Прямая имплантация канюли в Cisterna Magna свиней

Резюме

В данной статье представлен пошаговый протокол прямой имплантации канюли в цистерну свиней.

Аннотация

Глимфатическая система представляет собой систему очистки отходов в мозге, которая зависит от потока спинномозговой жидкости (CSF) в периваскулярных пространствах, связанных с астроцитами, и участвует в клиренсе нейротоксических пептидов, таких как бета-амилоид. Нарушение глимфатической функции усугубляет патологию заболевания на животных моделях нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, что подчеркивает важность понимания этой системы клиренса. Глимфатическая система часто изучается с помощью cisterna magna cannulations (CMc), где индикаторы доставляются непосредственно в спинномозговую жидкость (CSF). Большинство исследований, однако, были проведены на грызунах. Здесь мы демонстрируем адаптацию техники CMc у свиней. Используя CMc у свиней, глимфатическая система может быть изучена с высоким оптическим разрешением в гиренцефальном мозге и при этом преодолевает разрыв в знаниях между грызунами и человеческими глимфатиками.

Введение

Спинномозговая жидкость (ликвор) представляет собой ультрафильтрат крови, который находится внутри и вокруг центральной нервной системы (ЦНС)^1,2. Помимо придания плавучести мозгу или поглощения повреждающих механических сил, ликвор также играет ключевую роль в очистке метаболических отходов из ^ЦНС3. Очистка отходов облегчается недавно охарактеризованной глимфатической системой, которая позволяет конвективному потоку ликвора через паренхиму мозга через периваскулярные пространства (PVS), которые окружают проникающие артерии3,4,5. Было показано, что этот процесс зависит от аквапорина-4 (AQP4), водного канала, экспрессируемого главным образом на астроцитарном конце, связанном с ^PVS4,6. Исследование глимфатической системы достигается с помощью визуализации in vivo и ex vivo с использованием либо усовершенствованной световой микроскопии, либо магнитно-резонансной томографии (МРТ) после введения флуоресцентного/радиоактивного индикатора или контрастного вещества в CSF7,8,9,10,11.

Эффективным способом введения индикатора в ликвор без повреждения паренхимы головного мозга является канюляция cisterna magna (CMc)^12,13. Подавляющее большинство всех глимфатических исследований до сих пор проводилось на грызунах и избегалось у высших млекопитающих из-за инвазивности CMc в сочетании с практической простотой работы с мелким млекопитающим. Кроме того, тонкие черепа мышей позволяют проводить визуализацию in vivo без необходимости в краниальном окне и впоследствии позволяют проводить неосложненную экстракцию ^{мозга11,14}. Эксперименты, проведенные на людях, дали ценные макроскопические данные in vivo о глимфатической функции, но опирались на инъекции интратекального индикатора в дистальный поясничный отдел позвоночника и, кроме того, использовали МРТ, которая не дает достаточного разрешения для захвата микроанатомии глимфатической системы7,15,16 . Понимание архитектуры и масштабов глимфатической системы у высших млекопитающих имеет важное значение для ее передачи людям. Чтобы облегчить глимфатическую трансляцию людям, важно применять методы, которые проводятся у грызунов, к высшим млекопитающим, чтобы можно было проводить прямые сравнения глимфатической системы между видами с возрастающим познанием и сложностью ^мозга17. Мозг свиньи и человека гиренцефален, обладая складчатой нейроархитектурой, в то время как мозг грызунов лиссенцефален, тем самым имея существенные различия между собой. С точки зрения общего размера, мозг свиньи также более сопоставим с человеческим, будучи в 10-15 раз меньше, чем человеческий мозг, в то время как мозг мыши в 3000 раз ^{меньше18}. Благодаря лучшему пониманию глимфатической системы у крупных млекопитающих, можно будет использовать глимфатическую систему человека для будущего терапевтического вмешательства в таких состояниях, как инсульт, черепно-мозговая травма и нейродегенерация. Прямой CMc у свиней in vivo - это метод, который позволяет проводить световую микроскопию с высоким разрешением глимфатической системы у более высокого млекопитающего. Кроме того, из-за размера используемых свиней можно применять системы мониторинга, аналогичные тем, которые используются в операциях на людях, что позволяет жестко документировать и регулировать жизненно важные функции, чтобы оценить, как они способствуют глимфатической функции.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Этическим комитетом Мальмё-Лунда по исследованиям на животных (Dnr 5.8.18-05527/2019) и проведены в соответствии с руководящими принципами CODEX Шведского исследовательского совета.

1. Подготовка

1. Трассер
   1. Приготовить искусственный ликвор (126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ _NaH2PO4, 2 мМ _MgCl2, 2 мМ _CaCl2, 10 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3; рН 7,4)
   2. К 500 мкл искусственного ликвора добавляют 10 мг альбумина из бычьей сыворотки (BSA), конъюгированной с Alexa Fluor 647 (BSA-647).
   3. Центрифуга при 5000 х г в течение 5 мин и использование супернатанта.
2. Канюля
   1. Прикрепите шприц объемом 1 мл к женскому соединению Luer внутривенной (IV) линии, 3-попутный кран с удлинением 10 см.
   2. Прикрепите иглу весом 18 г к мужскому концу.
   3. Откройте 3-позиционный стоп-замок, чтобы обеспечить непрерывность от иглы до шприца.
   4. Осторожно расстегните иглу и аспирируйте примерно 300 мкл физиологического раствора в внутривенную линию.
   5. Извлеките иглу из физиологического раствора и приступайте к введению некоторого количества воздуха, чтобы создать небольшой воздушный пузырь (5-10 мм) в капельнице.
   6. Поместите иглу в индикатор и аспирируйте все 500 мкл индикатора. Физиологический раствор в линии IV должен быть заметно разделен пузырьком воздуха.
   7. Отбросьте иглу и закройте 3-позиционный стоп-замок.
3. Животное
   1. Успокоить свинью путем внутримышечной (т.m)инъекции тилетамина (3,75 мг/кг) и золазепама (3,75 мг/кг) и дексмедетомидина (37,5 мкг/кг). Подождите, пока он станет бессознательным.
   2. Подготовьте внутривенную линию, вставив канюлю весом 20 г в ушную вену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что канюля находится в вене, введя 5-10 мл физиологического раствора через канюлю. Если вена была пропущена, это будет заметно по небольшому отеку в ткани уха.
   3. Интубируйте свинью, чтобы гарантировать, что частота дыхания может регулироваться на протяжении всей операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте успешную интубацию, оказав давление на грудную клетку свиньи и подтвердив, что принудительно выдохший воздух выходит из интубационной трубки.
   4. Прикрепите интубационную трубку к вентилятору, настроенному на частоту дыхания 14 вдохов/мин.
   5. Подключите пульсоксиметр и манжету к хвосту для мониторинга частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД) и насыщения кислородом (сат). Вставьте ректальный термометр для контроля температуры ядра.
   6. Подготовьте внутривенный пакет кетамина (5 мг/кг/мин), мидазолама (0,25 мг/кг/мин) и фентанила (2,5 мкг/кг/мин) в физиологическом растворе и начните настаивать через ушную вену примерно со скоростью 2 капли/с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции скорость инфузии может потребоваться увеличить или уменьшить в зависимости от жизненных сил животного.
   7. Когда свинья находится в положении лежа, пальпируйте затылок и шею животного, чтобы найти и отметить затылочный гребень и позвоночник первых грудных позвонков и основание каждого уха.
   8. Проведите прямую линию между гребнем и позвонками вдоль продольной оси. Нарисуйте две линии от гребня до основания каждого уха, следуя за основанием черепа (рисунок 1А).
   9. Проверьте, что животное находится в глубоком сне, тщательно зажав хвост и следя за отсутствием хвостового рефлекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное все еще рефлексивно, скорость инфузии анестетика должна постепенно увеличиваться до тех пор, пока животное больше не будет проявлять рефлекс.

2. Хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции необходимо иметь хотя бы одного помощника, чтобы отсасывать легкое кровотечение и прижигать любые разорванные сосуды.

1. Используя скальпель с лезвием No 21, сделайте дермальный разрез вдоль продольной линии вплоть до мышцы.
2. Вытяните два перпендикулярных дермальных разреза дальше вдоль плеч, 10-15 см в длину.
3. От затылочных гребней сделайте дермальные разрезы вдоль линии вплоть до основания каждого уха.
4. Захватив уголки кожи, образовавшиеся на затылочном гребне анатомическими щипцами, аккуратно отделяют кожу от нижележащей мышцы, слегка проводя лезвием скальпеля по фасции, перемещаясь от ростральной к каудальной. После того, как кожа была разрезана после каждого из пяти разрезов, части трапециевидных мышц должны быть видны.
5. Сделайте продольный разрез скальпелем, глубиной примерно 1 см, где трапеция сходится по средней линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При разрезании мышц наблюдается повышенная склонность к кровотечениям, поэтому прижигатель должен быть готов. Если более крупный сосуд разорван, один человек должен быстро сжать его марлей, в то время как другой человек использует прижигатель.
6. Используя комбинацию прямых и изогнутых хирургических щипцов, выполняют тупое рассечение, работая вдоль продольного разреза в мышцах. Это разделит животы трапеции, а также лежащую в основе полуспиналистную мышцу капитула бивентера.
7. Разрежьте все оставшиеся мышечные волокна скальпелем и продолжайте тупое рассечение до тех пор, пока не станет виден полуспиналисный капитусный комплекс.
8. Разрежьте происхождение трапециевидных и полуспиналисных капитуловых бивентерных мышц вдоль заднего аспекта черепа. Аккуратно отделяйте их продольно скальпелем, выполняя тупое рассечение до тех пор, пока полуспиналисный капитусный комплекс не будет полностью виден.
9. Втягивайте трапециевидные и полуспиналисные капитутные бивентерные мышцы с помощью самоудерживающихся ретракторов.
10. Там, где брюха полуспиналисного капитуса сходятся в средней линии, делают продольный разрез скальпелем глубиной примерно 1 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте в курсе любых дополнительных кровотечений здесь. Кровотечением можно управлять с помощью комбинации ватных тампонов и прижигания.
11. Используя хирургические щипцы, выполните тупое рассечение, работающее вдоль продольного разреза между мышечными животами до тех пор, пока дорсальный аспект атласа (CI) не станет ощутимым.
12. Разрежьте истоки мышц полуспиналисного капитусного комплекса вдоль заднего аспекта черепа и отделите его продольно от нижележащих позвонков скальпелем и тупым рассечением.
13. Втягивайте мышцы комплекса полуспиналис капитуса, используя другой набор самоудерживающихся втягивающих устройств.
14. Используя скальпель, осторожно удалите все оставшиеся ткани, выходящие за область, где атлас встречается с основанием черепа.
15. Поместив одну руку под шею животного и один палец на стыке атласа и черепа, одновременно поднимите голову и согните шею, пальпируя пальцем, чтобы выявить cisterna magna другой рукой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Cisterna magna узнаваема при пальпации как сильная упругая структура с небольшим количеством отскока, когда давление высвобождается пальцем.

3. Каннуляция и инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап также требует не менее двух человек и проводится с поднятой головой животного и согнутой шеей.

1. Убедитесь, что один человек поднимает и сгибает голову и шею животного, в то время как другой пальпирует для cisterna magna, отмечая его анатомическое местоположение.
2. Медленно и осторожно вводите канюлю 22 G через твердую мозговую оболочку и в cisterna magna под косым углом к продольной оси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте канюлю слишком глубоко, так как это может привести к повреждению мозга. Знание того, как далеко вставить канюлю, приходит с опытом понимания того, как это чувствует канюля, чтобы пронзить твердую мозговую оболочку. По сути, так же, как твердая мозговая оболочка была проколота, канюля становится достаточно глубокой для успешной инъекции индикатора. Эта глубина составляет примерно 3-5 мм, но будет отличаться в зависимости от размера или возраста животного. Успешная канюляция должна быть сразу очевидна через визуализацию прозрачного, пульсирующего ликвора, поднимающегося по канюле. Для достижения наилучшего результата рекомендуется заранее практиковать несколько канюляций у усыпленных животных, чтобы получить представление о дуральном пирсинге.
3. Вытащите иглу из канюли и поместите колпачок на замок.
4. Сначала применяют суперклей и ускоритель, где канюля попадает в ткани, после чего наносится зубной цемент. Подождите 5 минут, пока цемент затвердеет.
5. Аккуратно снимите колпачок с канюли и прикрепите к канюле мужской конец заранее подготовленного крана IV line с удлинителем на 10 см, с трассером.
6. Медленно вводите индикатор вручную или с помощью микроинфузионного насоса со скоростью 100 мкл/мин. Снимите 3-позиционную линию IV с удлинителем 10 см и замените ее колпачком. Теперь индикатор должен быть виден пульсирующим у основания канюли (Дополнительное видео 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При введении вручную делайте это до тех пор, пока индикатор не будет еще виден в валу канюли, примерно на 1-2 мм выше, где зубной цемент покрывает вал.
7. После инъекции поместите мешки с песком под шею, чтобы сохранить некоторое сгибание. Затем голова может быть освобождена, и животное оставлено в положении лежа.
8. Отпустите самоудерживающиеся ретракторы и поместите мышцы так, как они лежали раньше. Соберите кожу вместе над мышцами с помощью хирургических зажимов для полотенец.
9. Накройте полотенцесушители и разрез марлей, а затем одеялом, чтобы ограничить потерю тепла.
10. Позвольте индикатору циркулировать в течение желаемого времени, прежде чем усыплять животное с помощью i.v. Пентобарбитал для инъекций (140 мг/кг). Подтверждают эвтаназию отсутствием сердечных звуков при аускультации стетоскопом.

4. Извлечение и обработка мозга

1. С помощью скальпеля с 20 лезвиями вытяните продольный дермальный разрез от затылочного гребня примерно до 7 см над носом.
2. Отразите кожу, покрывающую спинной аспект черепа, с помощью скальпеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько способов разрезания и удаления дорсального аспекта черепа свиньи на животной основе. Далее следует процедура, которая чаще всего работала для этого эксперимента.
3. Используя ручную компактную пилу, сделайте корональный разрез в черепе, примерно на 3 см выше двух больших вен, выходящих из черепа. Расширьте до двух дополнительных вертикальных разрезов от корональных разрезов и еще двух дополнительных разрезов, чтобы объединить вертикальные разрезы в средней линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте прочный захват пилы при разрезании кости черепа, так как она будет иметь тенденцию оттягиваться при первом контакте с костью или тканью, что может привести к серьезной травме.
4. Убедитесь, что разрезы черепа проходят через всю толщину кости, следуя молотком и узким зубилом (10 мм) к каждому из разрезов.
5. С помощью молотка, наконец, выбивайте широкое зубило (25-30 мм) в корональный разрез. Когда один человек поддерживает голову, убедитесь, что другой человек применяет рычаг на зубило, чтобы вздрогнуть спинным черепом.
6. После того, как фрагмент спинного черепа был удален, рассекните вышележащую твердую мозговую оболочку с помощью изогнутых хирургических ножниц.
7. Используйте шпатель для тяжелого поражения спинного мозга от мозжечка в ростральном аспекте. Затем приступайте к направлению шпателя под мозг спереди, разрывая обонятельные луковицы, гипофиз и черепно-мозговые нервы.
8. Поместите шпатель за мозжечок и приложите изрядное количество давления, чтобы выбить мозг из полости черепа, осторожно поднимая его после освобождения.
9. Немедленно зафиксируйте весь мозг путем погружения тканей в 4% параформальдегид на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага можно провести визуализацию всего мозга с помощью стереоскопа (рисунок 1E).
10. На следующий день сделайте корональные срезы мозга с помощью лососевого ножа и зафиксируйте срезы на ночь погружением в ткань 4% параформальдегида.
11. Наконец, поместите ломтики в 0,01% азида в PBS для длительного хранения.

Результаты

Как только свинья теряет сознание, ее пальпируют, и ее поверхностная анатомия отмечается, начиная с затылочного гребня (OC) и работая в направлении грудных позвонков (TV) и каждого основания уха (EB). Именно по этим линиям делаются дермальные разрезы (рисунок 1А). Три мышечных ...

Обсуждение

Здесь описан подробный протокол выполнения прямой канюляции cisterna magna у свиней, включающий необходимую подготовку, хирургическую процедуру, инфузию индикатора и извлечение из головного мозга. Для этого требуется кто-то с опытом и сертификацией для работы с крупными животными. При прави...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA