돼지의 시스테나 마그나에서 직접 캐뉼라 이식

요약

이 문서에서는 돼지의 시스테나 마그나에서 직접 캐뉼라 이식에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

초록

글리파틱 시스템은 성상세포-경계 계피 공간에서 뇌척수액(CSF)의 흐름에 의존하는 뇌의 폐통관 시스템으로 아밀로이드 베타와 같은 신경독성 펩타이드의 클리어런스에 연루되어 있다. 손상된 g림프 기능은 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에서 질병 병리학을 악화시며, 이는 이 통관 시스템을 이해하는 것의 중요성을 강조합니다. 글리파틱 시스템은 종종 추적자가 뇌척수액 (CSF)으로 직접 전달되는 cisterna magna 캐니어 (CMc)에 의해 연구됩니다. 대부분의 연구, 그러나, 설치류에서 수행 되었습니다. 여기에서는 돼지의 CMc 기술의 적응을 보여줍니다. 돼지에서 CMc를 사용하여, glymphatic 시스템은 자임내팔리크 두뇌에 있는 높은 광학 해상도에서 공부될 수 있고 이렇게 해서 설치류와 인간 glymphatics 사이 지식 격차를 다리.

서문

뇌척수액 (CSF)은 중추 신경계 (CNS)^1,2 의 안팎에서 발견되는 혈액의 초침염입니다. CSF는 뇌에 부력을 주거나 해로운 기계적 힘을 흡수하는 것 외에도 ^CNS3에서 대사 폐기물을 제거하는 데 중추적인 역할을 합니다. 폐적 통관은 관통 동맥을 둘러싸고 있는 인식 공간(PVS)을 통해 뇌 완충증을 통해 CSF의 대류 흐름을 허용하는 최근 특징의 글리프파틱 시스템에 의해 촉진된다^3,4,5. 이 과정은 PVS4,6에 바인딩 된 성상체 끝발에 주로 표현 된 수로 인 아쿠아 포린-4 (AQP4)에 의존하는 것으로 나타났습니다. glymphatic 시스템의 연구는 ^CSF7, ^8,9,10,11에 형광/방사성 추적자 또는 조영제의 도입에 따라, 향상된 광 현미경 검사법 또는 자기 공명 화상 진찰 (MRI)를 사용하여 생체 내 및 전 생체 이미징 모두에 의해 달성된다.

뇌 완두엽에 손상을 주지 않고 CSF에 트레이서를 도입하는 효과적인 방법은 시스테나 마그나 수분(CMc)^12,13을 통해서입니다. 모든 glymphatic 연구의 대부분은, 지금까지 설치류에서 수행되고 작은 포유동물로 작업의 실제적인 단순성에 결합된 CMc의 침략성 때문에 더 높은 포유동물에서 피했습니다. 추가적으로, 마우스의 얇은 두개골은 두개골 창에 대한 필요없이 생체 내 이미징을 허용하고 이후 복잡하지 않은 뇌 추출을 허용^11,14. 인간에서 수행된 실험은 글리프파틱 기능에 대한 생체 내 데이터에서 귀중한 거시적 인 거시적 인 생성을 산출했지만, 황실 요추 척추의 내 추적자 주사에 의존하고, 또한, 글리파틱 시스템 ^7,15,16을 포착하기에 충분한 해상도를 산출하지 않는 MRI를 활용 . 더 높은 포유류에서 글리프파틱 시스템의 건축과 범위를 이해하는 것은 인간에게 의한 번역에 필수적입니다. 인간에 대한 림프변환을 용이하게 하기 위해서는 인식과 뇌의 복잡성이 증가하는 종에 걸쳐 글리파틱 시스템의 직접 비교를 허용하도록 설치류에서 수행되는 기술을 더 높은 포유류에 적용하는 것이 중요합니다^. 돼지와 인간의 뇌는 접힌 신경 구조를 소유, 자이렌스 실릭, 설치류 뇌는 lissencephalic 동안, 따라서 서로 상당한 차이를 갖는. 전반적인 크기의 관점에서, 돼지 두뇌는, 또한, 인간에 게 더 비교, 되 고 10-15 인간의 두뇌 보다 작은 시간, 마우스 두뇌는 3,000 배 작은 ¹⁸. 큰 포유동물의 림프계를 더 잘 이해함으로써 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 신경 변성과 같은 조건에서 미래의 치료 개입을 위해 인간 림프시스템을 활용할 수 있을 수 있다. 생체 내돼지에서 직접 CMc는 더 높은 포유동물에서 글리프파틱 시스템의 고해상도 광 현미경 검사를 허용하는 방법입니다. 또한, 사용되는 돼지의 크기로 인해, 이러한 글리파스틱 기능에 기여하는 방법을 평가하기 위해 중요한 기능을 엄격하게 문서화하고 조절할 수 있도록 인간 수술에 사용되는 것과 유사한 모니터링 시스템을 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 동물 연구에 대한 말뫼 룬드 윤리위원회 (Dnr 5.8.18-05527/2019)의 승인을 받았으며 스웨덴 연구 위원회의 CODEX 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

1. 예광탄
   1. 준비 인공 CSF (126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM 포도당, 26 mM NaHCO3; pH 7.4)
   2. 인공 CSF의 500 μL에, 알렉사 플루어 647 (BSA-647)와 결합 소 혈청 (BSA)에서 알부민 의 10 mg을 추가합니다.
   3. 5,000 x g 의 원심분리기는 5분 동안 상복부를 사용합니다.
2. 정 맥
   1. 정맥 내 (IV) 라인의 여성 루어 연결에 1 mL 주사기를 부착하고, 10cm 연장으로 3 가지 탭을 누릅니다.
   2. 남성 끝에 18 G 바늘을 부착합니다.
   3. 바늘에서 주사기까지 연속성을 허용하기 위해 3방향 정지 잠금을 엽니다.
   4. 조심스럽게 바늘을 풀고 식염수의 약 300 μL을 IV 선으로 흡인시합니다.
   5. 식염수에서 바늘을 제거하고 IV 라인에 작은 기포 (5-10mm)를 만들기 위해 일부 공기에 도입진행.
   6. 바늘을 트레이서에 넣고 트레이서의 500 μL 을 모두 흡인합니다. IV 라인의 식염수는 기포로 눈에 띄게 분리되어야 합니다.
   7. 바늘을 버리고 3 방향 정지 잠금을 닫습니다.
3. 동물
   1. 틸타민(i.m.) 내근육주사(i.m.) 및 졸라제팜(3.75 mg/kg) 및 덱스메데토미딘(37.5 μg/kg)을 주입하여 돼지를 진정시킵니다. 의식이 없어질 때까지 기다립니다.
   2. 귀 정맥에 20 G 캐뉼라를 삽입하여 정맥 라인을 준비합니다.
      참고: 캐뉼라를 통해 5-10mL의 식염수를 주입하여 캐뉼라가 정맥에 있는지 확인하십시오. 정맥이 놓친 경우, 이것은 귀 조직에 있는 작은 부종에 의해 눈에 띄는 것입니다.
   3. 호흡 속도가 수술 내내 조절될 수 있는지 확인하기 위하여 돼지를 삽관합니다.
      참고: 돼지 의 흉부에 압력을 가하여 성공적인 삽관을 확인하고 강제로 만료 된 공기가 삽관에서 나오는지 확인하십시오.
   4. 14 호흡 /분의 호흡 속도에 설정 된 인공 호흡기에 관착 튜브를 부착합니다.
   5. 맥박 산소계와 커프를 꼬리에 연결하여 심박수(HR), 혈압(BP), 산소 포화도(토)를 모니터링합니다. 직장 온도계를 삽입하여 코어 온도를 모니터링합니다.
   6. 케타민(5 mg/kg/min), 미다졸람(0.25 mg/kg/min), 펜타닐(2.5 μg/kg/min)의 IV 백을 식염수에 넣고 약 2방울/s로 귀 정맥을 통해 주입하기 시작합니다.
      참고: 수술 내내, 동물의 활력에 따라 주입 속도를 증가하거나 감소해야 할 수도 있습니다.
   7. 돼지를 수시하는 위치에 두근하면 동물의 머리와 목 뒤쪽을 만지시면 첫 번째 흉부 척추의 후두 문장과 척추와 각 귀의 베이스를 찾아 표시합니다.
   8. 문장과 세로 축을 따라 척추 사이에 직선을 그립니다. 두개골의 기저에 따라 각 귀의 바닥에 문장에서 두 줄을 그립니다 (그림 1A).
   9. 조심스럽게 꼬리를 고정하고 꼬리 반사의 부재를 보고 동물이 깊은 수면에 있는지 확인합니다.
      참고: 동물이 여전히 반사적인 경우, 동물이 더 이상 반사를 나타내지 않을 때까지 마취 주입 속도를 점진적으로 늘려야 합니다.

2. 수술

참고 : 모든 수술을 통해, 빛 출혈을 흡입하고 절단 된 혈관을 소작적어도 하나의 조수가 필요합니다.

1. # 21 블레이드가있는 메스를 사용하여 근육에 세로 선을 따라 진피 절개를합니다.
2. 길이 10-15cm의 어깨를 따라 두 개의 수직 진피 절개를 더 확장합니다.
3. 후두 문장에서 라인을 따라 진피 절개를 각 귀의 밑면까지 만듭니다.
4. 해부학 적 집게와 후두 문장에 형성 된 피부 모서리를 잡고, 조심스럽게 근막 위에 메스 블레이드를 실행하여 기본 근육에서 피부를 분리, 코달로 로스트랄에서 이동. 일단 피부가 5개의 절개 각각에 따라 절제되면, 사다리꼴 근육의 일부가 그 때 보입니다.
5. 약 1cm 깊이의 메스와 세로 절개를 만드세요.
   참고 : 근육을 절단 할 때 출혈에 대한 경향이 증가하므로 소작자가 준비되어야합니다. 더 큰 용기가 절단되면 한 사람이 거즈로 빠르게 압축하고 다른 사람은 소작기를 사용해야합니다.
6. 직선 및 곡선 수술 집게의 조합을 사용하여, 근육의 세로 절단을 따라 작업 무딘 해부를 수행. 이것은 사다리꼴의 배뿐만 아니라 기본 반스피니스 카피투스 biventer 근육을 분리합니다.
7. 메스로 지속근육 섬유를 끊고 반스피니스 카피투스 복합체가 보일 때까지 무딘 해부를 계속 합니다.
8. 두개골의 후방 측면을 따라 사다리꼴과 반척추 경 카피투스 biventer 근육의 기원을 끊으시다. 반스피니스 카피투스 복합체가 완전히 드러날 때까지 무딘 해부를 수행하는 메스와 신중하게 분리하십시오.
9. 사다리꼴과 반척추 카피투스 비벤터 근육을 자체 유지 리트랙터를 사용하여 철회하십시오.
10. 세미스피니스 카피투스 복합체의 배가 중간에 모이는 경우, 약 1cm 깊이의 메스와 세로 절개를 합니다.
    참고: 여기에 추가 출혈에 유의하십시오. 출혈은 면 봉면과 소생의 조합을 사용하여 관리 할 수 있습니다.
11. 외과 용 집게를 사용하여, 아틀라스 (CI)의 등삼 측면이 만질 때까지 근육 배 사이의 세로 절단을 따라 작동하는 무딘 해부를 수행합니다.
12. 두개골의 후방 측면을 따라 반척추 카피투스 복합 근육의 기원을 끊고 메스와 무딘 해부에 의한 근본적인 척추에서 세로로 분리하십시오.
13. 반척추기 카피투스 복합 근육을 철회하는 것은 자기 유지 리트랙터의 또 다른 세트를 사용하여.
14. 메스를 사용하여 아틀라스가 두개골 베이스를 만나는 부위에 남은 조직을 조심스럽게 제거하십시오.
15. 동물의 목 아래에 한 쪽 팔을 두고 아틀라스와 두개골의 정편에 한 손가락을 두면 동시에 머리를 올리고 손가락을 만지면서 목을 구부려 다른 손으로 시스테르나 마그나를 드러냅니다.
    참고: 시스테나 마그나는 손가락으로 압력이 방출될 때 소량의 리바운드를 가진 강한 탄성 구조로 만지날 때 알아볼 수 있습니다.

3. 수분 및 주입

참고: 이 단계는 또한 적어도 두 사람이 필요하고 동물의 머리가 상승하고 목이 구부러져 수행됩니다.

1. 한 사람이 동물의 머리와 목을 높이고 굴곡하도록 하는 한편, 다른 한 명은 시스테나 마그나를 위해 해부학적 위치를 기록합니다.
2. 천천히 조심스럽게 22 G 캐뉼라를 두라를 통해 시스테나 마그나에 경사축으로 바른 각도로 도입한다.
   참고: 이 뇌에 손상을 일으킬 수 있습니다 너무 깊은 캐뉼라를 삽입하지 마십시오. 캐뉼라를 얼마나 멀리 삽입하는지 아는 것은 두라를 관통하는 캐뉼라의 기분을 이해하는 경험과 함께 제공됩니다. 본질적으로, 두라가 관통된 것처럼, 캐뉼러는 성공적인 트레이서 주입을 위해 충분히 깊습니다. 이 깊이는 약 3-5 mm이지만 동물의 크기 또는 나이에 따라 다릅니다. 성공적인 캐뉼링은 캐뉼라를 오르는 투명하고 맥동감 있는 CSF의 시각화를 통해 즉시 분명해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 안락사 동물에서 미리 여러 가지 수식어를 연습하여 두랄 피어싱에 대한 이해를 얻는 것이 좋습니다.
3. 캐뉼라에서 바늘을 철회하고 자물쇠에 캡을 놓습니다.
4. 먼저, 수퍼글루와 가속기를 적용하여 캐뉼라가 조직에 들어간 다음 치과 시멘트를 적용합니다. 시멘트가 굳어질 때까지 5분 동안 기다립니다.
5. 조심스럽게 캐뉼라에서 캡을 제거하고 추적자와 함께 10cm 연장으로 이전에 준비된 IV 라인 탭의 남성 끝을 캐뉼라에 부착합니다.
6. 트레이서를 손으로 천천히 주입하거나 100 μL/min의 속도로 마이크로 주입 펌프를 사용하십시오. 10cm 확장된 3가지 IV 라인 탭을 제거하고 캡으로 교체합니다. 트레이서는 이제 캐뉼라의 기지에서 맥동하는 것으로 표시되어야 합니다(추가 비디오 1).
   참고: 손으로 주입하는 경우, 트레이서가 캐뉼라 샤프트에서 여전히 볼 때까지 이 작업을 수행, 치과 시멘트가 샤프트를 덮고있는 곳 위의 약 1-2 mm.
7. 주사 후, 일부 굴곡을 유지하기 위해 목 아래에 모래 주머니를 배치합니다. 그런 다음 머리가 풀려나고, 동물은 쉬기 쉬운 위치에 남아 있습니다.
8. 자기 유지 리트랙터를 해제 하고 그들은 전에 누워 로 근육을 배치. 수술 수건 클램프를 사용하여 근육 위에 피부를 함께 가져옵니다.
9. 수건 클램프와 거즈로 절개를 한 다음 담요를 덮어 열 손실을 제한합니다.
10. 추적자가 i.v로 동물을 안락사시키기 전에 원하는 시간 동안 순환하도록 허용합니다. 펜토바르비탈 주사 (140 mg/kg). 청진기와 함께 대기에 마음의 부재에 의해 안락사를 확인합니다.

4. 뇌 추출 및 처리

1. 20블레이드가 있는 메스를 사용하여 후두 문장에서 코 위 약 7cm까지 세로 피부 절개를 확장합니다.
2. 메스를 사용하여 두개골의 등뼈 측면을 덮어 피부를 반사합니다.
   참고: 동물별로 돼지 두개골의 등쪽 측면을 자르고 제거하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 다음은 이 실험을 위해 가장 자주 일한 절차입니다.
3. 핸드헬드 컴팩트 톱을 사용하여 두개골에서 관상 절단을 하고, 두개골을 빠져나가는 두 개의 큰 정맥 보다 약 3cm 높이를 만듭니다. 관상 절단에서 두 개의 추가 수직 컷과 중간라인에서 수직 컷을 함께 가져 오는 두 개의 추가 컷으로 확장합니다.
   참고: 두개골 뼈를 잘라낼 때 톱의 단단한 그립을 유지하면 뼈 나 조직과의 첫 번째 접촉이 심한 부상을 입을 수 있으므로.
4. 두개골 컷은 각 컷에 망치와 좁은 끌 (10mm)을 후속하여 뼈의 전체 두께를 통해 있는지 확인합니다.
5. 망치를 사용하여 마침내 넓은 끌 (25-30mm)을 관상 절단에 넣습니다. 한 사람이 머리를 지탱하면 다른 사람이 끌에 레버리지를 적용하여 등쪽 두개골을 열어 보세요.
6. 등대 두개골 파편이 제거되면 곡선 수술 가위를 사용하여 지나치게 두라 메이트를 해부하십시오.
7. 주걱을 사용하여 장신석 의 소뇌에서 척수를 가혹시게하십시오. 그런 다음 후각 전구, 뇌하수체 및 두개골 신경을 분리하여 뇌의 밑에 주걱을 안내합니다.
8. 소뇌 뒤에 주걱을 놓고 두개골 구멍에서 뇌를 빼내기 위해 상당한 양의 압력을 가하고 조심스럽게 한 번 느슨해집니다.
9. 즉시 조직 몰입에 의해 전체 뇌를 고정 4% 파라 포름알데히드 하룻밤.
   참고: 이 단계 후에는 입체(도 1E)를 사용하여 전체 뇌 이미징을 수행할 수 있습니다.
10. 다음 날, 연어 나이프를 사용하여 뇌의 관상 슬라이스를 만들고 4 % 파라 포름 알데히드에 조직 침수에 의해 하룻밤 조각을 수정합니다.
11. 마지막으로, 장기 저장을 위해 PBS에 0.01% 아지드에 슬라이스를 배치합니다.

결과

돼지가 의식이 없는 후에는, 그것은 심근되고, 그것의 표면 해부학은 황두 문장 (OC)에서 시작하여 흉부 척추 (TV) 및 각 귀 기지 (EB)를 향해 일하기 위하여 표시됩니다. 진피 절개가 이루어진 것은 이 선(도 1A)을 따라 이루어진다. 트라페지우스, 세미스피니스 카피투스 비벤터 및 반스피증 카피투스 복합체를 포함한 3개의 근육 층은 시스테나 마그나(CM)(그림 1B

토론

본명, 기술된 바와 같은 상세한 프로토콜은 필요한 제제, 외과적 시술, 추적자 주입 및 뇌추출을 포함하여 돼지에서 시스테나 마그나의 직접 적인 수통을 수행하는 상세한 프로토콜이다. 이를 위해서는 대형 동물과 함께 일하기 위한 경험과 인증을 가진 사람이 필요합니다. 올바르게 수행하면 CSF로 직접 확실하게 원하는 분자를 전달할 수 있으며, 그 후 일련의 다른 고급 광 이미징 양식이 큰 포유...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA