Domuzların Sarnıç Magnasında Doğrudan Kanın İmplantasyonu

Özet

Bu makale, domuzların sarnıç magnasında doğrudan canül implantasyonu için adım adım bir protokol sunun.

Özet

Glimfik sistem, beyin omurilik sıvısının (CSF) astrositlere bağlı pervasküler alanlarda akışına dayanan ve amiloid-beta gibi nörotoksik peptitlerin temizlenmesinde bulaşmış bir atık temizleme sistemidir. Bozulmuş glimfik fonksiyon, Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde hastalık patolojisini şiddetlendirir ve bu da bu boşluk sistemini anlamanın önemini vurgular. Glimfik sistem genellikle sezgilerin doğrudan beyin omurilik sıvısına (CSF) teslim edildiği sarnıç magna cannülasyonları (CMc) tarafından incelenir. Bununla birlikte, çoğu çalışma kemirgenlerde yapılmıştır. Burada, domuzlarda CMc tekniğinin bir uyarlamasını gösteriyoruz. Domuzlarda CMc kullanılarak, glimfatik sistem jinekökenik beyinlerde yüksek optik çözünürlükte incelenebilir ve bunu yaparken kemirgen ve insan glimfatiği arasındaki bilgi boşluğunu kapatır.

Giriş

Beyin omurilik sıvısı (CSF), merkezi sinir sistemi (CNS)^1,2 içinde ve çevresinde bulunan ultrafilt kandır. CSF, beyne yüzdürme vermenin veya zarar verici mekanik kuvvetleri emmenin yanı sıra, metabolik atıkların CNS3'ten temizlenmesinde de önemli bir rol oynar. Atık temizliği, CSF'nin beyin parankiminde pervasküler boşluklar (PVS) yoluyla konvektif akışına izin veren ve nüfuz eden arterleri çevreleyen yakın zamanda karakterize edilen glimfik sistem tarafından kolaylaştırılmıştır3,4,5. Bu işlemin, öncelikle astrositik endfeet üzerinde ifade edilen ve PVS4,6'ya bağlı bir su kanalı olan aquaporin-4'e (AQP4) bağlı olduğu gösterilmiştir. Glimfik sistemin çalışması, CSF7,8,9,10,11'e floresan/radyoaktif izleyici veya kontrast madde girmesini takiben gelişmiş ışık mikroskopisi veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak hem in vivo hem de ex vivo görüntüleme ile elde edilir.

Beyin parankiminde hasara yol etmeden CSF'ye bir izleyici sokmanın etkili bir yolu sarnıç magna kanülasyonundan (CMc)^12,13'dür. Tüm glimfik çalışmaların büyük bir çoğunluğu, şimdiye kadar kemirgenlerde yapılmış ve CMc'nin istilacılığı ve küçük bir memeli ile çalışmanın pratik basitliği nedeniyle daha yüksek memelilerde kaçınılmıştır. Ek olarak, farelerin ince kafatasları, kafatası penceresine ihtiyaç duymadan in vivo görüntülemeye izin verir ve daha sonra karmaşık olmayan bir beyin ekstraksiyonuna izin ^verir11,14. İnsanlarda yapılan deneyler glimfatik fonksiyon hakkında değerli bir makroskopik in vivo veri elde etti, ancak distal lomber omurgadaki intratekal izleyici enjeksiyonlarına dayandı ve ayrıca glimfatik sistemi mikroanatomi yakalamak için yeterli çözünürlük vermeyen MRI'ı kullandı7,15,16 . Yüksek memelilerde glimfik sistemin mimarisini ve kapsamını anlamak, insanlara çevrilmesinde esastır. İnsanlara glimfik çeviriyi kolaylaştırmak için, kemirgenlerde gerçekleştirilen tekniklerin daha yüksek memelilere uygulanması önemlidir, böylece glimfik sistemin artan biliş ve beyin karmaşıklığı türleri arasında doğrudan karşılaştırılmasına izin vermek ^önemlidir17. Domuz ve insan beyinleri katlanmış bir nöroarşisitture sahip olan jinekfaliktir, kemirgen beyinleri ise lisensefaliktir, böylece birbirleri arasında önemli bir fark vardır. Genel boyut açısından, domuz beyinleri de, insan beyninden 10-15 kat daha küçükken, fare beyinleri 3.000 kat daha ^{küçüktür18}. Büyük memelilerde glimfik sistemi daha iyi anlayarak, inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejenerasyon gibi durumlarda gelecekteki terapötik müdahale için insan glimfik sistemini kullanmak mümkün olabilir. Domuz in vivo doğrudan CMc, daha yüksek bir memelide glimfik sistemin yüksek çözünürlüklü ışık mikroskopisine izin veren bir yöntemdir. Ayrıca, kullanılan domuzların büyüklüğü nedeniyle, insan ameliyatlarında kullanılanlara benzer izleme sistemleri uygulamak mümkündür, bu da bunların glimfik işleve nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için hayati işlevleri sıkı bir şekilde belgelemeyi ve düzenlemeyi mümkün hale getirir.

Protokol

Tüm prosedürler Avrupa direktifi 2010/63/EU uyarınca gerçekleştirilmiş ve Malmö-Lund Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi (Dnr 5.8.18-05527/2019) tarafından onaylanmış ve İsveç Araştırma Konseyi'nin CODEX yönergelerine göre yürütülmüştür.

1. Hazırlık

1. Izleyici
   1. Yapay CSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM glikoz, 26 mM NaHCO3; pH 7,4) hazırlayın
   2. 500 μL yapay CSF'ye, Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile eşleştirilmiş sığır serumundan (BSA) 10 mg albümin ekleyin.
   3. 5 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj ve süpernatant kullanın.
2. Kanül
   1. İntravenöz (IV) hattın dişi Luer bağlantısına 1 mL şırınna, 10 cm uzantılı 3 yönlü musluk takın.
   2. Erkek ucuna 18 G iğne takın.
   3. İğneden şırıngaya kadar süreklilik sağlamak için 3 yönlü durdurma kilidini açın.
   4. İğneyi dikkatlice ısıtın ve serum hattına yaklaşık 300 μL salin epire edin.
   5. İğneyi salinden çıkarın ve IV hattında küçük bir hava kabarcığı (5-10 mm) oluşturmak için biraz hava vermeye devam edin.
   6. İğneyi izleyiciye yerleştirin ve izleyicinin 500 μL'lik kısmının tamamını aspire edin. IV hattındaki salin gözle görülür bir şekilde bir hava kabarcığı ile ayrılmalıdır.
   7. İğneyi atın ve 3 yönlü durdurma kilidini kapatın.
3. Hayvan
   1. Bir domuzu karotamin (3.m,75 mg/kg) ve zolazepam (3,75 mg/kg) ve deksmedetomidin (37,5 μg/kg) enjeksiyonu ile yatıştırın. Bilinçsiz olmasını bekle.
   2. Kulak damarına 20 G'lık bir damar yerleştirerek damar içi bir çizgi hazırlayın.
      NOT: Damardan 5-10 mL salin enjekte ederek kanın damarda olduğundan emin olun. Damar ıskalanmışsa, bu kulak dokusundaki küçük ödem ile fark edilecektir.
   3. Nefes alma oranının ameliyat boyunca düzenlenebilmesini sağlamak için domuzu entübe edin.
      NOT: Domuzun toraksına basınç uygulayarak başarılı entübasyon sağlayın ve entübasyon tüpünden zorla süresi dolmuş havanın geldiğini onaylayın.
   4. Entübasyon tüpünü 14 nefes/dk nefes hızına ayarlanmış bir ventilatöre takın.
   5. Kalp atış hızını (hr), kan basıncını (BP) ve oksijen doygunluğunu (sat) izlemek için kuyruğa bir darbe oksimetresi ve manşet bağlayın. Çekirdek sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin.
   6. Salin içinde bir IV torba ketamin (5 mg/kg/dk), midazolam (0,25 mg/kg/dk) ve fentanil (2,5 μg/kg/dk) hazırlayın ve kulak damarından yaklaşık 2 damla/sn'de demlenmeye başlayın.
      NOT: Ameliyat boyunca, infüzyon oranının hayvanın hayati değerlerine göre arttırılması veya azaltılması gerekebilir.
   7. Domuz eğilimli pozisyondayken, ilk torasik omurların oksipital tepesini ve omurgasını ve her kulağın tabanını bulmak ve işaretlemek için hayvanın başının ve boynunun arkasını palpe edin.
   8. Uzunlamasına eksen boyunca tepe ve omurlar arasında düz bir çizgi çizin. Kafatasının tabanını takip ederek her kulağın tabanına armadan iki çizgi çizin (Şekil 1A).
   9. Kuyruğu dikkatlice kenetleyerek ve kuyruk refleksinin yokluğunu izleyerek hayvanın derin bir uykuda olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Hayvan hala refleksifse, hayvan artık refleks sergilemeyene kadar anestezik infüzyon oranı artımlı olarak artırılmalıdır.

2. Cerrahi

NOT: Ameliyat boyunca, ışık kanamasını emmek ve kopmuş damarları dağlamak için en az bir asistana sahip olmak gerekir.

1. 21 numaralı bıçaklı bir neşter kullanarak, uzunlamasına çizgi boyunca kaslara kadar dermal bir kesi yapın.
2. omuzlar boyunca 10-15 cm uzunluğunda iki dik dermal kesiyi daha uzatın.
3. Oksipital armalardan, her kulağın tabanına kadar olan çizgi boyunca dermal kesiler yapın.
4. Oksipital krepte oluşan cilt köşelerini anatomik forseps ile kavrama, neşter bıçağını fasya üzerinde hafifçe çalıştırarak, rostralden kaudal'a geçerek cildi alttaki kastan dikkatlice ayırın. Beş kesiden her birini takiben cilt reseksiyon edildikten sonra, trapezius kaslarının parçaları daha sonra görünmelidir.
5. Trapezin orta çizgide bir araya geldiği yaklaşık 1 cm derinliğinde neşterle uzunlamasına bir kesi yapın.
   NOT: Kasları keserken, kanama eğilimi artar, bu nedenle koterizatör hazır olmalıdır. Daha büyük bir damar kesilirse, bir kişi gazlı bezle hızlı bir şekilde sıkıştırmalı, diğer kişi ise kouterizörü kullanmalıdır.
6. Düz ve kavisli cerrahi kürlerin bir kombinasyonunu kullanarak, kaslardaki boyuna kesim boyunca çalışarak künt diseksiyon gerçekleştirin. Bu, yamuk karınlarını ve alttaki semispinalis kapitus biventer kasını ayıracaktır.
7. Kalıcı kas liflerini neşterle kesin ve semispinalis capitus complexus görünene kadar künt diseksiyona devam edin.
8. Kafatasının arka yönü boyunca yamuk ve semispinalis kapitus biventer kaslarının kökenlerini ayırın. Semispinalis capitus complexus tamamen görünene kadar neşter künt diseksiyon yapan neşterle uzunlamasına dikkatlice ayırın.
9. Trapezius ve semispinalis capitus biventer kaslarını kendi kendini koruyan retraktörler kullanarak geri çek.
10. Semispinalis capitus complexus'un karınlarının orta çizgide bir araya geldiği yerde, neşterle yaklaşık 1 cm derinliğinde uzunlamasına bir kesi yapın.
    NOT: Burada herhangi bir ek kanama için dikkat edin. Kanama, pamuklu çubuklar ve koterizasyon kombinasyonu kullanılarak yönetilebilir.
11. Cerrahi tokmalar kullanarak, atlasın (CI) dorsal yönü hissedilebilene kadar kas karınları arasındaki boyuna kesik boyunca çalışarak künt bir diseksiyon yapın.
12. Semispinalis capitus complexus kaslarının kökenlerini kafatasının arka yönü boyunca kesin ve neşter ve künt diseksiyon ile alttaki omurlardan uzunlamasına ayırın.
13. Semispinalis capitus complexus kaslarını başka bir kendi kendini koruyan retraktörler kümesi kullanarak geri çek.
14. Neşter kullanarak, atlasın kafatası tabanıyla buluştuğu bölgenin üzerinde kalan tüm dokuları dikkatlice çıkarın.
15. Bir kolu hayvanın boynunun altına, bir parmağınızı atlasın ve kafatasının ucuna yerleştirin, aynı anda başı yükseltin ve diğer eli kullanarak sarnıç magnasını ortaya çıkarmak için parmakla palpe ederken boynu esnetin.
    NOT: Sarnıç magna, parmakla basınç salındıkça az miktarda ribaund ile güçlü bir elastik yapı olarak palping yaparken tanınabilir.

3. Canülasyon ve enjeksiyon

NOT: Bu adım aynı zamanda en az iki kişi gerektirir ve hayvanın başı yükseltilmiş ve boynu esnemiş olarak gerçekleştirilir.

1. Bir kişinin hayvanın başını ve boynunu yükselttiği ve esnettiğinden emin olun, diğer kişi ise anatomik konumunu not eden sarnıç magna için palpe eder.
2. Yavaşça ve dikkatlice dura boyunca ve sarnıç magna içine boyuna eksene eğik bir açıyla 22 G kanül tanıtın.
   NOT: Canülleri çok derine sokmayın, çünkü bu beyne zarar verebilir. Canül'ün ne kadar uzağa yerleştirılacağını bilmek, canüllerin durayı delmenin nasıl hissettirdiğini anlama deneyimi ile birlikte gelir. Esasen, dura delindiği gibi, cannula daha sonra başarılı bir izleyici enjeksiyonu için yeterince derindir. Bu derinlik yaklaşık 3-5 mm'dir, ancak hayvanın büyüklüğüne veya yaşına göre farklılık gösterecektir. Başarılı cannülasyon, canüle yükselen net, pulsatil CSF'nin görselleştirilmesiyle hemen belirgin olmalıdır. En iyi sonuç için, kişinin dural piercing anlayışını elde etmek için ötenazili hayvanlarda önceden birkaç cannülasyon uygulanması önerilir.
3. İğneyi kanülden geri çek ve kilidin üzerine bir kapak yerleştirin.
4. İlk olarak, süperglue ve canülün dokuya girdiği bir hızlandırıcı uygulayın, ardından diş çimentosunun uygulanması. Çimentonun sertleşmesi için 5 dakika bekleyin.
5. Kapağı kanamadan dikkatlice çıkarın ve daha önce hazırlanmış IV hat musluğunun erkek ucunun 10 cm uzantılı, izleyici ile birlikte damara takın.
6. İzleyiciyi elle veya 100 μL/dk hızında bir mikro infüzyon pompası kullanarak yavaşça enjekte edin. 10 cm uzantılı 3 yönlü IV hat musluğunu çıkarın ve kapakla değiştirin. İzleyici artık canül tabanında nabız atarken görünür olmalıdır (Ek Video 1).
   NOT: Elle enjekte ediyorsanız, izleyici, diş çimentosunda şaftın kaplandığı yerin yaklaşık 1-2 mm yukarısındaki ampul şaftında hala görünene kadar bunu yapın.
7. Enjeksiyondan sonra, biraz esnemeyi korumak için boynun altına kum torbaları yerleştirin. Baş daha sonra serbest bırakılabilir ve hayvan dinlenmeye eğilimli bir pozisyonda bırakılır.
8. Kendini koruyan retraktörleri serbest bırakın ve kasları daha önce uzandıkları gibi yerleştirin. Cerrahi havlu kelepçeleri kullanarak cildi kasların üzerinde bir araya getirin.
9. Havlu kelepçelerini ve kesiyi gazlı bezle örtün ve ardından ısı kaybını sınırlamak için bir battaniye.
10. İzleyicinin, hayvanı i.v. ile ötenazi yapmadan önce istenen süre boyunca dolaşmasına izin verin. Pentobarbital enjeksiyon (140 mg/kg). Ötanaziyi stetoskopla auscultasyon üzerine kalp seslerinin yokluğu ile onaylayın.

4. Beyin çıkarma ve işleme

1. 20 bıçaklı bir neşter kullanarak, uzunlamasına dermal kesiği oksipital kretten burundan yaklaşık 7 cm yukarı uzatın.
2. Neşteri kullanarak kafatasının dorsal yönünün üzerinde bulunan cildi yansıtın.
   NOT: Domuz kafatasının sırt yönünü hayvan bazında kesmenin ve çıkarmanın birkaç yolu vardır. Aşağıdakiler, bu deney için en sık işe yarayan prosedürdür.
3. El tipi kompakt bir testere kullanarak, kafatasından çıkarken görülen iki büyük damarın yaklaşık 3 cm üzerinde kafatasında bir koronal kesim yapın. Koronal kesimlerden iki dikey kesime ve dikey kesimleri orta çizgide bir araya getirmek için iki kesime daha genişletin.
   NOT: Kafatası kemik kesiklerini yaparken testerenin sıkı bir tutuşunu sağlayın, çünkü kemik veya doku ile ilk temasta çekilme eğilimindedir, bu da ciddi bir yaralanmaya yol açabilir.
4. Her kesime bir çekiç ve dar keski (10 mm) ile takip ederek kafatası kesiklerinin kemiğin tüm kalınlığından geçtiğinden emin olun.
5. Çekici kullanarak, son olarak koronal kesime geniş bir keski (25-30 mm) vurun. Bir kişi başı desteklerken, diğer kişinin sırt kafatasını açmak için keskiye kaldıraç uyguladığından emin olun.
6. Sırt kafatası parçası çıkarıldıktan sonra, kavisli cerrahi makas kullanarak overlying dura mater'i parçalara çıkarın.
7. Rostral açıdan beyinciği serebellumdan şiddetli hale getirmek için bir spatula kullanın. Daha sonra beynin altındaki spatulayı önden yönlendirmeye devam edin, koku ampullerini, hipofiz bezini ve kraniyal sinirleri ayırın.
8. Spatulayı beyinciğin arkasına yerleştirin ve beyni kafatası boşluğundan çıkarmak için oldukça fazla basınç uygulayın, serbest kaldıktan sonra dikkatlice kaldırın.
9. Bir gecede % 4 paraformaldehit içinde doku daldırma ile hemen tüm beyni sabitlemek.
   NOT: Bu adımdan sonra, tüm beyin görüntülemesini stereoskop kullanarak gerçekleştirmek mümkündür (Şekil 1E).
10. Ertesi gün, bir somon bıçağı kullanarak beynin koronal dilimlerini yapın ve dilimleri bir gecede% 4 paraformaldehitte doku daldırma ile sabitleyin.
11. Son olarak, dilimleri uzun süreli depolama için PBS'de% 0.01 azide yerleştirin.

Sonuçlar

Domuz bilinçsiz hale geldikten sonra palpe olur ve yüzey anatomisi oksipital kret (OC) den başlayarak torasik omurlara (TV) ve her kulak tabanına (EB) doğru çalışarak işaretlenir. Dermal kesilerin yapıldığı bu hatlar boyuncadır (Şekil 1A). Trapezius, semispinalis capitus biventer ve semispinalis capitus complexus dahil olmak üzere üç kas tabakası resected ve sarnıç magna (CM) ortaya çıkarmak için kendi kendini tutan retraktörler iki set tarafından açık tutulur (

Tartışmalar

Burada, gerekli hazırlık, cerrahi prosedür, izleyici infüzyonu ve beynin çıkarılması da dahil olmak üzere domuzlarda sarnıç magnasının doğrudan kanülasyonunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu, büyük hayvanlarla çalışmak için deneyime ve sertifikaya sahip birini gerektirir. Doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, bu, istenen moleküllerin doğrudan CSF'ye teslim edilmesine izin verir, bundan sonra büyük bir memelide CSF dağılımını ve glimfik fonksiyonu y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA