Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano

Resumo

Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.

Resumo

Técnicas optogenéticas revolucionaram a pesquisa em neurociência e estão prontas para fazer o mesmo para terapia genética neurológica. O uso clínico da optogenética, no entanto, exige que a segurança e a eficácia sejam demonstradas em modelos animais, idealmente em primatas não humanos (NHPs), devido à sua semelhança neurológica com os seres humanos. O número de vetores candidatos que são potencialmente úteis para neurociência e medicina é vasto, e nenhum meio de alta produtividade para testar esses vetores ainda existe. Assim, há a necessidade de técnicas para fazer múltiplas injeções espacial e volutricicamente precisas de vetores virais no cérebro de NHP que podem ser identificados inequivocamente através da histologia pós-morte. Descrito aqui é tal método. As cânulas de injeção são construídas acoplados a partir de tubos de politefluoroetileno acoplado e de aço inoxidável. Essas cânulas são autoclaváveis, descartáveis e têm baixos volumes de carregamento mínimo, tornando-as ideais para a injeção de soluções de vetores virais caros e altamente concentrados. Um óleo mineral inerte e tingido vermelho preenche o espaço morto e forma um menisco visível com a solução vetorial, permitindo uma medição instantânea e precisa das taxas de injeção e volumes. O óleo é carregado na parte traseira da cânula, reduzindo o risco de co-injeção com o vetor. As cânulas podem ser carregadas em 10 minutos, e as injeções podem ser feitas em 20 minutos. Este procedimento é bem adequado para injeções em animais acordados ou anestesiados. Quando usado para fornecer vetores virais de alta qualidade, este procedimento pode produzir uma expressão robusta de proteínas optogenéticas, permitindo o controle óptico da atividade neural e do comportamento em NHPs.

Introdução

A optogenética em primatas não humanos (NHPs) normalmente envolve a injeção de vetor viral diretamente no cérebro. Uma classe de vetores que é bem adequado para esta aplicação é baseada no vírus associado ao Adeno (AAV). Esses vetores consistem em um capsídeo proteico em torno de um genoma de DNA de uma única cadeia que, por sua vez, consiste em um promotor, um gene opsin, e opcionalmente, outros elementos de codificação de proteínas e normas genéticas. Os avanços na clonagem molecular facilitaram a manipulação e combinação desses componentes para o desenvolvimento de novos vetores. Consequentemente, a coleção de vetores AAV que é potencialmente útil para a optogenética NHP é grande e cresce rapidamente.

Atualmente, a utilidade de um vetor AAV para optogenética NHP requer testes in vivo. Este fato é uma barreira substancial para o progresso. Os animais devem ser usados com moderação, e testar vários vetores em um único animal requer que os locais de injeção sejam posicionados criteriosamente em relação à arquitetura neural e bem separados em relação à propagação viral. A avaliação histológica precisa requer que as injeções sejam espacialmente e volutricicamente precisas. Uma técnica de injeção anteriormente utilizada para a entrega focal de agentes farmacológicos 1,2,3,4 foi adaptada e simplificada para fazer tais injeções. Esta técnica de injeção é barata, usa componentes descartáveis e esterilizáveis, pode ser usada em macacos anestoetizados ou acordados, e pode ser usada para atingir diversas áreas cerebrais de qualquer profundidade. O protocolo a seguir descreve procedimentos passo a passo para fabricar os componentes descartáveis e fazer injeções no cérebro NHP. As vantagens e desvantagens da técnica são discutidas.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e ultrapassaram os requisitos mínimos recomendados pelo Instituto de Recursos Animais Laboratoriais e pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International. Todos os procedimentos foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington (protocolo UW IACUC nº 4167-01). Cinco macaques saudáveis (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; masculino. Instrumentos estéreis e técnica foram utilizados em todos os procedimentos cirúrgicos.

1. Fazer uma cânula (Figura 1A)

1. Preparação de cada peça
   1. Corte a ponta de uma agulha hipodérmica (30 G, 13 mm de comprimento) com um moedor de disco.
   2. Corte um tubo de aço inoxidável (30 G, diâmetro interno = 0,16 mm, diâmetro externo = 0,31 mm) a um comprimento adaptado à profundidade da área cerebral alvo (25 mm é bem adequado para injetar a superfície dorsal do córtex cerebral). Com um moedor de disco, desenhe uma extremidade do tubo de corte e suavize a outra. Desburr o interior do tubo com um broche.
   3. Corte o tubo de politetrafluoroetileno (PFTE) (diâmetro interno = 0,23 mm ± 0,02 mm, parede = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm corresponde a 42 nL ± 7 nL de fluido) a um comprimento apropriado para a quantidade de solução vetorial a ser carregada (1 μL de solução vetorial ocupa 24 mm de tubulação). Flare ambas as extremidades do tubo PTFE por inserção da agulha hipodérmica sem cortes.
2. Insira a agulha hipodérmica em linha de 5 mm em uma extremidade do tubo PTFE. Insira a extremidade nãovelada do tubo de aço inoxidável aproximadamente 5 mm na outra extremidade (Figura 1A).
3. Realize testes de pré-injeção. Injete água filtrada através do cubo de agulha hipodérmica da cânula. Confirme se a água sai do tubo de aço inoxidável chanfrado da ponta e que a água não vaze de nenhuma das junções.

2. Procedimento de injeção para animais anestesiados

1. Preparação cirúrgica
   1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos e suprimentos utilizando os procedimentos na Tabela de Materiais.
   2. Se necessário, faça uma ressonância magnética para atingir estruturas cerebrais profundas (Figura 2A).
   3. Imediatamente antes da cirurgia, sedeia os animais com cetamina (10-15 mg/kg) e administre antibióticos (cefazolina) e analgésicos (buprenorfina e meloxicam) de forma intramuscular. Em seguida, entregue propofol via cateter intravenoso (IV) nas veias safenas ou cefálicas.
   4. Entubar o animal e transitá-lo para gás isoflurane. Confirme a anestesia adequada por frequência cardíaca estável, pressão arterial, frequência respiratória, músculos esqueléticos relaxados e ausência de reflexos palpebrais ou de abstinência.
   5. Raspe a cabeça do animal. Aplique pomada lacrimal artificial nas córneas para evitar a secagem.
2. Preparação da área de injeção
   1. Coloque a cabeça do animal no quadro estereotaxico. Aplique solução de esfoliação cirúrgica na pele raspada com esponjas de gaze, aplique pressão suave para liberar quaisquer detritos e enxágue com álcool isopropílico. Repita este processo três vezes. Cubra o animal com uma cortina fenestrada estéril. Incisar a pele e refletir o músculo. Coloque o manipulador no braço estereotaxico, posicione-o para apontar para a área cerebral alvo, e marque a posição de craniotomia no crânio com uma caneta esterilizada.
   2. Remova o manipulador estereotítico e faça a craniotomia. Incisar a dura se desejar (por exemplo, para visualizar marcos sulcal). Devolva o manipulador ao braço estereotax.
3. Carregamento de solução vetorial (Figura 1C)
   1. Transfira suavemente a solução vetorial para um tubo PCR esterilizado com um pipettor P20, evitando bolhas.
   2. Conecte uma cânula, com a ponta chanfrada voltada para baixo, a um suporte estereotítico orientado verticalmente. Conecte uma seringa luer de 1 mL ao cubo de agulha hipodérmica da cânula.
   3. Submergir a ponta chanfrada da cânula na solução vetorial.
      NOTA: A seringa já deve ser anexada; anexá-lo neste ponto introduziria bolhas na solução vetorial.
   4. Coloque a solução na cânula aplicando pressão negativa suave com a seringa de 1 ml. Rastreie visualmente o menisco entre a solução e o ar.
   5. Uma vez que a solução vetorial tenha sido carregada, continue a pressão negativa suave até que a solução chegue ao cubo da agulha. Remova a seringa de 1 mL e injete o óleo mineral colorido no cubo de agulha hipodérmica.
      NOTA: O óleo deve ser injetado lentamente ao longo da parede interna do cubo de agulha para formar um menisco de corte claro com a solução vetorial e para evitar bolhas de ar.
   6. Conecte o cubo de agulha hipodérmica a uma das duas portas abertas de uma torneira de bloqueio luer de 3 vias.
      NOTA: Anexar a agulha hipodérmica à porta fechada introduzirá pressão de ar indesejada atrás do óleo.
   7. Feche a porta conectada ao cubo de agulha hipodérmica, encha uma seringa de 1 mL com ar e conecte-a a qualquer uma das outras duas portas. Finalmente, feche a porta restante da torneira para conectar a seringa à cânula.
   8. Empurre lentamente o ar para dentro da cânula. Uma vez que o óleo colorido apareça na ponta da agulha cega na tubulação PTFE, verifique se há ar entre a solução e o óleo colorido.
   9. Se o ar estiver presente, aplique pressão negativa na seringa para devolver o óleo colorido ao cubo da agulha. Remova a bolha e aplique pressão positiva até que uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula chanfrada chanfrada.
   10. Remova a seringa de 1 mL para liberar pressão de ar indesejada atrás do óleo e feche a torneira para evitar que o vetor saia da cânula pela gravidade.
   11. Tape uma régua de plástico na tubulação PTFE para medir o movimento do menisco durante a injeção (Figura 1B,D,F).
4. Inserção de cânula na área cerebral alvo (Figura 1B)
   1. Afixe a cânula ao manipulador estereotipado.
   2. Transfira manualmente a tubulação da bomba (que termina em um conector De trava-Luer) do assistente não estéril para o cirurgião. O cirurgião deve agarrar o conector Luer-lock através da parede de uma manga estéril, fixar uma segunda torneira estéril ao conector, prender a manga firmemente ao seu redor e, em seguida, soltar a gola da manga, permitindo que ele se estenda ao longo do tubo pela gravidade.
   3. Conecte a torneira presa à tubulação de cânula à torneira presa à bomba de ar. Coloque a bomba de ar em baixa pressão, ligue-a e aumente a pressão até que o óleo avance pela cânula e uma gota de solução vetorial seja visível na ponta da cânula.
   4. Ajuste a posição da régua plástica na tubulação PTFE para medir o movimento do menisco durante a injeção.
   5. Dirija a cânula para baixo com o manipulador estereotax e grave a profundidade em que a ponta atinge a superfície (dura ou pia mater).
   6. Dirija a cânula até o local mais profundo a ser injetado ao longo da pista. A superfície vai coçar. Se injetar córtex superficial, confirme visualmente que a cânula penetrou na superfície, com um microscópio cirúrgico ou lupas, se disponível.
   7. Para minimizar a compressão do tecido, dirija a cânula lentamente (1 mm/min), rapidamente (0,5 mm/s) com uma espera de 1-5 minutos na parte inferior, ou sobrevoe o local de injeção mais profundo em 500 μm e depois retraia.
5. Injecção
   1. Injete 0,5 μL da solução vetorial com a bomba de ar elétrica acima de 10-30 s. Confirme o fluxo de injeção rastreando o menisco entre o óleo colorido e a solução vetorial no tubo PTFE.
   2. Aguarde 1 min e retraia a cânula para o próximo local de injeção ao longo da pista.
   3. Após a injeção final, deixe a cânula no lugar por 10 minutos para evitar efflux vetorial.
   4. Retraia a cânula e descarte-a em um recipiente de agudos de risco biológico.
   5. Opcionalmente, injete uma pequena quantidade (≤1 μL) de microesferas fluorescentes perto do local de injeção vetorial para facilitar a identificação do local de injeção após a morte.
   6. Repita este procedimento conforme desejado para as outras soluções vetoriais em outros locais (Figura 2B).
6. Fechamento da cirurgia
   1. Suturar a dura, o músculo e a pele.
   2. Remova o macaco do quadro estereotaxic e remova todos os cabos do monitor.
   3. Remova o macaco da anestesia isoflurane e extuba após o retorno do reflexo de deglutição.
   4. Fornecer tratamento pós-cirúrgico (3-5 dias de meloxicam e 7-10 dias de cefaloxiina). Monitore o animal pelo menos uma vez a cada 10 minutos até que ele seja capaz de manter uma posição estável e vertical.

3. Cirurgia e injeção vetorial AAV para animais de comportamento acordado (Figura 1D)

NOTA: Uma variante da técnica pode ser usada para fazer injeções no cérebro de macacos acordados e comportando-se, conforme descrito abaixo.

1. Injeção simultânea com gravação
   1. Para registrar a atividade elétrica no local da injeção, cubra a parte externa da cânula com epóxi (fundo ~15 mm) e tubos de poliimida (comprimento restante). Revele o metal na ponta raspando o epóxi dele (Injectrode, Figura 1F)². Alternativamente, insira a cânula e um eletrodo extracelular separado, lado a lado, em um tubo de guia de cano duplo (tubo guia de cano duplo, Figura 1E).
2. Inserção da cânula na área cerebral alvo.
   1. Coloque o macaco na cabine experimental, restrinja o movimento da cabeça e limpe a câmara de gravação montada no crânio usando técnicas padrão.
   2. Fixar um tubo-guia no microdrive. Insira a cânula de injeção no tubo-guia.
   3. Avance a cânula até que a ponta se projetem do tubo-guia.
   4. Conecte a torneira à bomba de ar elétrica. Para confirmar a função adequada do sistema, empurre uma gota de solução vetorial da ponta usando a bomba de ar e confirme o movimento do menisco da solução de vetor de óleo.
   5. Retire a cânula ~5 mm no tubo-guia para protegê-la de danos durante a inserção do tubo no cérebro. Insira o tubo-guia no cérebro.
   6. Dirija a cânula até o local para ser injetada usando o microdrive. Identifique o local de destino por gravação elétrica (Figura 2C) ou estimulação.

Figura 1: Configuração da cirurgia e do aparelho. (A) Cânula de injeção. Cada parte da cânula é indicada. Inset no canto inferior direito: imagem ampliada da ponta da cânula, barra de escala: 500 μm. (B) Configuração da cirurgia para macacos anestesiados. O macaco é colocado em uma estrutura estereotaxa sob uma cortina cirúrgica. Ventilador (V), linha intravenosa (IV), monitor de pressão arterial (PA) e monitor de saturação de oxigênio (O₂) estão conectados ao macaco. A cânula de injeção é inserida na área alvo usando um micromanipulador estereotaxico. A solução vetorial é injetada por uma bomba de ar elétrica (entrada inferior-esquerda, marrom) acoplada a um compressor de ar (entrada inferior-esquerda, azul). Uma régua de plástico (entrada superior) é colada à tubulação PTFE para medir o movimento do menisco entre óleo colorido (entrada superior, vermelho) e solução vetorial (entrada superior, clara) durante a injeção. (C) Configuração para carregar a solução vetorial na cânula. (D) Um macaco durante uma injeção de solução vetorial em uma cabine experimental. A cabeça do animal é mantida no lugar por três postes de estabilização, e a posição dos olhos é registrada por um sistema de bobina de busca escleral. A cânula de injeção é mantida e levada até a profundidade do alvo usando um suporte/driver de micro-eletrodos. A injeção é controlada monitorando o menisco entre o óleo colorido e a solução vetorial através de uma câmera USB (imagem de entrada). (E) Injeção de tubo de guia de cano duplo. Um suporte/driver de tubo de guia de cano duplo contém uma cânula de injeção e um micro-eletrodo (ver inset). (F) Injectrode. O metal na ponta da cânula, exposto pela raspagem da camada epóxi, fornece acesso elétrico aos neurônios (inset, barra de escala: 500 μm). (G) Configuração de estimulação a laser. Um suporte/driver de tubo de guia de cano duplo contém uma fibra óptica e um micro eletrodo (ver entrada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama de locais de injeção de AAV. (A) Seção sagital da imagem mr cerebral mostrando locais de injeção no córtex motor primário e córtex visual primário de uma nemestrina Macaca. (B) Ver a partir da superfície dorsal na placa Atlas correspondente mostrando colocação de cânula em relação ao sulco central (córtex motor primário) e córtex visual primário. (C) Gravação da unidade por injeção derode no collículo superior. Uma unidade isolada antes da injeção (superior direito) desapareceu após a injeção (parte inferior direita). (D) Faixa de injeção (setas brancas). Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Processamento de tecido cerebral para histologia

1. Espere 6-8 semanas após a injeção para maximizar a expressão transgênica.
   NOTA: A duração ideal depende do vetor viral exato utilizado no experimento.
2. Processe o cérebro usando técnicas histológicas convencionais para avaliar a eficiência de transdução e a seletividade ^5,6,7.

Resultados

Para demonstrar a expressão transgênica pela injeção estereóxica in vivo no cérebro NHP usando o método de injeção cirúrgica descrito aqui, foram selecionados dois vetores que continham enhancers expressão de condução da proteína fluorescente super amarela-2 (SYFP2) em tipos neuronais distintos ^8,9. Os vetores virais foram embalados no capsid PHP.eB¹⁰, purificados por centrífugação iodixanol, e depois concentrados em alto título (>1E13 genomas virais/mL) medidos pelo qPCR. Um volume de 0,5 μL foi injetado em cada uma das dez profundidades ao longo de dez faixas através do córtex para um volume total de injeção de 5 μL/pista. A Figura 3A-C mostra a expressão SYFP2 através de imunostaining anti-GFP 113 dias após a injeção do vetor AAV subclasse PVALB, CN2045, no córtex visual primário de um nemestrina macaca masculino adulto. O transgene SYFP2 é fortemente detectado em numerosos neurônios não-piramidais espalhados pela profundidade cortical, e a maioria dos neurônios expressos de SYFP2 também eram imunoretivos para PVALB⁷. A Figura 3D mostra a expressão SYFP2 nativa no córtex motor primário 64 dias após a injeção do vetor AAV específico do neurônio L5, CN2251. Todos os neurônios rotulados por SYFP2 têm morfologia piramifecional clara com somata restrita à camada 5 e dendritos apical espessos característicos. Esses dados demonstram inequivocamente o controle preciso da expressão transgênica em populações selecionadas de neurônios neocorticais no cérebro de NHP por injeção estereotaxica de vetores AAV do tipo celular.

Figura 3: Exemplo da expressão SYFP2 específica do tipo celular mediada por vetores AAV injetados no cérebro NHP. (A) Fotomicrograph de epifluorescência de uma seção fixa do córtex visual primário de macaque 113 dias após a injeção de um vetor AAV específico da subclasse PVALB. Barra de escala: 1 mm.  (B,C) Imagem de ampliação mais alta da região encaixotado mostrando em A. (B) Sinal anti-GFP. (C) Sinal anti-PVALB. Barras de escala: 250 μm. (D) Fotomicrograph de fluorescência SYFP2 nativa em uma seção fixa do córtex motor primário macaque 64 dias após a injeção de um vetor AAV extratelenceico de camada 5. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar a utilidade dessa técnica de injeção para manipulações neurofisiológicas e comportamentais, foram realizados três experimentos, cada um em um macaco diferente (Macaca mulatta). No primeiro experimento (Figura 4A-D), vetores AAV carregando o transgene channelrhodopsin-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) foram injetados no colliculus superior esquerdo (SC). O vetor foi injetado a cada 250 μm a 19 profundidades para um total de 12 μL. No segundo experimento (Figura 4E-G), 3 μL de solução AAV1-hSyn-ArchT-EYFP foi injetado no núcleo reticularis tegmenti pontis (NRTP). No terceiro experimento (Figura 4H-K), 24 μL de solução AAV9-L7-ChR2-mCherry foi injetado no córtex cerebelar⁶. Seis a oito semanas após cada injeção, uma fibra óptica e um eletrodo de tungstênio foram inseridos no cérebro através de um tubo-guia de cano duplo (Figura 1G).

A Figura 4B mostra a resposta de um neurônio SC à luz azul (450 nm). A luz contínua (1,2 s) a 40 mW produziu uma série de potenciais de ação consecutivos (Figura 4B, topo). Pulsos de luz de duração de 1 ms não conseguiram evocar potenciais de ação a 40 mW (Figura 4B, meio), mas evocaram potenciais de ação de forma confiável a 160 mW, o único outro nível de potência testado, com uma latência de 2,7 ± 0,6 ms (Figura 4B, inferior). Um trem de pulso (160 mW, frequência: 300 Hz, ciclo de serviço: 15%, duração: 300-ms) evocou saccades consistentemente com uma latência média de 97 ± 32 ms, uma amplitude média de 10,4° e ângulo médio de 47° (para cima e para a direita; Figura 4C).

Consistente com estudos que modificaram o ganho de saccade utilizando estimulação elétrica subthreshold da SC^11,12, estimulação óptica da SC após 15°, 18°, e 20° de esquerda e para baixo (225°) saccades gradualmente reduziu o ganho de saccade (Figura 4D). Essa diminuição no ganho exigiu ~250 ensaios (círculos verdes) para retornar ao ganho de pré-adaptação (círculos negros), confirmando sua base na plasticidade de longo prazo.

No segundo experimento (Figura 4E), a projeção de fibra de musgo do NRTP para os vermis oculomotores (OMV) do córtex cerebelar (lobules VIc e VII) foi suprimida opticamente. A Figura 4F mostra fibras de musgo fluorescentes rotuladas e rosetas no OMV (inset). A luz laser amarela (589 nm) foi entregue ao OMV via fibra óptica, e um eletrodo de tungstênio próximo foi usado para registrar a atividade celular purkinje. A Figura 4G mostra uma atividade de espeto simples antes (cinza) e depois (laranja) inativação optogenética das projeções NRTP (Figura 4G, topo). Antes da inativação, a célula Purkinje exibiu um padrão de explosão dupla para 12° saccades para a direita (Figura 4G, meio, cinza). Durante a inativação, a taxa de disparo diminuiu e mudou para um padrão de pausa de estouro (Figura 4G, meio, laranja). Comparar esses dois padrões de resposta sugere que a entrada de fibra de musgo às células Purkinje influencia a fase de desaceleração saccade, conduzindo a segunda explosão (Figura 4G, média, verde). A variabilidade das saccades para a direita foi reduzida durante a inativação optogenética, consistente com a ideia de que parte da variabilidade de ensaio para julgamento em métricas de saccade deve-se à variabilidade nos sinais transportados por fibras de musgo (Figura 4G, fundo, laranja).

No terceiro experimento (Figura 4H), as células Purkinje do OMV foram estimuladas optogeneticamente (Figura 4I). Um trem de pulsos de luz curta (pulsos de 1,5 ms, 65 mW, 50 Hz) aumentou a atividade de pico simples de uma célula Purkinje isolada (Figura 4J, topo). Pulsos de luz individuais de 1,5 ms frequentemente evocados >1 simples (Figura 4J, inferior). Ativação de pico simples optogenético, cronometrada para ocorrer durante uma saccade (pulso de luz de 10 ms, 60 mW), amplitude de saccade aumentada (Figura 4K), confirmando o papel desinibitório das células Purkinje no gerador de explosão oculomotor.

Figura 4: Resumo de três experimentos optogenéticos realizados em macacos acordados. (A-D) Experimento 1, excitação pan-neuronal: injeção viral, estimulação a laser e gravação unitária foram realizados no colículo superior (A). (B) Atividade da unidade representativa evocada por estimulação a laser. (C), componentes horizontais (superiores) e verticais (médios) dos movimentos oculares e do enredo raster da atividade unitária (inferior) evocado pela estimulação a laser. (D) Uma sessão representativa de adaptação de saccade induzida por estimulação a laser. A estimulação (pulsos laser de 100 0,5 ms) foi fornecida 80-ms após cada saccade (inset). O ganho de saccade (amplitude saccade / amplitude de alvo) diminuiu gradualmente em todos os ensaios. (E-G) Experimento 2, inibição específica da via: um vetor viral foi injetado no núcleo reticularis tegmenti pontis, e estimulação a laser e registro unitário foram realizados nos vermis oculomotor (E). (F) Seção histológica dos vermis oculomotores mostrando fibras de musgo rotuladas (barra de escala: 1 mm) e suas rosetas (inset, barra de escala: 100 μm). (G) Atividade celular purkinje (superior: raster, médio: taxa média de disparo) e trajetórias de saccades visualmente guiadas (inferior) com e sem estimulação a laser. Cinza: laser fora dos ensaios, laranja: laser em ensaios, verde: diferença entre cinza e laranja. (H-K) O experimento 3, ativação específica do tipo celular: injeção viral, estimulação a laser e registro unitário foram realizados nos vermis oculomotor (H). (I) Seção histológica dos vermis oculomotores mostrando células purkinje rotuladas. Barra de escala: 100 μm. (J) Atividade simples de pico de uma célula Purkinje evocada por estimulação a laser. Top: trama raster de 14 ensaios. Inferior: traço de tensão de um único teste representativo. (K) Trajetórias de saccades visualmente guiadas com e sem estimulação a laser. Um pulso de luz de 10 ms durante as saccades aumentou as amplitudes de saccade. Trajetórias individuais de saccade (ciano) e sua média (azul) em ensaios a laser. Trajetórias individuais de saccade (cinza claro) e sua média (cinza escuro) em ensaios a laser. O comprimento de onda de luz foi de 450 nm nos experimentos 1 e 3 e foi de 589 nm no Experimento 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os avanços da optogenética NHP criaram a necessidade de métodos precisos e confiáveis de injeção intracraniana. As vantagens do método descrito neste relatório são que ele é barato, usa componentes esterilizados e descartáveis, e tem a capacidade de atingir diversas áreas cerebrais de qualquer profundidade. Também permite o controle da velocidade e volume de injeção em virtude da velocidade com que a válvula de ar pode ser controlada. A pressão do ar pode ser aumentada transitoriamente para desalojar um entupimento e, em seguida, reduzida rapidamente para evitar a subsequente sobre-injeção que seria produzida por pressão sustentada. Componentes descartáveis reduzem o risco de contaminação cruzada entre locais de injeção.

Passos críticos neste protocolo de injeção incluem a construção de cânulas de alta qualidade, o carregamento delas sem introduzir bolhas e selecionar locais de injeção que não estejam muito próximos. As injeções ≥1 cm de distância geralmente transduzem regiões não sobrepostas, mas essa heurística depende de sorotipo viral, titer, promotor, volume, alvo e método de detecção. A seleção de locais de injeção que não estão diretamente conectados evita potenciais confusões produzidas pelo tráfico de opsina ao longo dos axônios e a propensão de alguns sorotipos AAV para transdução retrógrada.

O método pode ser usado para injetar NHPs enquanto anestesiado e em um quadro estereotaxista (Figura 3) ou alerta e cabeça fixa (Figura 4). O primeiro tem a vantagem de permitir que as injeções sejam direcionadas em coordenadas estereotribuíficas, e permite a confirmação visual da penetração de cânula através de uma duratomia aguda (incisar a dura em um macaco acordado, através de uma craniotomia crônica, eleva o risco de infecção). Esta última abordagem tem as vantagens de reduzir o número de cirurgias de sobrevivência e, portanto, o estresse para o animal, ser compatível com registros eletrofisiológicos durante o comportamento, e utilizar o mesmo quadro de coordenadas e instrumentação usado para inserir fibras ópticas para experimentos pós-injeção. A técnica de injeção em macacos acordados poderia ser melhorada fazendo injeções através de dura artificial 13,14,15. Isso conferiria as vantagens adicionais da visualização direta dos locais de injeção e da fluorescência tecidual que indica uma transdução bem sucedida.

Várias outras técnicas de injeção de AAV têm sido usadas em NHPs. Recentemente, um dispositivo de injeção multicanal foi desenvolvido para fornecer vetores AAV uniformemente para grandes regiões corticais NHP¹⁶. Resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando-se uma entrega aprimorada de convecção^17,18. Esses métodos visam maximizar a disseminação da transdução, que é um objetivo importante, mas que é distinto da precisão espacial que nosso método pretende alcançar.

Outro método alternativo é injetar vetores AAV através de tubos de borossilicato que são chanfrados a uma ponta afiada em uma extremidade e anexados a uma seringa Hamilton na outra ^5,6. Este método tem muito em comum com o método descrito neste artigo. O vetor viral é mantido em um comprimento de tubulação, o espaço na tubulação atrás do vírus é preenchido com óleo tingido, e o fluxo do vetor é monitorado através do movimento do menisco vetorial de óleo. Esta técnica alternativa requer menos equipamentos e preparação, mas requer o desenho de óleo na tubulação de borossilicato através da ponta chanfrada por pressão negativa e carregar o vetor através da mesma rota posteriormente. Isso inevitavelmente resulta em vestígios de óleo entregues ao cérebro. Além disso, em nossa experiência, a tubulação de borossilicato deve ter um diâmetro de ~350 μm para penetrar dura mesmo quando chanfrada e, portanto, causar maior dano mecânico do que a cânula metálica mais fina descrita neste artigo (Figura 2D). A tubulação de 30 G foi usada porque sua carga crítica de fivela é alta o suficiente para mediar a penetração de dura, apesar de um comprimento de 1-10 cm, porque se encaixa firmemente na tubulação PTFE, e porque raramente fica obstruída. 33 G de tubulação entope e dobra mais facilmente e é mais difícil de acasalar com a tubulação PTFE. A tubulação de 36 G é insuficientemente rígida para penetrar nhp dura mater.

Outra técnica alternativa de injeção é acasalar a saída da bomba de ar para uma parte de trás de uma pipeta de vidro puxado e carregada de vetores¹⁹. O vetor é forçado a sair da ponta da pipeta por pressão de ar direta e intermitente da bomba, eliminando a necessidade de óleo. Semelhante ao método de tubo único explicado acima, a falta de junções materiais entre o menisco e a ponta da cânula reduz o risco de vazamentos. No entanto, o afunilamento afiado e as delicadas pontas de pipetas de vidro impedem que penetrem na dura NHP ou direvam estruturas profundas.

Materiais

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Equipment: Stereotaxic set
Item
Allen keys	BONDHUS	10936	STERRAD
Cannula holder	KOPF	1770	STERRAD
Carrier (manipulator)	KOPF	1404	STERRAD
Carrier platform	KOPF	1430	NA
Carrier stand	KOPF	1449	STERRAD
Eye, ear, mouth bars	KOPF	1430	NA
Stereotaxic base	KOPF	1210	NA
Equipment: Cannula
Item
1 mL Luer-lock syringes	BD	309628	NA (sterilized package)
Cannulas*	(homemade - see below)	NA	steam (autoclave)
Colored oil**	(homemade - see below)	NA	NA
Elevator (for tube rack)	Cole-Parmer	UX-08057-10	STERRAD
Filter tip	Genesee Scientific	23-404	NA (sterilized package)
Fluorescent microbeads	Lumafluor	R170	NA
P20 pipetman	Gilson	FA10003M	NA
PCR tubes	Olympus Plastics	22-161	STERRAD
Stopcock	Cole-Parmer	3060004	STERRAD
Tube rack	homemade	NA	STERRAD
Vector solution	(homemade)	NA	NA
Equipment: Electric air pump set
Item
Electric air pump	World Precision Instruments	PV830	NA
Foot pedal	World Precision Instruments	3260	NA
Tube cover	EZ Drape	A400-1000	NA (sterilized package)
Equipment: General surgery tools
Item
Beaker	MEDLINE	azlon	STERRAD
Burrs	STRYKER	277-10-235	STERRAD
Double pronged tissue pick	Fine Science Tools	18067-11	STERRAD
Drapes	MEDLINE	DYNJP3004	NA (sterilized package)
Dressing forceps	Miltex	6-118	STERRAD
Drill	STRYKER	Q9R-5400	NA
Drill bits	STRYKER	277-82-87	STERRAD
Gauze	MEDLINE	NON26334	NA (sterilized package)
Hemostatic mosquito forceps	Miltex	7-2, 7-4	STERRAD
Light handles	SKYTRON	Stellar XL	STERRAD
Needle hodler	Miltex	8-2	STERRAD
Periosteal elevator	Miltex	18-1968	STERRAD
Rongeurs	Miltex	17-4800	STERRAD
Saline	BAXTER	2F7122	STERRAD
Scalpel	Bard-Parker	372610	STERRAD
Scissors	Miltex	5-12, 5-114	STERRAD
Senn retractors	Miltex	28065	STERRAD
Sterile gloves	MEDLINE	Triumph Micro	NA (sterilized package)
Suction	medela	200-4869	NA
Suction tip	MEDLINE	DYNDFR12S	NA (sterilized package)
Suction tube	COVIDEN	8888301614	NA (sterilized package)
Surgical gowns	MEDLINE	DYNJP2002S	NA (sterilized package)
Surgical pens & ruler	MEDLINE	DYNJSM03	NA (sterilized package)
Suture	COVIDEN	SL-635	NA (sterilized package)
Tissue forceps	Miltex	6-114	STERRAD
Towel clamps	Miltex	7-504	STERRAD
Wood swabs	MEDLINE	MDS202095	NA (sterilized package)
Equipment: *cannulas
Item
Hypodermic needle	EXELINT INTERNATIONAL	26437	NA (sterilized package)
Stainless steel tube	K-TUBE	K30R	NA
PTFE tube	ZEUS	216200	NA
Equipment: **colored oil
Item
Liquid Candle Dye Concentrate	PremiumCraft	Red/Pink	NA
Mineral oil	Vi-Jon	S0883	NA
	STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma