Impianto diretto di cannule nella Cisterna Magna dei Suini

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per l'impianto diretto della cannula nella cisterna magna dei maiali.

Abstract

Il sistema glinfatico è un sistema di rimozione dei rifiuti nel cervello che si basa sul flusso di liquido cerebrospinale (CSF) negli spazi perivascolari legati agli astrociti ed è stato implicato nella clearance di peptidi neurotossici come l'amiloide-beta. La compromissione della funzione glinfatica aggrava la patologia della malattia in modelli animali di malattie neurodegenerative, come l'Alzheimer, il che evidenzia l'importanza di comprendere questo sistema di clearance. Il sistema glinfatico è spesso studiato da cisterna magna cannulations (CMc), dove i traccianti vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF). La maggior parte degli studi, tuttavia, sono stati condotti su roditori. Qui, dimostriamo un adattamento della tecnica CMc nei suini. Utilizzando CMc nei suini, il sistema glinfatico può essere studiato ad alta risoluzione ottica nel cervello vorencefalico e così facendo colma il divario di conoscenza tra roditori e glinfatici umani.

Introduzione

Il liquido cerebrospinale (CSF) è un ultrafiltrato di sangue che si trova all'interno e intorno al sistema nervoso centrale (SNC)^1,2. Oltre a dare galleggiabilità al cervello o assorbire forze meccaniche dannose, il liquido cerebrospinale svolge anche un ruolo fondamentale nella rimozione dei rifiuti metabolici dal ^SNC3. La rimozione dei rifiuti è facilitata dal sistema glinfatico recentemente caratterizzato che consente il flusso convettivo del liquido cerebrospinale attraverso il parenchima cerebrale attraverso gli spazi perivascolari (PVS), che circondano le arterie penetranti3,4,5. Questo processo ha dimostrato di dipendere dall'acquaporina-4 (AQP4), un canale d'acqua espresso principalmente sul fondo astrocitico, legato al ^PVS4,6. Lo studio del sistema glinfatico è ottenuto sia mediante imaging in vivo che ex vivo, utilizzando la microscopia ottica avanzata o la risonanza magnetica (MRI), a seguito dell'introduzione di un tracciante fluorescente / radioattivo o di un agente di contrasto nel CSF7,8,9,10,11.

Un modo efficace per introdurre un tracciante nel liquido cerebrospinale senza incorrere in danni al parenchima cerebrale è attraverso la cisterna magna cannulation (CMc)^12,13. Una grande maggioranza di tutti gli studi glinfatici, finora sono stati condotti su roditori ed evitati nei mammiferi superiori a causa dell'invasività del CMc unita alla semplicità pratica di lavorare con un piccolo mammifero. Inoltre, i crani sottili dei topi consentono l'imaging in vivo senza la necessità di una finestra cranica e successivamente consentono un'estrazione cerebrale ^{semplice11,14}. Esperimenti condotti sull'uomo hanno prodotto preziosi dati macroscopici in vivo sulla funzione glinfatica, ma si sono basati su iniezioni intratecali di traccianti nella colonna lombare distale e, inoltre, utilizzano la risonanza magnetica che non produce una risoluzione sufficiente per catturare la microanatomia del sistema glinfatico7,15,16 . Comprendere l'architettura e l'estensione del sistema glinfatico nei mammiferi superiori è essenziale per la sua traduzione verso l'uomo. Al fine di facilitare la traduzione glinfatica all'uomo, è importante applicare tecniche che vengono eseguite nei roditori ai mammiferi superiori in modo da consentire confronti diretti del sistema glinfatico tra specie di crescente cognizione e complessità ^cerebrale17. Il cervello dei suini e quello umano sono ginencefalici, in possesso di una neuroarchitettura piegata, mentre i cervelli dei roditori sono lissencefalici, avendo così una differenza sostanziale tra loro. In termini di dimensioni complessive, i cervelli di maiale sono, anche, più paragonabili agli esseri umani, essendo 10-15 volte più piccoli del cervello umano, mentre i cervelli di topo sono 3.000 volte più ^piccoli18. Comprendendo meglio il sistema glinfatico nei grandi mammiferi, potrebbe essere possibile utilizzare il sistema glinfatico umano per futuri interventi terapeutici in condizioni come ictus, lesioni cerebrali traumatiche e neurodegenerazione. Il CMc diretto nei suini in vivo è un metodo che consente la microscopia ottica ad alta risoluzione del sistema glinfatico in un mammifero superiore. Inoltre, a causa delle dimensioni dei suini utilizzati, è possibile applicare sistemi di monitoraggio simili a quelli utilizzati negli interventi chirurgici umani rendendo possibile documentare e regolare strettamente le funzioni vitali al fine di valutare come queste contribuiscano alla funzione glinfatica.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE e sono state approvate dal comitato etico per la ricerca animale di Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) e condotte secondo le linee guida CODEX del Consiglio svedese della ricerca.

1. Preparazione

1. Tracciante
   1. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM glucosio, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
   2. A 500 μL di liquido cerebrospinale artificiale, aggiungere 10 mg di albumina da siero bovino (BSA) coniugato con Alexa Fluor 647 (BSA-647).
   3. Centrifugare a 5.000 x g per 5 min e utilizzare il surnatante.
2. Cannula
   1. Collegare una siringa da 1 mL alla connessione Luer femmina della linea endovenosa (IV), rubinetto a 3 vie con estensione di 10 cm.
   2. Attaccare un ago da 18 G all'estremità maschile.
   3. Aprire il blocco di arresto a 3 vie per consentire la continuità dall'ago alla siringa.
   4. Sfoderare con cautela l'ago e aspirare circa 300 μL della soluzione salina nella linea IV.
   5. Rimuovere l'ago dalla soluzione salina e procedere all'introduzione in un po' d'aria per creare una piccola bolla d'aria (5-10 mm) nella linea IV.
   6. Posizionare l'ago nel tracciante e aspirare tutti i 500 μL del tracciante. La soluzione salina nella linea IV deve essere visibilmente separata da una bolla d'aria.
   7. Scartare l'ago e chiudere il blocco di arresto a 3 vie.
3. Animale
   1. Sedare un suino mediante iniezione intramuscolare (i.m.) di tiletamina (3,75 mg/kg) e zolazepam (3,75 mg/kg) e dexmedetomidina (37,5 μg/kg). Aspetta che diventi incosciente.
   2. Preparare una linea endovenosa inserendo una cannula da 20 G nella vena dell'orecchio.
      NOTA: Assicurarsi che la cannula sia in vena iniettando 5-10 ml di soluzione salina attraverso la cannula. Se la vena è stata persa, questo sarà evidente da un piccolo edema nel tessuto dell'orecchio.
   3. Intubare il maiale per garantire che la frequenza respiratoria possa essere regolata durante l'intervento chirurgico.
      NOTA: Garantire il successo dell'intubazione esercitando una pressione sul torace del maiale e confermare che l'aria forzatamente scaduta sta uscendo dal tubo di intubazione.
   4. Collegare il tubo di intubazione a un ventilatore impostato su una frequenza respiratoria di 14 respiri / min.
   5. Collegare un pulsossimetro e un bracciale alla coda per monitorare la frequenza cardiaca (HR), la pressione sanguigna (BP) e la saturazione di ossigeno (sats). Inserire un termometro rettale per monitorare la temperatura interna.
   6. Preparare un sacchetto per flebo di ketamina (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) e fentanil (2,5 μg/kg/min), in soluzione salina e iniziare a infondere attraverso la vena dell'orecchio a circa 2 gocce/s.
      NOTA: Durante l'intervento chirurgico, potrebbe essere necessario aumentare o diminuire la velocità di infusione in base ai parametri vitali dell'animale.
   7. Con il maiale in posizione prona, palpare la parte posteriore della testa e del collo dell'animale per individuare e contrassegnare la cresta occipitale e la colonna vertebrale delle prime vertebre toraciche e la base di ciascun orecchio.
   8. Disegna una linea retta tra la cresta e le vertebre lungo l'asse longitudinale. Disegna due linee dalla cresta alla base di ciascun orecchio seguendo la base del cranio (Figura 1A).
   9. Controlla che l'animale sia in un sonno profondo bloccando attentamente la coda e osservando l'assenza di un riflesso della coda.
      NOTA: se l'animale è ancora riflessivo, la velocità di infusione dell'anestetico deve essere aumentata in modo incrementale fino a quando l'animale non presenta più un riflesso.

2. Chirurgia

NOTA: Durante tutto l'intervento chirurgico, è necessario avere almeno un assistente per aspirare il sanguinamento leggero e cauterizzare eventuali vasi recisi.

1. Usando un bisturi con una lama # 21, fai un'incisione dermica lungo la linea longitudinale fino al muscolo.
2. Estendere due incisioni dermiche perpendicolari più avanti lungo le spalle, lunghe 10-15 cm.
3. Dalle creste occipitali, fare incisioni dermiche lungo la linea fino alla base di ciascun orecchio.
4. Afferrando gli angoli della pelle formati sulla cresta occipitale con una pinza anatomica, separare accuratamente la pelle dal muscolo sottostante facendo scorrere leggermente la lama del bisturi sulla fascia, passando dal rostrale al caudale. Una volta che la pelle è stata resecata dopo ciascuna delle cinque incisioni, parti dei muscoli trapezio dovrebbero essere visibili.
5. Fare un'incisione longitudinale con il bisturi, profondo circa 1 cm, dove il trapezio si riunisce sulla linea mediana.
   NOTA: Quando si tagliano i muscoli, c'è una maggiore propensione al sanguinamento, quindi il cauterizzatore deve essere pronto. Se una nave più grande viene recisa, una persona dovrebbe comprimerla rapidamente con la garza, mentre l'altra persona usa il cauterizzatore.
6. Utilizzando una combinazione di pinze chirurgiche dritte e curve, eseguire una dissezione smussata lavorando lungo il taglio longitudinale nei muscoli. Questo separerà le pance del trapezio, così come il muscolo semispinalis capitus biventer sottostante.
7. Tagliare tutte le fibre muscolari persistenti con un bisturi e continuare la dissezione smussata fino a quando semispinalis capitus complexus diventa visibile.
8. Sever le origini dei muscoli trapezio e semispinalis capitus biventer lungo l'aspetto posteriore del cranio. Separarli con cura longitudinalmente con il bisturi eseguendo una dissezione smussata fino a quando il semispinalis capitus complexus è completamente visibile.
9. Ritrarre i muscoli trapezio e semispinalis capitus biventer usando divaricatori auto-tratteninti.
10. Dove le pance del semispinalis capitus complexus si uniscono nella linea mediana, fare un'incisione longitudinale con il bisturi profondo circa 1 cm.
    NOTA: Essere consapevoli di eventuali ulteriori sanguinamenti qui. Il sanguinamento può essere gestito utilizzando una combinazione di tamponi di cotone e cauterizzazione.
11. Utilizzando una pinza chirurgica, eseguire una dissezione smussata lavorando lungo il taglio longitudinale tra le pance muscolari fino a quando l'aspetto dorsale dell'atlante (CI) è palpabile.
12. Separare le origini dei muscoli semispinalis capitus complexus lungo l'aspetto posteriore del cranio e separarlo longitudinalmente dalle vertebre sottostanti mediante bisturi e dissezione smussata.
13. Ritrarre i muscoli semispinalis capitus complexus usando un altro set di riavvolgitori auto-trattenitori.
14. Usando un bisturi, rimuovere con cura il tessuto rimanente sovrastante la regione in cui l'atlante incontra la base del cranio.
15. Posizionando un braccio sotto il collo dell'animale e un dito nella congiuntura dell'atlante e del cranio, solleva contemporaneamente la testa e fletti il collo mentre palpa con il dito per rivelare la cisterna magna usando l'altra mano.
    NOTA: La cisterna magna è riconoscibile quando palpa come una forte struttura elastica con una piccola quantità di rimbalzo quando la pressione viene rilasciata con il dito.

3. Cannulazione e iniezione

NOTA: Anche questo passaggio richiede almeno due persone e viene eseguito con la testa dell'animale sollevata e il collo flesso.

1. Assicurarsi che una persona elevi e fletti la testa e il collo dell'animale mentre l'altra palpa per la cisterna magna prendendo nota della sua posizione anatomica.
2. Introdurre lentamente e con attenzione una cannula da 22 G attraverso la dura e nella cisterna magna ad angolo obliquo rispetto all'asse longitudinale.
   NOTA: Non inserire la cannula troppo in profondità, in quanto ciò potrebbe causare danni al cervello. Sapere fino a che punto inserire la cannula viene con l'esperienza nel capire come ci si sente per la cannula perforare la dura. In sostanza, proprio come la dura è stata forata, la cannula è abbastanza profonda per un'iniezione tracciante di successo. Questa profondità è di circa 3-5 mm, ma differirà in base alle dimensioni o all'età dell'animale. Il successo della cannulazione dovrebbe essere immediatamente evidente attraverso la visualizzazione di un liquido cerebrospinale chiaro e pulsatile che sale sulla cannula. Per il miglior risultato, si raccomanda di praticare diverse cannulazioni in anticipo negli animali eutanasizzati per ottenere la comprensione del piercing durale.
3. Ritrarre l'ago dalla cannula e posizionare un cappuccio sulla serratura.
4. In primo luogo, applicare la supercolla e un acceleratore in cui la cannula entra nel tessuto, seguita dall'applicazione del cemento dentale. Attendere 5 minuti affinché il cemento si indurisca.
5. Rimuovere con cura il cappuccio dalla cannula e fissare alla cannula l'estremità maschio del rubinetto della linea IV precedentemente preparato con estensione di 10 cm, con il tracciante.
6. Iniettare lentamente il tracciante a mano o utilizzando una micropompa per infusione ad una velocità di 100 μL/min. Rimuovere il rubinetto della linea IV a 3 vie con estensione di 10 cm e sostituirlo con il cappuccio. Il tracciante dovrebbe ora essere visibile pulsante alla base della cannula (Video supplementare 1).
   NOTA: Se si inietta a mano, farlo fino a quando il tracciante è ancora visibile nell'albero della cannula, circa 1-2 mm sopra dove il cemento dentale copre l'albero.
7. Dopo l'iniezione, posizionare sacchi di sabbia sotto il collo per mantenere una certa flessione. La testa può quindi essere rilasciata e l'animale viene lasciato in posizione prona a riposo.
8. Rilascia i riavvolgitori auto-trattenitori e posiziona i muscoli come giacevano prima. Riunire la pelle sui muscoli usando morsetti chirurgici per asciugamani.
9. Coprire i morsetti per asciugamani e l'incisione con una garza e poi una coperta per limitare la perdita di calore.
10. Lasciare circolare il tracciante per il tempo desiderato prima dell'eutanasia dell'animale per via endovenosa. Iniezione di pentobarbital (140 mg/kg). Confermare l'eutanasia dall'assenza di suoni cardiaci dopo l'auscultazione con uno stetoscopio.

4. Estrazione ed elaborazione del cervello

1. Utilizzando un bisturi con 20 lame, estendere l'incisione dermica longitudinale dalla cresta occipitale a circa 7 cm sopra il naso.
2. Riflettere la pelle sovrastante l'aspetto dorsale del cranio usando il bisturi.
   NOTA: Esistono diversi modi per tagliare e rimuovere l'aspetto dorsale del cranio di maiale su base animale per animale. Quello che segue è la procedura che ha funzionato più spesso per questo esperimento.
3. Usando una sega compatta portatile, fai un taglio coronale nel cranio, circa 3 cm sopra le due grandi vene viste uscire dal cranio. Estendi a due ulteriori tagli verticali dai tagli coronali e altri due tagli ulteriori per riunire i tagli verticali nella linea mediana.
   NOTA: Mantenere una presa salda della sega quando si effettuano i tagli ossei del cranio in quanto tenderà a tirarsi via al primo contatto con l'osso o il tessuto, che può portare a gravi lesioni.
4. Assicurarsi che i tagli del cranio attraversino l'intero spessore dell'osso seguendo con un martello e uno scalpello stretto (10 mm) a ciascuno dei tagli.
5. Usando il martello, infine, colpisci uno scalpello largo (25-30 mm) nel taglio coronale. Con una persona che sostiene la testa, assicurati che l'altra persona applichi la leva sullo scalpello per aprire il cranio dorsale.
6. Una volta rimosso il frammento del cranio dorsale, sezionare la dura madre sovrastante usando forbici chirurgiche curve.
7. Utilizzare una spatola per separare il midollo spinale dal cervelletto all'aspetto rostrale. Quindi procedere a guidare la spatola sotto il cervello dalla parte anteriore, recidendo i bulbi olfattivi, la ghiandola pituitaria e i nervi cranici.
8. Posizionare la spatola dietro il cervelletto e applicare una discreta quantità di pressione per rimuovere il cervello dalla cavità cranica, sollevandolo con cura una volta sciolto.
9. Fissare immediatamente l'intero cervello mediante immersione tissutale in paraformaldeide al 4% durante la notte.
   NOTA: Dopo questo passaggio, è possibile eseguire l'intera immagine cerebrale utilizzando uno stereoscopio (Figura 1E).
10. Il giorno dopo, prepara fette coronali del cervello usando un coltello da salmone e fissa le fette durante la notte mediante immersione tissutale in paraformaldeide al 4%.
11. Infine, posizionare le fette in azide allo 0,01% in PBS per la conservazione a lungo termine.

Risultati

Una volta che il maiale è incosciente, viene palpato e la sua anatomia superficiale è segnata, a partire dalla cresta occipitale (OC) e lavorando verso le vertebre toraciche (TV) e ogni base auricolare (EB). È lungo queste linee che vengono fatte le incisioni dermiche (Figura 1A). I tre strati muscolari trapezio, semispinalis capitus biventer e semispinalis capitus complexus sono resecati e tenuti aperti da due serie di riavvolgitori auto-trattenibili per esporre la cisterna magna (CM) (<...

Discussione

Qui, è descritto, un protocollo dettagliato per eseguire la cannulazione diretta della cisterna magna nei suini, compresa la preparazione necessaria, la procedura chirurgica, l'infusione del tracciante e l'estrazione del cervello. Ciò richiede qualcuno con esperienza e certificazione per lavorare con animali di grandi dimensioni. Se eseguito correttamente, ciò consente la consegna delle molecole desiderate con certezza direttamente nel liquido cerebrospinale, dopo di che una serie di diverse modalità avanzate di imag...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA