Implantação direta de cânula na Cisterna Magna dos Porcos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para a implantação direta de cânula na cisterna magna dos suínos.

Resumo

O sistema glicênico é um sistema de liberação de resíduos no cérebro que se baseia no fluxo de fluido cefalorraquidiano (CSF) em espaços perivasculares ligados a astrocitos e foi implicado no despejo de peptídeos neurotóxicos como amilóide-beta. A função glifática prejudicada exacerba a patologia da doença em modelos animais de doenças neurodegenerativas, como o Alzheimer, que destaca a importância de entender esse sistema de liberação. O sistema glicênico é frequentemente estudado por cisterna magna cannulations (CMc), onde os rastreadores são entregues diretamente no fluido cefalorraquidiano (CSF). A maioria dos estudos, no entanto, tem sido realizada em roedores. Aqui, demonstramos uma adaptação da técnica CMc em suínos. Usando CMc em suínos, o sistema glicêtico pode ser estudado em alta resolução óptica em cérebros giroscéceis e ao fazê-lo faz a ponte entre roedores e gglifáticos humanos.

Introdução

O fluido cefalorraquidiano (CSF) é um ultrafiltrato de sangue que é encontrado dentro e ao redor do sistema nervoso central (CNS)^1,2. Além de dar flutuação ao cérebro ou absorver forças mecânicas prejudiciais, a CSF também desempenha um papel fundamental na limpeza de resíduos metabólicos do ^CNS3. O despejo de resíduos é facilitado pelo sistema glicêtico recentemente caracterizado que permite o fluxo convectivo de CSF através do parenchyma cerebral através de espaços perivasculares (PVS), que circundam artérias penetrantes3,4,5. Este processo mostrou-se dependente da aquaporina-4 (AQP4), um canal de água expresso principalmente no endfeta astrócito, vinculado ao ^PVS4,6. O estudo do sistema glicêmático é realizado por imagens in vivo e ex vivo, utilizando microscopia de luz avançada ou ressonância magnética (RM), após a introdução de um rastreador fluorescente/radioativo ou agente de contraste no CSF7,8,9,10,11.

Uma maneira eficaz de introduzir um rastreador no CSF sem incorrer em danos ao parênquim cerebral é através da cisterna magna cannulation (CMc)^12,13. A grande maioria de todos os estudos glifáticos, até agora foram realizados em roedores e evitados em mamíferos superiores devido à invasividade do CMC acoplado à simplicidade prática de trabalhar com um pequeno mamífero. Além disso, os crânios finos de camundongos permitem imagens in vivo sem a necessidade de uma janela craniana e, posteriormente, permitem uma extração cerebral descomplicada11,14. Experimentos realizados em humanos produziram um valioso dados in vivo macroscópicos sobre a função glifática, mas se basearam em injeções de rastreador intratecal na coluna lombar distal e, além disso, utilizam ressonância magnética que não produz resolução suficiente para capturar a micronatomia do sistema glicêntico7,15,16 . Compreender a arquitetura e a extensão do sistema glicêtico em mamíferos superiores é essencial para sua tradução para humanos. Para facilitar a tradução glifática para humanos, é importante aplicar técnicas que são realizadas em roedores a mamíferos superiores, de modo a permitir comparações diretas do sistema glicêtico entre espécies de crescente cognição e complexidade ^cerebral17. Os cérebros de porco e humano são gyrencephalic, possuindo uma neuroarquitetura dobrada, enquanto cérebros de roedores são lisscérefálicos, tendo assim uma diferença substancial entre si. Em termos do tamanho geral, os cérebros de porco são, também, mais comparáveis aos humanos, sendo 10-15 vezes menores que o cérebro humano, enquanto os cérebros de camundongos são 3.000 vezes ^menores18. Ao entender melhor o sistema glicêtico em grandes mamíferos, pode ser possível utilizar o sistema glicêtico humano para futura intervenção terapêutica em condições como derrame, lesão cerebral traumática e neurodegeneração. CMc direto em suínos in vivo é um método que permite a microscopia leve de alta resolução do sistema glicêtico em um mamífero superior. Além disso, devido ao tamanho dos suínos utilizados, é possível aplicar sistemas de monitoramento semelhantes aos utilizados em cirurgias humanas, tornando viável documentar e regularmente funções vitais, a fim de avaliar como estes contribuem para a função glifática.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a diretiva europeia 2010/63/UE e aprovados pelo Comitê ético de Malmö-Lund em Pesquisa Animal (Dnr 5.8.18-05527/2019) e conduzidos de acordo com as diretrizes do CODEX do Conselho sueco de Pesquisa.

1. Preparação

1. Traçador
   1. Prepare CSF artificial (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM de glicose, 26 mM NaHCO3; pH 7.4)
   2. A 500 μL de CSF artificial, adicione 10 mg de albumina do soro bovino (BSA) conjugado com Alexa Fluor 647 (BSA-647).
   3. Centrifugar a 5.000 x g por 5 min e usar o supernaspe.
2. Cânula
   1. Conecte uma seringa de 1 mL à conexão luer feminina da linha intravenosa (IV), toque de 3 vias com extensão de 10 cm.
   2. Coloque uma agulha de 18 G na extremidade masculina.
   3. Abra a trava de parada de 3 vias para permitir a continuidade da agulha à seringa.
   4. Desembrulhe cuidadosamente a agulha e aspire aproximadamente 300 μL do soro fisiológico na linha IV.
   5. Remova a agulha do soro fisiológico e prossiga para introduzir um pouco de ar para criar uma pequena bolha de ar (5-10 mm) na linha IV.
   6. Coloque a agulha no rastreador e aspire todos os 500 μL do rastreador. O soro fisiológico na linha IV deve ser visivelmente separado por uma bolha de ar.
   7. Descarte a agulha e feche a trava de parada de 3 vias.
3. Animal
   1. Sedar um porco por injeção intramuscular (i.m.) de tiletamina (3,75 mg/kg) e zolazepam (3,75 mg/kg) e dexmedetomidina (37,5 μg/kg). Espere que fique inconsciente.
   2. Prepare uma linha intravenosa inserindo uma cânula de 20 G na veia do ouvido.
      NOTA: Certifique-se de que a cânula está na veia injetando 5-10 mL de soro fisiológico através da cânula. Se a veia foi perdida, isso será notado por pequeno edema no tecido auditivo.
   3. Entubar o porco para garantir que a taxa de respiração possa ser regulada durante toda a cirurgia.
      NOTA: Certifique-se de intubação bem sucedida aplicando pressão no tórax do porco e confirme que o ar expirado à força está saindo do tubo de intubação.
   4. Conecte o tubo de intubação a um ventilador definido a uma taxa de respiração de 14 respirações/min.
   5. Conecte um oxímetro de pulso e manguito à cauda para monitorar a frequência cardíaca (HR), pressão arterial (PA) e saturação de oxigênio (sats). Insira um termômetro retal para monitorar a temperatura do núcleo.
   6. Prepare um saco IV de cetamina (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) e fentanil (2,5 μg/kg/min), em soro fisiológico e comece a infundir através da veia da orelha a aproximadamente 2 gotas/s.
      NOTA: Durante toda a cirurgia, a taxa de infusão pode precisar ser aumentada ou diminuída com base nos sinais vitais do animal.
   7. Com o porco na posição propensa, palpa a parte de trás da cabeça e pescoço do animal para localizar e marcar a crista occipital e a coluna vertebral das primeiras vértebras torácicas e a base de cada orelha.
   8. Desenhe uma linha reta entre a crista e as vértebras ao longo do eixo longitudinal. Desenhe duas linhas da crista até a base de cada orelha seguindo a base do crânio (Figura 1A).
   9. Verifique se o animal está em um sono profundo, apertando cuidadosamente a cauda e observando a ausência de um reflexo da cauda.
      NOTA: Se o animal ainda estiver reflexivo, a taxa de infusão anestésico deve ser aumentada gradualmente até que o animal não apresente mais reflexo.

2. Cirurgia

NOTA: Durante toda a cirurgia, é necessário ter pelo menos um assistente para aspirar o sangramento leve e cauterizar quaisquer vasos decepos.

1. Usando um bisturi com uma lâmina de 21, faça uma incisão dérmica ao longo da linha longitudinal até o músculo.
2. Estender duas incisões dérmicas perpendiculares mais ao longo dos ombros, 10-15 cm de comprimento.
3. Das cristas occipitais, faça incisões dérmicas ao longo da linha até a base de cada orelha.
4. Agarrando os cantos da pele formados na crista occipital com fórceps anatômicos, separada cuidadosamente a pele do músculo subjacente, executando levemente a lâmina do bisturi sobre a fáscia, movendo-se do rostral para caudal. Uma vez que a pele tenha sido resseccionada após cada uma das cinco incisões, partes dos músculos trapézio devem então ser visíveis.
5. Faça uma incisão longitudinal com o bisturi, aproximadamente 1 cm de profundidade, onde o trapézio se junta na linha média.
   NOTA: Ao cortar os músculos, há uma propensão aumentada para sangramento, por isso o cauterizador deve estar pronto. Se um vaso maior for cortado, uma pessoa deve comprimi-lo rapidamente com a gaze, enquanto a outra pessoa usa o cauterizador.
6. Usando uma combinação de fórceps cirúrgicos retos e curvados, realize dissecção contundente trabalhando ao longo do corte longitudinal nos músculos. Isso separará as barrigas do trapézio, bem como o músculo semi-pinalis capitus biventer subjacente.
7. Corte as fibras musculares persistentes com um bisturi e continue a dissecção contundente até que o complexo semiespinhal se torne visível.
8. Corte as origens dos músculos trapézio e semi-pinalis capitus biventer ao longo do aspecto posterior do crânio. Separe-os longitudinalmente com o bisturi realizando dissecção contundente até que o complexo semiespinhal capitus seja totalmente visível.
9. Retraia os músculos trapézio e semi-pinalis capitus biventer usando retículas auto-retentor.
10. Onde as barrigas do complexo semicírdio capitus se reúnem na linha média, fazem uma incisão longitudinal com o bisturi de aproximadamente 1 cm de profundidade.
    NOTA: Esteja ciente de qualquer sangramento adicional aqui. O sangramento pode ser controlado usando uma combinação de cotonetes de algodão e cauterização.
11. Usando fórceps cirúrgicos, realize uma dissecção contundente trabalhando ao longo do corte longitudinal entre as barrigas musculares até que o aspecto dorsal do atlas (IC) seja palpável.
12. Corte as origens dos músculos semispinalis capitus complexus ao longo do aspecto posterior do crânio e separe-o longitudinalmente das vértebras subjacentes por bisturi e dissecção contundente.
13. Retraia os músculos semispinalis capitus complexus usando outro conjunto de retentores auto-retentores.
14. Usando um bisturi, remova cuidadosamente qualquer tecido remanescente sobrepondo a região onde o atlas encontra a base do crânio.
15. Colocar um braço sob o pescoço do animal e um dedo na conjuntura do atlas e crânio, elevar simultaneamente a cabeça e flexionar o pescoço enquanto palpating com o dedo para revelar a cisterna magna usando a outra mão.
    NOTA: A cisterna magna é reconhecível quando palpating como uma estrutura elástica forte com uma pequena quantidade de rebote à medida que a pressão é liberada com o dedo.

3. Cannulação e injeção

NOTA: Esta etapa também requer pelo menos duas pessoas e é realizada com a cabeça do animal elevada e o pescoço flexionado.

1. Certifique-se de que uma pessoa eleva e flexiona a cabeça e o pescoço do animal enquanto a outra palpates para a cisterna magna fazendo uma nota de sua localização anatômica.
2. Introduza lentamente e cuidadosamente uma cânula de 22 G através da dura e na cisterna magna em um ângulo oblíquo para o eixo longitudinal.
   NOTA: Não insira a cânula muito profunda, pois isso pode causar danos ao cérebro. Saber até onde inserir a cânula vem com experiência em entender como se sente para a cânula furar a dura. Essencialmente, assim como a dura foi perfurada, a cânula é então profunda o suficiente para uma injeção de rastreador bem sucedida. Esta profundidade é de aproximadamente 3-5 mm, mas difere com base no tamanho ou idade do animal. A canulação bem sucedida deve ser imediatamente evidente através da visualização de CSF claro e pulsante subindo a cânula. Para o melhor resultado, recomenda-se praticar várias cannulações antecipadamente em animais eutanizados para obter a compreensão do piercing dural.
3. Retire a agulha da cânula e coloque uma tampa na fechadura.
4. Primeiro, aplique supercola e um acelerador onde a cânula entra no tecido, seguido pela aplicação do cimento dentário. Espere 5 min para o cimento endurecer.
5. Remova cuidadosamente a tampa da cânula e conecte a extremidade masculina da torneira de linha IV previamente preparada com extensão de 10 cm, com o rastreador, à cânula.
6. Injete lentamente o rastreador manualmente ou usando uma bomba de micro infusão a uma taxa de 100 μL/min. Remova a torneira da linha IV de 3 vias com extensão de 10 cm e substitua-a pela tampa. O rastreador deve agora ser visível pulsando na base da cânula (Vídeo Suplementar 1).
   NOTA: Se injetar à mão, faça isso até que o rastreador ainda esteja visível no eixo da cânula, aproximadamente 1-2 mm acima de onde o cimento dental está cobrindo o eixo.
7. Após a injeção, coloque sacos de areia sob o pescoço para manter alguma flexão. A cabeça pode então ser liberada, e o animal é deixado em uma posição propensa a repouso.
8. Solte os retículas auto-retentores e coloque os músculos como eles estavam antes. Aproxime a pele sobre os músculos usando grampos cirúrgicos de toalha.
9. Cubra os grampos de toalha e a incisão com gaze e, em seguida, um cobertor para limitar a perda de calor.
10. Permita que o rastreador circule pelo tempo desejado antes de eutanásia do animal por i.v. Injeção pentobarbital (140 mg/kg). Confirme a eutanásia pela ausência de sons cardíacos sobre a auscultação com um estetoscópio.

4. Extração e processamento cerebral

1. Usando um bisturi com 20 lâminas, estenda a incisão dérmica longitudinal da crista occipital até aproximadamente 7 cm acima do nariz.
2. Reflita a pele sobrepondo o aspecto dorsal do crânio usando o bisturi.
   NOTA: Existem várias maneiras de cortar e remover o aspecto dorsal do crânio de porco em uma base animal por animal. O que se segue é o procedimento que mais tem funcionado para este experimento.
3. Usando uma serra compacta portátil, faça um corte coronal no crânio, aproximadamente 3 cm acima das duas veias grandes vistas saindo do crânio. Estenda-se a mais dois cortes verticais dos cortes coronais e mais dois cortes adicionais para reunir os cortes verticais na linha média.
   NOTA: Mantenha uma aderência firme da serra ao fazer os cortes nos ossos do crânio, pois tenderá a se afastar após o primeiro contato com o osso ou tecido, o que pode levar a uma lesão grave.
4. Certifique-se de que os cortes do crânio são através de toda a espessura do osso, seguindo-se com um martelo e cinzel estreito (10 mm) para cada um dos cortes.
5. Usando o martelo, finalmente bata um cinzel largo (25-30 mm) no corte coronal. Com uma pessoa apoiando a cabeça, certifique-se de que a outra pessoa aplique alavancagem no cinzel para estremecer abrir o crânio dorsal.
6. Uma vez que o fragmento dorsal do crânio tenha sido removido, disseca a dura-máter sobrelada usando uma tesoura cirúrgica curva.
7. Use uma espátula para cortar a medula espinhal do cerebelo no aspecto rostral. Em seguida, prossiga para guiar a espátula sob o cérebro a partir da frente, cortando as lâmpadas olfativas, glândula pituitária e nervos cranianos.
8. Coloque a espátula atrás do cerebelo e aplique uma boa quantidade de pressão para desalojar o cérebro da cavidade craniana, levantando-a cuidadosamente uma vez solta.
9. Fixar imediatamente todo o cérebro por imersão tecidual em 4% de paraformaldeído durante a noite.
   NOTA: Após esta etapa, é possível realizar toda a imagem cerebral usando um estereoscópio (Figura 1E).
10. No dia seguinte, faça fatias coronais do cérebro usando uma faca de salmão e conserte as fatias durante a noite por imersão tecidual em 4% de paraformaldeído.
11. Por fim, coloque as fatias em 0,01% azide no PBS para armazenamento a longo prazo.

Resultados

Uma vez que o porco está inconsciente, ele é palpatado, e sua anatomia superficial é marcada, começando na crista occipital (OC) e trabalhando em direção às vértebras torácicas (TV) e cada base de ouvido (EB). É nesse sentido que as incisões dérmicas são feitas (Figura 1A). As três camadas musculares, incluindo trapézio, semi-pinalis capitus biventer e semispinalis capitus complexus são ressecadas e mantidas abertas por dois conjuntos de retentores auto-retentores para expor ...

Discussão

Aqui está descrito, um protocolo detalhado para realizar a cannulação direta da cisterna magna em suínos, incluindo a preparação necessária, procedimento cirúrgico, infusão de rastreadores e extração do cérebro. Isso requer alguém com experiência e certificação para trabalhar com animais de grande porte. Se realizado corretamente, isso permite a entrega de moléculas desejadas com garantia diretamente no CSF, após a qual uma série de diferentes modalidades avançadas de imagem luminosa podem ser usadas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA