغ باللون الأحمر المساحة الميتة ويشكل غضروفا مفصليا مرئيا بمحلول متجه ، مما يسمح بقياس فوري ودقيق لمعدلات الحقن وأحجامه. يتم تحميل الزيت في الجزء الخلفي من القنية ، مما يقلل من خطر الحقن المشترك مع الناقل. يمكن تحميل Cannulas في 10 دقائق ، ويمكن إجراء الحقن في 20 دقيقة. هذا الإجراء مناسب تماما للحقن في الحيوانات المستيقظة أو المخدرة. عند استخدامه لتقديم ناقلات فيروسية عالية الجودة ، يمكن أن ينتج هذا الإجراء تعبيرا قويا عن البروتينات البصرية الجينية ، مما يسمح بالتحكم البصري في النشاط العصبي والسلوك في NHPs.

Introduction

عادة ما ينطوي علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) على حقن الناقل الفيروسي مباشرة في الدماغ. تعتمد فئة واحدة من النواقل المناسبة تماما لهذا التطبيق على الفيروس المرتبط بالغدي (AAV). تتكون هذه النواقل من قفيصة بروتين تحيط بجينوم الحمض النووي أحادي الخيط الذي يتكون بدوره من مروج ، وجين أوبسين ، واختياريا ، عناصر أخرى لترميز البروتين وتنظيم الجينات. وقد يسر التقدم المحرز في الاستنساخ الجزيئي التلاعب بهذه المكونات والجمع بينها من أجل تطوير ناقلات جديدة. وبالتالي ، فإن مجموعة ناقلات AAV التي يحتمل أن تكون مفيدة ل NHP البصريات الوراثية كبيرة وتنمو بسرعة.

في الوقت الحاضر ، تتطلب فائدة ناقل AAV لعلم البصريات الوراثي NHP الاختبار في الجسم الحي. وتشكل هذه الحقيقة عائقا كبيرا أمام التقدم. يجب استخدام الحيوانات بشكل مقتصد ، ويتطلب اختبار ناقلات متعددة في واحد وضع مواقع الحقن بحكمة بالنسبة للبنية العصبية وفصلها جيدا بالنسبة لانتشار الفيروس. يتطلب التقييم النسيجي الدقيق أن تكون الحقن دقيقة مكانيا وحجميا. تم تكييف تقنية الحقن المستخدمة سابقا للتوصيل البؤري للعوامل الدوائية¹،^2،3،4 وتبسيطها لإجراء مثل هذه الحقن. تقنية الحقن هذه غير مكلفة ، وتستخدم مكونات يمكن التخلص منها وتعقيمها ، ويمكن استخدامها في القرود المخدرة أو المستيقظة ، ويمكن استخدامها لاستهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. يصف البروتوكول التالي الإجراءات خطوة بخطوة لتصنيع المكونات التي يمكن التخلص منها وإجراء الحقن في دماغ NHP. تتم مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر وتجاوزت الحد الأدنى من المتطلبات الموصى بها من قبل معهد الموارد الحيوانية المختبرية وجمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات. تم تقييم جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة واشنطن (UW IACUC protocol #4167-01). شارك في هذه الدراسة خمسة من المكاك الصحية (2 المكاكا مولاتا ، 3 المكاكا نيميسترينا ؛ الذكور 4-11 سنة). تم استخدام الأدوات والتقنيات المعقمة في جميع العمليات الجراحية.

1. صنع قنية (الشكل 1 أ)

1. إعداد كل جزء
   1. قم بفك طرف إبرة تحت الجلد (30 جم ، طول 13 مم) باستخدام مطحنة قرص.
   2. قطع أنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ (30 جم ، القطر الداخلي = 0.16 مم ، القطر الخارجي = 0.31 مم) إلى طول مصمم خصيصا لعمق منطقة الدماغ المستهدفة (25 مم مناسب تماما لحقن السطح الظهري للقشرة الدماغية). باستخدام مطحنة القرص ، قم بشطب أحد طرفي الأنبوب المقطوع وقم بتنعيم الطرف الآخر. Deburr داخل الأنبوب مع بروش.
   3. اقطع أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين (PFTE) (القطر الداخلي = 0.23 مم ± 0.02 مم ، الجدار = 0.23 مم ± 0.02 مم ، 1 مم يتوافق مع 42 nL ± 7 nL من السائل) إلى طول مناسب لكمية المحلول المتجه المراد تحميله (1 ميكرولتر من محلول المتجه يشغل 24 مم من الأنابيب). توهج طرفي أنبوب PTFE عن طريق إدخال إبرة تحت الجلد المخففة.
2. أدخل الإبرة تحت الجلد المخففة حوالي 5 مم في أحد طرفي أنبوب PTFE. أدخل الطرف غير المشطوف من الأنبوب المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ حوالي 5 مم في الطرف الآخر (الشكل 1A).
3. قم بإجراء اختبار ما قبل الحقن. حقن المياه المصفاة من خلال محور الإبرة تحت الجلد من قنية. تأكد من خروج الماء من أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ المشطوف من الطرف وأن الماء لا يتسرب من أي من التقاطعين.

2. إجراء الحقن للحيوانات المخدرة

1. التحضير للجراحة
   1. تعقيم الأدوات واللوازم الجراحية باستخدام الإجراءات الواردة في جدول المواد.
   2. إذا لزم الأمر، خذ التصوير بالرنين المغناطيسي للرأس لاستهداف هياكل الدماغ العميقة (الشكل 2A).
   3. مباشرة قبل الجراحة ، قم بتخدير الحيوانات بالكيتامين (10-15 مجم / كجم) وإعطاء المضادات الحيوية (سيفازولين) والمسكنات (البوبرينورفين المستدام والميلوكسيكام) في العضل. ثم، قم بتوصيل البروبوفول عن طريق القسطرة الوريدية (IV) في الأوردة الصافية أو الرأسية.
   4. تنبيب الحيوان ونقله إلى غاز الايزوفلوران. تأكد من التخدير المناسب عن طريق استقرار معدل ضربات القلب وضغط الدم ومعدل التنفس واسترخاء العضلات الهيكلية وعدم وجود ردود فعل جحوب أو انسحاب.
   5. حلق رأس الحيوان. ضع مرهم مسيل للدموع الاصطناعي على القرنيات لمنع التجفيف.
2. إعداد منطقة الحقن
   1. ضع رأس الحيوان في الإطار المجسم. ضع محلول فرك جراحي على الجلد الحليق باستخدام إسفنج الشاش ، وقم بتطبيق ضغط لطيف لإطلاق أي حطام ، وشطفه بكحول الأيزوبروبيل. كرر هذه العملية ثلاث مرات. تغطية الحيوان مع ستارة معقمة fenested. شق الجلد وتعكس العضلات. ضع المتلاعب على الذراع المجسمة ، وضعه لاستهداف منطقة الدماغ المستهدفة ، ووضع علامة على موضع بضع القحف على الجمجمة بقلم معقم.
   2. قم بإزالة المتلاعب المجسمة وقم بإجراء بضع القحف. شق الجافية إذا رغبت في ذلك (على سبيل المثال ، لتصور المعالم الكبريتية). أعد المتلاعب إلى الذراع المجسمة.
3. تحميل محلول المتجه (الشكل 1C)
   1. انقل المحلول المتجه برفق إلى أنبوب PCR معقم باستخدام ماصة P20 ، وتجنب الفقاعات.
   2. قم بإرفاق قنية ، مع توجيه الطرف المشطوف لأسفل ، بحامل ستيريوتاكسي موجه رأسيا. قم بتوصيل حقنة Luer-lock سعة 1 مل بمحور الإبرة تحت الجلد في الكانيولا.
   3. اغمر الطرف المشطوف من القنية في محلول المتجه.
      ملاحظة: يجب إرفاق المحقنة بالفعل ؛ إن إرفاقه في هذه المرحلة من شأنه أن يدخل فقاعات في محلول المتجهات.
   4. قم بتحميل المحلول في القنية عن طريق تطبيق ضغط سلبي لطيف باستخدام حقنة 1 مل. تتبع بصريا الغضروف المفصلي بين الحل والهواء.
   5. بمجرد تحميل محلول المتجه ، استمر في الضغط السلبي اللطيف حتى يصل المحلول إلى محور الإبرة. قم بإزالة حقنة 1 مل وحقن الزيت المعدني الملون في محور الإبرة تحت الجلد.
      ملاحظة: يجب حقن الزيت ببطء على طول الجدار الداخلي لمحور الإبرة لتشكيل غضروف مفصلي واضح مع محلول المتجه ولتجنب فقاعات الهواء.
   6. قم بتوصيل محور الإبرة تحت الجلد بأحد المنفذين المفتوحين لجهاز إيقاف Luer-lock في 3 اتجاهات.
      ملاحظة: سيؤدي ربط الإبرة تحت الجلد بالمنفذ المغلق إلى ضغط هواء غير مرغوب فيه خلف الزيت.
   7. أغلق المنفذ المتصل بمحور الإبرة تحت الجلد ، واملأ حقنة 1 مل بالهواء ، وقم بتوصيلها بأي من المنفذين الآخرين. أخيرا ، أغلق المنفذ المتبقي من السدادة لتوصيل المحقنة بالقنية.
   8. ادفع الهواء ببطء إلى الكانيولا. بمجرد ظهور الزيت الملون عند طرف الإبرة الحادة في أنبوب PTFE ، تحقق من وجود هواء بين المحلول والزيت الملون.
   9. في حالة وجود الهواء ، ضع ضغطا سلبيا على المحقنة لإعادة الزيت الملون إلى محور الإبرة. قم بإزالة الفقاعة وتطبيق ضغط إيجابي حتى تظهر قطرة من محلول المتجه عند طرف القنية المشطوف.
   10. قم بإزالة حقنة 1 مل لإطلاق ضغط الهواء غير المرغوب فيه خلف الزيت وأغلق السدادة لمنع المتجه من الخروج من القنية عن طريق الجاذبية.
   11. قم بلصق مسطرة بلاستيكية بأنبوب PTFE لقياس حركة الغضروف المفصلي أثناء الحقن (الشكل 1B و D و F).
4. إدخال قنية في منطقة الدماغ المستهدفة (الشكل 1B)
   1. قم بلصق القنية على المتلاعب المجسم.
   2. انقل أنبوب المضخة يدويا (الذي ينتهي في موصل Luer-lock) من المساعد غير المعقم إلى الجراح. يجب على الجراح الإمساك بموصل Luer-lock من خلال جدار الأكمام المعقمة ، وتثبيت سدادة معقمة ثانية على الموصل ، وربط الأكمام بإحكام حوله ، ثم إسقاط طوق الأكمام ، مما يسمح له بالتمدد على طول الأنبوب عن طريق الجاذبية.
   3. قم بتوصيل السدادة المرفقة بأنبوب القنية ب stopcock المتصل بمضخة الهواء. اضبط مضخة الهواء على الضغط المنخفض ، وقم بتشغيلها ، وقم بزيادة الضغط حتى يتقدم الزيت عبر القنية وتظهر قطرة من محلول المتجه عند طرف الكانيولا.
   4. اضبط موضع المسطرة البلاستيكية على أنبوب PTFE لقياس حركة الغضروف المفصلي أثناء الحقن.
   5. قم بدفع القنية لأسفل باستخدام المتلاعب المجسمة وسجل العمق الذي يصل إليه الطرف على السطح (dura أو pia mater).
   6. قم بقيادة القنية إلى أعمق موقع ليتم حقنه على طول المسار. سوف يغمر السطح. في حالة حقن القشرة السطحية، تأكد بصريا من أن القنية قد اخترقت السطح، باستخدام المجهر الجراحي أو اللوب المكبرة إن وجدت.
   7. لتقليل سوء الاستهداف بسبب ضغط الأنسجة ، قم بقيادة القنية ببطء (1 مم / دقيقة) ، أو بسرعة (0.5 مم / ثانية) مع انتظار لمدة 1-5 دقائق في الأسفل ، أو تجاوز أعمق موقع حقن بمقدار 500 ميكرومتر ثم تراجع.
5. حقن
   1. حقن 0.5 ميكرولتر من محلول المتجه باستخدام مضخة الهواء الكهربائية التي تزيد عن 10-30 ثانية. تأكد من تدفق الحقن عن طريق تتبع الغضروف المفصلي بين الزيت الملون والمحلول المتجه في أنبوب PTFE.
   2. انتظر لمدة 1 دقيقة وتراجع القنية إلى موقع الحقن التالي على طول المسار.
   3. بعد الحقن النهائي ، اترك القنية في مكانها لمدة 10 دقائق لتجنب التدفق المتجه.
   4. سحب القنية والتخلص منها في حاوية حادة المخاطر البيولوجية.
   5. اختياريا، حقن كمية صغيرة (≤1 ميكرولتر) من الميكروبيدات الفلورية بالقرب من موقع حقن النواقل لتسهيل تحديد موقع الحقن بعد الوفاة.
   6. كرر هذا الإجراء حسب الرغبة لحلول المتجهات الأخرى في مواقع أخرى (الشكل 2B).
6. إغلاق الجراحة
   1. خياطة الجافية، والعضلات، والجلد.
   2. قم بإزالة القرد من الإطار المجسم، وقم بإزالة جميع كابلات الشاشة.
   3. إزالة القرد من تخدير الايزوفلوران و extubate بعد عودة منعكس البلع.
   4. توفير العلاج بعد الجراحة (3-5 أيام من الميلوكسيكام و 7-10 أيام من سيفاليكسين). راقب الحيوان مرة واحدة على الأقل كل 10 دقائق حتى يتمكن من الحفاظ على وضع جلوس مستقيم مستقر.

3. الجراحة وحقن ناقلات AAV للحيوانات التي تتصرف مستيقظة (الشكل 1D)

ملاحظة: يمكن استخدام نوع مختلف من هذه التقنية لإجراء الحقن في أدمغة القرود المستيقظة ، التي تتصرف ، كما هو موضح أدناه.

1. الحقن المتزامن مع التسجيل
   1. لتسجيل النشاط الكهربائي في موقع الحقن ، قم بتغطية الجزء الخارجي من القنية بالإيبوكسي (أسفل ~ 15 مم) وأنابيب البوليميد (الطول المتبقي). اكشف عن المعدن عند الطرف عن طريق كشط الإيبوكسي منه (Injectrode، الشكل 1F)². بدلا من ذلك ، أدخل القنية وقطب كهربائي منفصل خارج الخلية ، جنبا إلى جنب ، في أنبوب توجيه مزدوج البرميل (أنبوب توجيه مزدوج البرميل ، الشكل 1E).
2. إدخال قنية في منطقة الدماغ المستهدفة.
   1. ضع القرد في المقصورة التجريبية ، وتقييد حركة الرأس ، وتنظيف غرفة التسجيل المثبتة على الجمجمة باستخدام التقنيات القياسية.
   2. قم بتأمين أنبوب توجيه إلى محرك الأقراص الصغير. أدخل قنية الحقن في أنبوب التوجيه.
   3. تقدم القنية حتى يبرز الطرف من أنبوب التوجيه.
   4. قم بتوصيل السدادة بمضخة الهواء الكهربائية. لتأكيد وظيفة النظام المناسبة ، ادفع قطرة من محلول المتجه من الطرف باستخدام مضخة الهواء وتأكد من حركة الغضروف المفصلي لمحلول ناقلات النفط.
   5. اسحب القنية ~ 5 مم إلى أنبوب التوجيه لحمايتها من التلف أثناء إدخال الأنبوب في الدماغ. أدخل أنبوب التوجيه في الدماغ.
   6. قم بدفع القنية إلى الموقع ليتم حقنها باستخدام محرك الأقراص الصغير. تحديد الموقع المستهدف إما عن طريق التسجيل الكهربائي (الشكل 2C) أو التحفيز.

الشكل 1: إعداد الجراحة والجهاز . (أ) قنية الحقن. يشار إلى كل جزء من الكانيولا. مضمن في أسفل اليمين: صورة مكبرة لطرف القنية، شريط مقياس: 500 ميكرومتر. (ب) إعداد الجراحة للقرود المخدرة. يتم وضع القرد في إطار مجسمة تحت ستارة جراحية. يتم توصيل جهاز التنفس الصناعي (V) والخط الوريدي (IV) وجهاز مراقبة ضغط الدم (BP) وجهاز مراقبة تشبع الأكسجين (O₂) بالقرد. يتم إدخال قنية الحقن في المنطقة المستهدفة باستخدام جهاز مناور مجسم. يتم حقن المحلول المتجه بواسطة مضخة هواء كهربائية (داخلية من أسفل اليسار ، بني) مقترنة بضاغط هواء (داخلي أسفل يسار ، أزرق). يتم لصق مسطرة بلاستيكية (الجزء الداخلي العلوي) على أنبوب PTFE لقياس حركة الغضروف المفصلي بين الزيت الملون (الجزء الداخلي العلوي ، الأحمر) والمحلول المتجه (الجزء الداخلي العلوي ، الواضح) أثناء الحقن. (ج) الإعداد لتحميل الحل المتجه في قنية. (د) أثناء حقن محلول ناقل في كشك تجريبي. يتم تثبيت رأس الحيوان في مكانه بواسطة ثلاث وظائف تثبيت ، ويتم تسجيل موضع العين بواسطة نظام ملف البحث الصلب. يتم تثبيت قنية الحقن ودفعها إلى العمق المستهدف باستخدام حامل / سائق قطب كهربائي صغير. يتم التحكم في الحقن عن طريق مراقبة الغضروف المفصلي بين الزيت الملون ومحلول المتجه من خلال كاميرا USB (صورة مضمنة). (ه) حقن أنبوب التوجيه مزدوج البرميل. حامل / سائق أنبوب توجيه مزدوج البرميل يحمل قنية حقن وقطب كهربائي دقيق (انظر المضمن). (و) الحقن. المعدن الموجود في طرف القنية ، المكشوف عن طريق كشط معطف الإيبوكسي ، يوفر الوصول الكهربائي إلى الخلايا العصبية (مدمج ، شريط مقياس: 500 ميكرومتر). (ز) إعداد التحفيز بالليزر. يحمل حامل/سائق أنبوب التوجيه مزدوج الأسطوانة كلا من الألياف البصرية والقطب الكهربائي الدقيق (انظر المضمن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رسم تخطيطي لمواقع حقن AAV . (أ) قسم القوس من صورة التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ يظهر مواقع الحقن في القشرة الحركية الأولية والقشرة البصرية الأولية ل Macaca nemestrina. (ب) منظر من السطح الظهري على صفيحة أطلس المقابلة يظهر موضع القنية بالنسبة إلى التلم المركزي (القشرة الحركية الأولية) والقشرة البصرية الأولية. (ج) وحدة التسجيل عن طريق الحقن في كوليكولوس العليا. اختفت الوحدة التي تم عزلها قبل الحقن (الجزء العلوي الأيمن) بعد الحقن (الجزء السفلي الأيمن). (د) مسار الحقن (الأسهم البيضاء). شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. معالجة أنسجة المخ لعلم الأنسجة

1. انتظر 6-8 أسابيع بعد الحقن لتحقيق أقصى قدر من التعبير الجيني المتغير.
   ملاحظة: تعتمد المدة المثلى على الناقل الفيروسي الدقيق المستخدم في التجربة.
2. معالجة الدماغ باستخدام التقنيات النسيجية التقليدية لتقييم كفاءة النقل والانتقائية^5،6،7.

النتائج

لإثبات التعبير الجيني المحور عن طريق الحقن المجسمة في الجسم الحي في دماغ NHP باستخدام طريقة الحقن الجراحية الموضحة هنا ، تم اختيار اثنين من النواقل التي تحتوي على معززات تقود التعبير عن بروتين الفلورسنت الأصفر الفائق -2 (SYFP2) في أنواع الخلايا العصبية المتميزة ^8,9. تم تعبئة النواقل الفيروسية في قفيصة PHP.eB¹⁰ ، التي تم تنقيتها بواسطة الطرد المركزي لليوديكسانول ، ثم تركزت إلى عيار عال (>1E13 الجينوم الفيروسي / مل) كما تم قياسه بواسطة qPCR. تم حقن حجم 0.5 ميكرولتر في كل من الأعماق العشرة على طول عشرة مسارات عبر القشرة الدماغية لحجم حقن إجمالي قدره 5 ميكرولتر / مسار. يوضح الشكل 3A-C تعبير SYFP2 عن طريق التلطيخ المناعي المضاد ل GFP بعد 113 يوما من حقن متجه AAV الخاص بالفئة الفرعية PVALB ، CN2045 ، في القشرة البصرية الأولية لذكر بالغ من المكاكا نيميسترينا. تم الكشف عن الجين المتحول SYFP2 بقوة في العديد من الخلايا العصبية غير الهرمية المنتشرة عبر العمق القشري ، وكانت معظم الخلايا العصبية المعبرة عن SYFP2 أيضا مناعية ل PVALB⁷. يوضح الشكل 3D تعبير SYFP2 الأصلي في القشرة الحركية الأولية بعد 64 يوما من حقن متجه AAV الخاص بالفئة الفرعية للخلايا العصبية L5 ، CN2251. تحتوي جميع الخلايا العصبية التي تحمل علامة SYFP2 على مورفولوجيا هرمية واضحة مع سوماتا تقتصر على الطبقة 5 والتشعبات القمية السميكة المميزة. تظهر هذه البيانات بشكل لا لبس فيه التحكم الدقيق في التعبير الجيني المحور في مجموعات مختارة من الخلايا العصبية القشرية الجديدة في دماغ NHP عن طريق الحقن المجسمة لنوع الخلايا التي تستهدف ناقلات AAV.

الشكل 3: مثال على تعبير SYFP2 الخاص بنوع الخلية بوساطة متجهات AAV التي يتم حقنها في دماغ NHP . (A) التصوير المجهري الضوئي اللامع لمقطع ثابت من قشرة المكاك البصرية الأولية بعد 113 يوما من حقن متجه AAV خاص بفئة PVALB. شريط الميزان: 1 مم.  (ب، ج) صورة تكبير أعلى للمنطقة المربعة تظهر في A. (ب) إشارة مضادة ل GFP. (ج) إشارة مضادة ل PVALB. أشرطة المقياس: 250 ميكرومتر (D) التصوير المجهري الضوئي Epifluororescence من التألق الأصلي SYFP2 في قسم ثابت من قشرة المكاك الحركية الأولية بعد 64 يوما من حقن متجه AAV خاص بالطبقة 5 خارج الدماغ. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لإثبات فائدة تقنية الحقن هذه للتلاعبات البصرية الفسيولوجية العصبية والسلوكية ، تم إجراء ثلاث تجارب ، كل منها على مختلف (Macaca mulatta). في التجربة الأولى (الشكل 4A-D) ، تم حقن ناقلات AAV التي تحمل الجين المحوري channelrhodopsin-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) في كوليكولوس العلوي الأيسر (SC). تم حقن المتجه كل 250 ميكرومتر على عمق 19 لما مجموعه 12 ميكرولتر. في التجربة الثانية (الشكل 4E-G) ، تم حقن 3 ميكرولتر من محلول AAV1-hSyn-ArchT-EYFP في النواة الشبكية tegmenti pontis (NRTP). في التجربة الثالثة (الشكل 4H-K) ، تم حقن 24 ميكرولتر من محلول AAV9-L7-ChR2-mCherry في قشرة المخيخ ⁶. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من كل حقنة ، تم إدخال ألياف بصرية وقطب التنغستن في الدماغ عبر أنبوب توجيه مزدوج البرميل (الشكل 1G).

يوضح الشكل 4B استجابة خلية عصبية SC للضوء الأزرق (450 نانومتر). أنتج الضوء المستمر (1.2 ثانية) عند 40 ميجاوات سلسلة من إمكانات الحركة المتتالية (الشكل 4B ، الأعلى). فشلت نبضات الضوء التي تبلغ مدتها 1 مللي ثانية في استحضار إمكانات الفعل عند 40 ميجاوات (الشكل 4B ، الوسط) ولكنها استحضرت إمكانات الحركة بشكل موثوق عند 160 mW ، وهو مستوى الطاقة الآخر الوحيد الذي تم اختباره ، مع زمن انتقال يبلغ 2.7 ± 0.6 مللي ثانية (الشكل 4B ، أسفل). أثار قطار النبض (160 ميجاوات، التردد: 300 هرتز، دورة العمل: 15٪، المدة: 300 مللي ثانية) السكاديس بشكل متسق بمتوسط زمن انتقال يبلغ 97 ± 32 مللي ثانية، ومتوسط سعة 10.4 درجة ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا وهبوطا؛ ومتوسط سعة؛ ومتوسط زمن انتقال يبلغ 47 درجة؛ ومتوسط زمن انتقال يبلغ 97 و32 مللي ثانية، ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية يبلغ 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة دوران يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا الشكل 4 جيم).

وتمشيا مع الدراسات التي عدلت كسب الساكيد باستخدام التحفيز الكهربائي دون العتبة ل SC ^11,12 ، فإن التحفيز البصري ل SC بعد 15 ° و¹⁸ ° و 20 ° يسارا وهبوطا (225 °) يقلل تدريجيا من اكتساب الساكيد (الشكل 4D). تطلب هذا الانخفاض في الكسب حوالي 250 تجربة (دوائر خضراء) للعودة إلى كسب ما قبل التكيف (الدوائر السوداء) ، مما يؤكد أساسه في اللدونة على المدى الطويل.

في التجربة الثانية (الشكل 4E) ، تم قمع إسقاط الألياف الطحلبية من NRTP إلى الفيرميس الحركي العيني (OMV) للقشرة المخيخية (الفصيصات VIc و VII) بصريا. يوضح الشكل 4F الألياف الطحلبية والورود ذات العلامات الفلورية في OMV (داخلي). تم تسليم ضوء الليزر الأصفر (589 نانومتر) إلى OMV عبر الألياف البصرية ، وتم استخدام قطب التنغستن القريب لتسجيل نشاط خلية Purkinje. يوضح الشكل 4G نشاط الارتفاع البسيط قبل (رمادي) وبعد (برتقالي) التعطيل البصري الجيني لإسقاطات NRTP (الشكل 4G ، الأعلى). قبل التعطيل ، أظهرت خلية Purkinje نمط انفجار مزدوج ل 12 درجة من السكادات اليمنى (الشكل 4G ، الوسط ، الرمادي). أثناء التعطيل ، انخفض معدل إطلاق النار وتغير إلى نمط توقف مفاجئ (الشكل 4G ، الوسط ، البرتقالي). تشير مقارنة هذين النمطين من الاستجابة إلى أن مدخلات الألياف الطحلبية إلى خلايا Purkinje تؤثر على مرحلة تباطؤ الساكيد عن طريق قيادة الانفجار الثاني (الشكل 4G ، الوسط ، الأخضر). تم تقليل تباين السكاديس إلى اليمين أثناء التعطيل البصري الوراثي ، بما يتفق مع فكرة أن بعض التباين من تجربة إلى تجربة في مقاييس الساكيد يرجع إلى التباين في الإشارات التي تحملها الألياف الطحلبية (الشكل 4G ، القاع ، البرتقالي).

في التجربة الثالثة (الشكل 4H) ، تم تحفيز خلايا Purkinje من OMV بصريا (الشكل 4I). زاد قطار من نبضات الضوء القصيرة (نبضات 1.5 مللي ثانية ، 65 ميجاوات ، 50 هرتز) من نشاط الارتفاع البسيط لخلية Purkinje معزولة (الشكل 4J ، الأعلى). غالبا ما تثير نبضات الضوء الفردية التي تبلغ 1.5 مللي ثانية >1 ارتفاع بسيط (الشكل 4J ، الأسفل). تنشيط السنبلة البسيطة البصرية الجينية ، الذي تم توقيته ليحدث أثناء الساكيد (نبضة ضوئية 10 مللي ثانية ، 60 ميجاوات) ، وزيادة سعة الساكيد (الشكل 4K) ، مما يؤكد الدور المثبط لخلايا Purkinje على مولد الانفجار الحركي العيني.

الشكل 4: ملخص ثلاث تجارب بصرية جينية أجريت على القرود المستيقظة. (A-D) أجريت التجربة 1 ، الإثارة العصبية الشاملة: الحقن الفيروسي ، والتحفيز بالليزر ، وتسجيل الوحدة في كوليكولوس العليا (A). (ب) نشاط الوحدة التمثيلية الناجم عن التحفيز بالليزر. (C) ، المكونات الأفقية (العليا) والرأسية (الوسطى) لحركات العين والمخطط النقطي لنشاط الوحدة (أسفل) التي يثيرها التحفيز بالليزر. (د) جلسة تمثيلية للتكيف مع الساكيد الناجم عن التحفيز بالليزر. تم تسليم التحفيز (100 نبضة ليزر 0.5 مللي ثانية) 80 مللي ثانية بعد كل ساكيد (مضمن). انخفض كسب Saccade (سعة الساكيد / سعة الهدف) تدريجيا عبر التجارب. (ه-ز) التجربة 2 ، تثبيط المسار المحدد: تم حقن ناقل فيروسي في النواة الشبكية tegmenti pontis ، وتم إجراء التحفيز بالليزر وتسجيل الوحدة في فيرميس حركي العين (E). (و) القسم النسيجي من الفيرميس الحركي العيني الذي يظهر ألياف الطحالب المصنفة (شريط الميزان: 1 مم) وورداتها (مضمن، شريط مقياس: 100 ميكرومتر). (ز) نشاط خلية بوركينجي (أعلى: نقطي، وسط: متوسط معدل إطلاق النار) ومسارات السكاديس الموجهة بصريا (أسفل) مع وبدون تحفيز الليزر. الرمادي: تجارب إيقاف تشغيل الليزر، البرتقالي: الليزر في التجارب، الأخضر: الفرق بين الرمادي والبرتقالي. (H-K) التجربة 3 ، التنشيط الخاص بنوع الخلية: تم إجراء الحقن الفيروسي ، والتحفيز بالليزر ، وتسجيل الوحدة في فيرميس حركي العين (H). (I) القسم النسيجي من الفيرميس الحركي العيني الذي يظهر خلايا Purkinje المسماة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (J) نشاط ارتفاع بسيط لخلية Purkinje يثيره التحفيز بالليزر. الجزء العلوي: مخطط نقطي من 14 تجربة. أسفل: تتبع الجهد من تجربة تمثيلية واحدة. (ك) مسارات السكاديس الموجهة بصريا مع وبدون التحفيز بالليزر. زادت نبضة الضوء التي تبلغ 10 مللي ثانية أثناء السكاديس من سعات الساكيد. مسارات الساكيد الفردية (سماوية) ومتوسطها (أزرق) في تجارب الليزر. مسارات الساكيد الفردية (الرمادي الفاتح) ومتوسطها (الرمادي الداكن) في تجارب إيقاف الليزر. كان الطول الموجي للضوء 450 نانومتر في التجربتين 1 و 3 وكان 589 نانومتر في التجربة 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد أدى التقدم في علم البصريات الوراثي NHP إلى خلق حاجة إلى طرق حقن دقيقة وموثوقة داخل الجمجمة. مزايا الطريقة الموصوفة في هذا التقرير هي أنها غير مكلفة ، وتستخدم مكونات معقمة ويمكن التخلص منها ، ولديها القدرة على استهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. كما يسمح بالتحكم في سرعة الحقن وحجمه بحكم السرعة التي يمكن بها التحكم في صمام الهواء. يمكن زيادة ضغط الهواء بشكل عابر لإزاحة انسداد ثم تقليله بسرعة لتجنب الإفراط في الحقن اللاحق الذي قد ينتج عن الضغط المستمر. تقلل المكونات التي تستخدم لمرة واحدة من خطر التلوث المتبادل بين مواقع الحقن.

تشمل الخطوات الحاسمة في بروتوكول الحقن هذا بناء قنيات عالية الجودة ، وتحميلها دون إدخال فقاعات ، واختيار مواقع الحقن التي ليست قريبة جدا من بعضها البعض. عادة ما تؤدي الحقن التي ≥1 سم إلى نقل مناطق غير متداخلة ، ولكن هذا الاستدلال يعتمد على النمط المصلي الفيروسي ، والعيار ، والمروج ، والحجم ، والهدف ، وطريقة الكشف. إن اختيار مواقع الحقن غير المتصلة مباشرة يتجنب الارتباكات المحتملة الناتجة عن الاتجار بالأوبسين على طول المحاور العصبية وميل بعض الأنماط المصلية AAV للنقل الرجعي.

يمكن استخدام هذه الطريقة لحقن NHPs أثناء التخدير وفي إطار مجسمة (الشكل 3) أو تنبيه وتثبيت الرأس (الشكل 4). الأول لديه ميزة السماح باستهداف الحقن في إحداثيات مجسمة ، ويسمح بتأكيد بصري لاختراق القنية من خلال استئصال القرنية الحاد (شق الجافية في مستيقظ ، من خلال بضع القحف المزمن ، يزيد من خطر العدوى). يتميز النهج الأخير بمزايا تقليل عدد جراحات البقاء على قيد الحياة وبالتالي الضغط على الحيوان ، كونه متوافقا مع التسجيلات الكهروفسيولوجية أثناء السلوك ، واستخدام نفس الإطار الإحداثي والأجهزة المستخدمة لإدخال الألياف البصرية لتجارب ما بعد الحقن. يمكن تحسين تقنية الحقن في القرود المستيقظة عن طريق إجراء الحقن من خلال الجافية الاصطناعية¹³،^14،15. وهذا من شأنه أن يمنح مزايا إضافية للتصور المباشر لمواقع الحقن وتألق الأنسجة الذي يشير إلى النقل الناجح.

تم استخدام العديد من تقنيات حقن AAV الأخرى في NHPs. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز حقن متعدد القنوات لتوصيل ناقلات AAV بشكل موحد إلى المناطق القشرية NHP الكبيرة¹⁶. يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام التسليم المعزز بالحمل الحراري^17,18. تهدف هذه الطرق إلى زيادة انتشار النقل إلى أقصى حد ، وهو هدف مهم ولكنه يختلف عن الدقة المكانية التي تهدف طريقتنا إلى تحقيقها.

طريقة بديلة أخرى هي حقن ناقلات AAV من خلال أنابيب البورسليكات التي يتم شطبها إلى طرف حاد على أحد طرفيها وربطها بحقنة هاميلتون على^{الطرف الآخر 5,6}. هذه الطريقة لديها الكثير من القواسم المشتركة مع الطريقة الموضحة في هذه الورقة. يتم الاحتفاظ بالناقل الفيروسي في طول الأنابيب ، ويتم ملء المساحة الموجودة في الأنابيب خلف الفيروس بالزيت المصبوغ ، ويتم رصد تدفق الناقل عن طريق حركة الغضروف المفصلي الناقل للنفط. تتطلب هذه التقنية البديلة معدات وتحضيرا أقل ، ولكنها تتطلب سحب الزيت إلى أنابيب البورسليكات من خلال الطرف المشطوف عن طريق الضغط السلبي وتحميل الناقل عبر نفس الطريق لاحقا. هذا يؤدي حتما إلى آثار النفط التي يتم تسليمها إلى الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، في تجربتنا ، يجب أن يكون قطر أنابيب البورسليكات ~ 350 ميكرومتر لاختراق الجافية حتى عندما تكون مشطوفة ، وبالتالي تسبب أضرارا ميكانيكية أكبر من القنية المعدنية الأرق الموصوفة في هذه الورقة (الشكل 2D). تم استخدام أنابيب 30 جم لأن حمل الإبزيم الحرج مرتفع بما يكفي للتوسط في اختراق الجافية على الرغم من طوله 1-10 سم ، لأنه يناسب أنبوب PTFE بإحكام ، ولأنه نادرا ما يصبح مسدودا. أنابيب 33 G تسد وتنحني بسهولة أكبر وأكثر صعوبة للتزاوج مع أنابيب PTFE. أنابيب 36 G ليست قاسية بما فيه الكفاية لاختراق NHP الأم الجافية.

تقنية حقن بديلة أخرى هي تزاوج خرج مضخة الهواء إلى الجزء الخلفي من ماصة زجاجية محملة بالمتجه ومسحوبة¹⁹. يتم إجبار المتجه من طرف الماصة عن طريق ضغط الهواء المباشر والمتقطع من المضخة ، مما يلغي الحاجة إلى الزيت. على غرار طريقة الأنبوب الواحد الموضحة أعلاه ، فإن عدم وجود أي تقاطعات مادية بين الغضروف المفصلي وطرف القنية يقلل من خطر التسرب. ومع ذلك ، فإن المستدق الحاد والنصائح الدقيقة للماصات الزجاجية تمنعها من اختراق NHP dura أو استهداف الهياكل العميقة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment: Stereotaxic set
Item
Allen keys	BONDHUS	10936	STERRAD
Cannula holder	KOPF	1770	STERRAD
Carrier (manipulator)	KOPF	1404	STERRAD
Carrier platform	KOPF	1430	NA
Carrier stand	KOPF	1449	STERRAD
Eye, ear, mouth bars	KOPF	1430	NA
Stereotaxic base	KOPF	1210	NA
Equipment: Cannula
Item
1 mL Luer-lock syringes	BD	309628	NA (sterilized package)
Cannulas*	(homemade - see below)	NA	steam (autoclave)
Colored oil**	(homemade - see below)	NA	NA
Elevator (for tube rack)	Cole-Parmer	UX-08057-10	STERRAD
Filter tip	Genesee Scientific	23-404	NA (sterilized package)
Fluorescent microbeads	Lumafluor	R170	NA
P20 pipetman	Gilson	FA10003M	NA
PCR tubes	Olympus Plastics	22-161	STERRAD
Stopcock	Cole-Parmer	3060004	STERRAD
Tube rack	homemade	NA	STERRAD
Vector solution	(homemade)	NA	NA
Equipment: Electric air pump set
Item
Electric air pump	World Precision Instruments	PV830	NA
Foot pedal	World Precision Instruments	3260	NA
Tube cover	EZ Drape	A400-1000	NA (sterilized package)
Equipment: General surgery tools
Item
Beaker	MEDLINE	azlon	STERRAD
Burrs	STRYKER	277-10-235	STERRAD
Double pronged tissue pick	Fine Science Tools	18067-11	STERRAD
Drapes	MEDLINE	DYNJP3004	NA (sterilized package)
Dressing forceps	Miltex	6-118	STERRAD
Drill	STRYKER	Q9R-5400	NA
Drill bits	STRYKER	277-82-87	STERRAD
Gauze	MEDLINE	NON26334	NA (sterilized package)
Hemostatic mosquito forceps	Miltex	7-2, 7-4	STERRAD
Light handles	SKYTRON	Stellar XL	STERRAD
Needle hodler	Miltex	8-2	STERRAD
Periosteal elevator	Miltex	18-1968	STERRAD
Rongeurs	Miltex	17-4800	STERRAD
Saline	BAXTER	2F7122	STERRAD
Scalpel	Bard-Parker	372610	STERRAD
Scissors	Miltex	5-12, 5-114	STERRAD
Senn retractors	Miltex	28065	STERRAD
Sterile gloves	MEDLINE	Triumph Micro	NA (sterilized package)
Suction	medela	200-4869	NA
Suction tip	MEDLINE	DYNDFR12S	NA (sterilized package)
Suction tube	COVIDEN	8888301614	NA (sterilized package)
Surgical gowns	MEDLINE	DYNJP2002S	NA (sterilized package)
Surgical pens & ruler	MEDLINE	DYNJSM03	NA (sterilized package)
Suture	COVIDEN	SL-635	NA (sterilized package)
Tissue forceps	Miltex	6-114	STERRAD
Towel clamps	Miltex	7-504	STERRAD
Wood swabs	MEDLINE	MDS202095	NA (sterilized package)
Equipment: *cannulas
Item
Hypodermic needle	EXELINT INTERNATIONAL	26437	NA (sterilized package)
Stainless steel tube	K-TUBE	K30R	NA
PTFE tube	ZEUS	216200	NA
Equipment: **colored oil
Item
Liquid Candle Dye Concentrate	PremiumCraft	Red/Pink	NA
Mineral oil	Vi-Jon	S0883	NA
	STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma