زرع القنية المباشرة في ماجنا سيسترنا من الخنازير

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لزرع القنية المباشرة في ماجنا cisterna من الخنازير.

Abstract

النظام الجليميفي هو نظام لإزالة النفايات في الدماغ يعتمد على تدفق السائل النخاعي (CSF) في المساحات المحيطة بفترة ما حول الأوعية الدموية المرتبطة بالخلايا الفلكية وقد تورط في إزالة الببتيدات العصبية السمية مثل أميلويد بيتا. يؤدي ضعف وظيفة الجلمفاتيك إلى تفاقم أمراض الأمراض في النماذج الحيوانية للأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم نظام التخليص هذا. غالبا ما تتم دراسة النظام الجليمافي بواسطة عبوات cisterna magna (CMc) ، حيث يتم تسليم التتبع مباشرة إلى السائل النخاعي (CSF). ومع ذلك، فقد أجريت معظم الدراسات على القوارض. هنا، ونحن نظهر التكيف من تقنية CMc في الخنازير. باستخدام CMc في الخنازير ، يمكن دراسة النظام الجليمفي بدقة بصرية عالية في الأدمغة الجيرنسيفالية ، وبذلك يسد الفجوة المعرفية بين القوارض والجاذبية البشرية.

Introduction

السائل النخاعي (CSF) هو نسبة فائقة من الدم موجود داخل وحول الجهاز العصبي المركزي (CNS)^1,2. وبصرف النظر عن إعطاء الطفو للدماغ أو امتصاص القوى الميكانيكية الضارة، CSF يلعب أيضا دورا محوريا في إزالة النفايات الأيضية من ^CNS3. يتم تسهيل إزالة النفايات من خلال نظام الجليمافتا الذي تم توصيفه مؤخرا والذي يسمح بالتدفق الحراري ل CSF عبر بارنشيما الدماغ عبر المساحات المحيطة بوعية الدموية (PVS) ، والتي تطوق الشرايين ^{المخترقة3،4،5}. وقد تبين أن هذه العملية تعتمد على aquaporin-4 (AQP4)، وهي قناة مائية يتم التعبير عنها في المقام الأول على النهاية الفلكية، المرتبطة ب ^PVS4,6. وتتحقق دراسة النظام الجليمفاتيكي من خلال التصوير الحي والجسم الحي السابق، باستخدام المجهر الضوئي المتقدم أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، بعد إدخال متتبع فلوري/مشع أو عامل تباين في CSF7,8,9,10,11.

وهناك طريقة فعالة لإدخال التتبع في CSF دون تكبد أضرار في الدماغ parenchyma هو من خلال cisterna ماجنا cannulation (CMc)^12,13. وقد أجريت أغلبية كبيرة من جميع الدراسات الجليمفية، حتى الآن في القوارض وتجنبها في الثدييات العليا بسبب الغازية من CMc إلى جانب البساطة العملية للعمل مع الثدييات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجماجم الرقيقة للفئران بالتصوير الحي دون الحاجة إلى نافذة الجمجمة وتسمح لاحقا باستخراج الدماغ غير ^{المعقد1114}. وقد أسفرت التجارب التي أجريت على البشر عن تنظير كبير قيم في بيانات الجسم الحي على وظيفة الجليمافيتيك، ولكنها اعتمدت على حقن التتبع داخل اللثة في العمود الفقري القطني البعيدة، وعلاوة على ذلك، الاستفادة من التصوير بالرنين المغناطيسي الذي لا يسفر عن دقة كافية لالتقاط استئصال الدقيقة النظام الجليمافي7^،15،16 . فهم الهندسة المعمارية ومدى النظام الجلمفي في الثدييات العليا أمر ضروري لترجمته إلى البشر. من أجل تسهيل الترجمة الجليمفاتيكية للبشر ، من المهم تطبيق التقنيات التي يتم تنفيذها في القوارض على الثدييات العليا من أجل السماح بإجراء مقارنات مباشرة للنظام الجليمفي عبر أنواع من الإدراك المتزايد وتعقيد ^{الدماغ17}. الخنازير والأدمغة البشرية هي جيرونسيفال، وامتلاك neuroarchitecture مطوية، في حين أن أدمغة القوارض هي lissencephalic، وبالتالي وجود فرق كبير بين بعضها البعض. من حيث الحجم الإجمالي ، فإن أدمغة الخنازير هي أيضا أكثر قابلية للمقارنة مع البشر ، كونها أصغر 10-15 مرة من الدماغ البشري ، في حين أن أدمغة الفئران أصغر 3000 ^مرة18. من خلال فهم أفضل للنظام الجليمفاتيكي في الثدييات الكبيرة ، قد يكون من الممكن استخدام نظام الجليمفاتيك البشري للتدخل العلاجي في المستقبل في ظروف مثل السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والتنكس العصبي. CMc المباشر في الخنازير في الجسم الحي هو الأسلوب الذي يسمح للفحص المجهري الخفيف عالي الدقة للنظام الجلمفي في الثدييات العليا. وعلاوة على ذلك، ونظرا لحجم الخنازير المستخدمة، فمن الممكن تطبيق أنظمة رصد مماثلة لتلك المستخدمة في العمليات الجراحية البشرية مما يجعل من الممكن لتوثيق وتنظيم الوظائف الحيوية بإحكام من أجل تقييم كيفية مساهمة هذه في وظيفة الجليمفاتيك.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ووافقت عليها لجنة مالمو لوند الأخلاقية لأبحاث الحيوان (Dnr 5.8.18-05527/2019) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية ل CODEX لمجلس البحوث السويدي.

1. إعداد

1. الراسم
   1. إعداد CSF الاصطناعي (126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM _NaH2PO4، 2 mM _MgCl2، 2 mM _CaCl2، 10 mM الجلوكوز، 26 mM NaHCO3؛ pH 7.4)
   2. إلى 500 ميكرولتر من CSF الاصطناعية، إضافة 10 ملغ من الألبومين من مصل البقر (BSA) المقترنة مع اليكسا فلور 647 (BSA-647).
   3. الطرد المركزي في 5000 x ز لمدة 5 دقائق واستخدام supernatant.
2. قنيه
   1. إرفاق حقنة 1 مل إلى اتصال لوير الإناث من خط الوريد (IV)، 3 طرق الصنبور مع تمديد 10 سم.
   2. إرفاق إبرة 18 G إلى نهاية الذكور.
   3. افتح قفل التوقف الثلاثي للسماح بالاستمرارية من الإبرة إلى الحقنة.
   4. فك تسخين الإبرة بعناية و يستنشق ما يقرب من 300 ميكرولتر من المالحة في خط IV.
   5. إزالة الإبرة من المالحة والمضي قدما لإدخال في بعض الهواء لخلق فقاعة الهواء الصغيرة (5-10 ملم) في خط IV.
   6. ضع الإبرة في التتبع واسبر جميع 500 ميكرولتر من التتبع. يجب فصل المالحة في خط IV بشكل واضح بواسطة فقاعة الهواء.
   7. تجاهل الإبرة وإغلاق قفل وقف 3-الاتجاه.
3. 1. تخدير خنزير عن طريق الحقن العضلي (i.m.) من البلاط (3.75 ملغم /كجم) والزولازيبام (3.75 ملغم/كجم) وديكسيميدوميدين (37.5 ميكروغرام/كجم). انتظر حتى يصبح فاقد الوعي
   2. إعداد خط وريدي عن طريق إدخال قنية 20 غرام في وريد الأذن.
      ملاحظة: تأكد من أن القنية في الوريد عن طريق حقن 5-10 مل من المالحة من خلال القنية. إذا غاب الوريد، وهذا سيكون ملحوظا من قبل وذمة صغيرة في أنسجة الأذن.
   3. Intubate الخنزير لضمان أن معدل التنفس يمكن تنظيمها طوال فترة الجراحة.
      ملاحظة: تأكد من نجاح التنبيب عن طريق الضغط على الصدر الخنزير وتأكد من أن الهواء منتهية الصلاحية بالقوة يخرج من أنبوب التنبيب.
   4. قم بتوصيل أنبوب التنبيب بجهاز التنفس الصناعي المحدد بمعدل التنفس 14 نفسا / دقيقة.
   5. قم بتوصيل مقياس أكسدة النبض والأصفاد بالذيل لمراقبة معدل ضربات القلب (HR) وضغط الدم (BP) وتشبع الأكسجين (sats). أدخل ميزان حرارة المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية.
   6. إعداد كيس IV من الكيتامين (5 ملغم / كجم / دقيقة) ، ميدازولام (0.25 ملغ / كجم / دقيقة) ، والفنتانيل (2.5 ميكروغرام / كجم / دقيقة) ، في المالحة والبدء في غرس من خلال الوريد الأذن في ما يقرب من 2 قطرات / ثانية.
      ملاحظة: طوال الجراحة، قد يحتاج معدل التسريب إلى زيادة أو انخفاض بناء على حيوية الحيوان.
   7. مع الخنزير في موقف عرضة، بالبات الجزء الخلفي من الرأس والرقبة من الحيوان لتحديد موقع ووضع علامة على قمة القذالي والعمود الفقري للفقرات الصدرية الأولى وقاعدة كل أذن.
   8. رسم خط مستقيم بين قمة والفقرات على طول المحور الطولي. رسم خطين من قمة إلى قاعدة كل أذن باتباع قاعدة الجمجمة (الشكل 1A).
   9. تأكد من أن الحيوان في نوم عميق عن طريق لقط الذيل بعناية ومشاهدة عدم وجود رد فعل الذيل.
      ملاحظة: إذا كان الحيوان لا يزال انعكاسيا ، فيجب زيادة معدل التسريب المخدر تدريجيا حتى لا يظهر الحيوان رد فعل.

2. الجراحة

ملاحظة: من خلال الجراحة، من الضروري أن يكون لديك مساعد واحد على الأقل لشفط النزيف الخفيف وكيا أي أوعية مقطوعة.

1. باستخدام مشرط مع شفرة # 21، وجعل شق الجلد على طول الخط الطولي وصولا الى العضلات.
2. تمديد اثنين من الشقوق الجلدية عمودي كذلك على طول الكتفين، 10-15 سم في الطول.
3. من القمم القذالية، قم بعمل شقوق جلدية على طول الخط وصولا إلى قاعدة كل أذن.
4. تجتاح زوايا الجلد التي تشكلت في قمة القذالي مع ملقط التشريحية، وفصل بعناية الجلد من العضلات الكامنة عن طريق تشغيل طفيفة شفرة مشرط على اللفافة، والانتقال من rostral إلى caudal. بمجرد أن يتم استئصال الجلد بعد كل من الشقوق الخمسة ، يجب أن تكون أجزاء من عضلات الترابيزيوس مرئية.
5. إجراء شق طولي مع مشرط، ما يقرب من 1 سم عميق، حيث ال trapezius يأتي معا في خط الوسط.
   ملاحظة: عند قطع من خلال العضلات، وهناك ميل متزايد للنزيف، لذلك يجب أن يكون جاهزا الكي. إذا تم قطع وعاء أكبر ، يجب على شخص واحد ضغطه بسرعة بالشاش ، في حين يستخدم الشخص الآخر الكي.
6. باستخدام مزيج من ملقط الجراحية المستقيمة والمنحنية، إجراء تشريح حاد العمل على طول قطع طولية في العضلات. وهذا سيفصل بين البطون من trapezius، فضلا عن العضلات الكامنة شبهpinalis capitus biventer.
7. قطع أي ألياف العضلات المستمرة مع مشرط ومواصلة تشريح حادة حتى يصبح شبهpinalis capitus complexus مرئية.
8. قطع أصول trapezius وشبهpinalis كابيتوس biventer العضلات على طول الجانب الخلفي من الجمجمة. فصل بعناية لهم طوليا مع مشرط إجراء تشريح حاد حتى مجمع الكابيتوس semispinalis مرئيا تماما.
9. تراجع عن trapezius وشبهpinalis كابيتوس biventer العضلات باستخدام الاحتفاظ الذاتي التراجع.
10. حيث البطون من مجمع الكابيتوس semispinalis معا في خط الوسط، وجعل شق طولي مع مشرط ما يقرب من 1 سم عميق.
    ملاحظة: كن على علم بأي نزيف إضافي هنا. يمكن إدارة النزيف باستخدام مزيج من مسحات القطن والكي.
11. باستخدام ملقط الجراحية، وإجراء تشريح حاد العمل على طول قطع طولية بين البطون العضلات حتى الجانب الظهري من أطلس (CI) واضح.
12. قطع أصول العضلات شبهpinalis capitus complexus على طول الجانب الخلفي من الجمجمة وفصلها طوليا من الفقرات الكامنة عن طريق المشرط وتشريح حادة.
13. تراجع عن عضلات شبهpinalis capitus complexus باستخدام مجموعة أخرى من الحفارات ذاتية الاحتفاظ.
14. باستخدام مشرط، وإزالة بعناية أي الأنسجة المتبقية فوق المنطقة حيث يلتقي أطلس قاعدة الجمجمة.
15. وضع ذراع واحدة تحت عنق الحيوان وإصبع واحد عند منعطف الأطلس والجمجمة ، ورفع الرأس في وقت واحد وثني الرقبة أثناء الخفقان بإصبع للكشف عن ماجنا السيسترنا باستخدام اليد الأخرى.
    ملاحظة: يمكن التعرف على ماجنا cisterna عند الخفقان كبنية مرنة قوية مع كمية صغيرة من الارتداد كما يتم تحرير الضغط مع الإصبع.

3. القنينة والحقن

ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة أيضا شخصين على الأقل ويتم تنفيذها مع ارتفاع رأس الحيوان وثني الرقبة.

1. تأكد من أن شخصا واحدا يرفع وينثني رأس وعنق الحيوان في حين أن الخفقان الآخر للشهامة cisterna جعل مذكرة من موقعه التشريحي.
2. ببطء وبعناية إدخال قنية 22 G من خلال دورا وإلى ماجنا cisterna في زاوية مائلة إلى المحور الطولي.
   ملاحظة: لا تقم بإدخال القنية عميقة جدا، لأن هذا يمكن أن يسبب تلفا في الدماغ. معرفة إلى أي مدى لإدراج القنية يأتي مع الخبرة في فهم كيف يشعر للقنية لاختراق دورا. أساسا، تماما كما تم ثقب دورا، القنية ثم عميقة بما يكفي لحقن التتبع ناجحة. هذا العمق هو ما يقرب من 3-5 ملم ولكن سوف تختلف على أساس حجم أو عمر الحيوان. وينبغي أن يكون التشجير الناجح واضحا على الفور من خلال تصور CSF النابض الواضح الذي يصعد القنية. للحصول على أفضل النتائج, فمن المستحسن لممارسة العديد من cannulations مسبقا في الحيوانات القتل الرحيم للحصول على فهم المرء من ثقب الجافية.
3. سحب الإبرة من القنية ووضع غطاء على القفل.
4. أولا، تطبيق superglue ومسرع حيث تدخل القنية الأنسجة، تليها تطبيق الاسمنت الأسنان. انتظر لمدة 5 دقائق حتى يصلب الإسمنت.
5. إزالة الغطاء بعناية من القنية وإرفاق نهاية الذكور من الصنبور خط الرابع المعدة سابقا مع تمديد 10 سم، مع التتبع، إلى القنية.
6. حقن التتبع ببطء باليد أو باستخدام مضخة ضخ صغيرة بمعدل 100 ميكرولتر / دقيقة. قم بإزالة الصنبور الخط الرابع ثلاثي الطرق مع تمديد 10 سم واستبداله بالغطاء. يجب أن يكون التتبع الآن نابضا مرئيا عند قاعدة القنية (فيديو تكميلي 1).
   ملاحظة: إذا حقن باليد، القيام بذلك حتى التتبع هو فقط لا تزال مرئية في رمح القنية، ما يقرب من 1-2 مم أعلاه حيث يغطي الاسمنت الأسنان رمح.
7. بعد الحقن، ضع أكياس الرمل تحت الرقبة للحفاظ على بعض الإنثناء. ثم يمكن إطلاق الرأس ، ويترك الحيوان في وضع عرضة للراحة.
8. الإفراج عن الحفارات الذاتي الاحتفاظ ووضع العضلات لأنها تكمن من قبل. جمع الجلد معا على العضلات باستخدام المشابك منشفة الجراحية.
9. تغطية المشابك منشفة وشق مع الشاش ثم بطانية للحد من فقدان الحرارة.
10. السماح للمتتبع بالانتشار في الوقت المطلوب قبل القتل الرحيم للحيوان عن طريق أي v. حقن بنتوباربيتال (140 ملغم/كغ). تأكيد القتل الرحيم من خلال عدم وجود أصوات القلب على auscultation مع سماعة الطبيب.

4. استخراج الدماغ وتجهيزه

1. باستخدام مشرط مع 20 شفرة، وتوسيع شق الجلد الطولي من قمة القذالي إلى ما يقرب من 7 سم فوق الأنف.
2. تعكس الجلد overlying الجانب الظهري للجمجمة باستخدام مشرط.
   ملاحظة: هناك عدة طرق لقطع وإزالة الجانب الظهري من جمجمة الخنزير على أساس كل على حدة. ما يلي هو الإجراء الذي نجح في معظم الأحيان لهذه التجربة.
3. باستخدام منشار مدمج محمول باليد ، قم بقطع تاجي في الجمجمة ، على بعد 3 سم تقريبا فوق الوريدين الكبيرين اللذين شوهدا يخرجان من الجمجمة. تمتد إلى اثنين من التخفيضات العمودية أخرى من التخفيضات التاجية واثنين من تخفيضات أخرى لتحقيق التخفيضات العمودية معا في خط الوسط.
   ملاحظة: الحفاظ على قبضة قوية من المنشار عند إجراء تخفيضات العظام الجمجمة لأنها سوف تميل إلى سحب بعيدا عند أول اتصال مع العظام أو الأنسجة، والتي يمكن أن تؤدي إلى إصابة شديدة.
4. تأكد من أن قطع الجمجمة هي من خلال سمك كامل من العظام عن طريق متابعة مع مطرقة وإزميل ضيق (10 ملم) إلى كل من التخفيضات.
5. باستخدام المطرقة، وأخيرا ضرب إزميل واسعة (25-30 ملم) في قطع التاجية. مع شخص واحد دعم الرأس، وضمان أن الشخص الآخر ينطبق النفوذ على إزميل لwince فتح الجمجمة الظهرية.
6. بمجرد إزالة جزء الجمجمة الظهرية ، تشريح ماطر دورا المفرط باستخدام مقص جراحي منحني.
7. استخدام ملعقة لتشد الحبل الشوكي من المخيخ في الجانب rostral. ثم المضي قدما لتوجيه ملعقة تحت الدماغ من الجبهة، وقطع المصابيح الشمية، الغدة النخامية، والأعصاب الجمجمة.
8. ضع ملعقة خلف المخيخ وتطبيق كمية لا بأس بها من الضغط لطرد الدماغ من تجويف الجمجمة، ورفع بعناية بها مرة واحدة فضفاضة.
9. إصلاح الدماغ كله على الفور عن طريق الانغماس في الأنسجة 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة، من الممكن إجراء تصوير الدماغ بأكمله باستخدام مجسم (الشكل 1E).
10. في اليوم التالي، وجعل شرائح تاجية من الدماغ باستخدام سكين السلمون وإصلاح شرائح بين عشية وضحاها عن طريق الانغماس في الأنسجة 4٪ paraformaldehyde.
11. وأخيرا، ضع الشرائح في 0.01٪ azide في برنامج تلفزيوني للتخزين على المدى الطويل.

النتائج

بمجرد أن يفقد الخنزير وعيه ، يتم ملامسته ، ويتم وضع علامة على تشريح سطحه ، بدءا من قمة القذالي (OC) والعمل نحو الفقرات الصدرية (التلفزيون) وكل قاعدة أذن (EB). وعلى هذا المنوال يتم إجراء الشقوق الجلدية (الشكل 1A). يتم إعادة استئصال طبقات العضلات الثلاث بما في ذلك trapezius ، semispinalis capitus ...

Discussion

هنا، يوصف، بروتوكول مفصل لتنفيذ العلبة المباشرة للشهامة cisterna في الخنازير، بما في ذلك الإعداد اللازم، وإجراء العمليات الجراحية، ضخ التتبع واستخراج الدماغ. وهذا يتطلب شخص لديه خبرة وشهادة للعمل مع الحيوانات الكبيرة. إذا نفذت بشكل صحيح، وهذا يسمح لتسليم الجزيئات المطلوبة مع ضمان مباشرة في ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA