Direkte Kanülenimplantation in der Cisterna Magna der Schweine

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die direkte Kanülenimplantation in die Cisterna magna von Schweinen vor.

Zusammenfassung

Das glymphatische System ist ein Abfallclearing-System im Gehirn, das auf dem Fluss von Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in Astrozyten-gebundenen perivaskulären Räumen beruht und an der Clearance von neurotoxischen Peptiden wie Amyloid-Beta beteiligt ist. Eine beeinträchtigte glymphatische Funktion verschlimmert die Krankheitspathologie in Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, was die Bedeutung des Verständnisses dieses Clearance-Systems unterstreicht. Das glymphatische System wird oft durch Cisterna magna Cannulationen (CMc) untersucht, bei denen Tracer direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) abgegeben werden. Die meisten Studien wurden jedoch an Nagetieren durchgeführt. Hier demonstrieren wir eine Adaption der CMc-Technik bei Schweinen. Mit CMc in Schweinen kann das glymphatische System mit einer hohen optischen Auflösung in gyrenzephalen Gehirnen untersucht werden und schließt so die Wissenslücke zwischen Nagetieren und menschlichen Glymphatika.

Einleitung

Liquor cerebrospinalis (CSF) ist ein Ultrafiltrat von Blut, das innerhalb und um das zentrale Nervensystem (ZNS) gefunden ^wird1,2. Abgesehen davon, dass es dem Gehirn Auftrieb verleiht oder schädliche mechanische Kräfte absorbiert, spielt CSF auch eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung von Stoffwechselabfällen aus dem ^ZNS3. Die Abfallentsorgung wird durch das kürzlich charakterisierte glymphatische System erleichtert, das den konvektiven Fluss von CSF durch das Hirnparenchym über perivaskuläre Räume (PVS) ermöglicht, die durchdringende Arterien ^umgeben3,4,5. Es wurde gezeigt, dass dieser Prozess von Aquaporin-4 (AQP4) abhängig ist, einem Wasserkanal, der hauptsächlich auf den astrozytären Endfüßen exprimiert wird und an das ^PVS4,6 gebunden ist. Die Untersuchung des glymphatischen Systems wird sowohl durch In-vivo- als auch durch Ex-vivo-Bildgebung erreicht, entweder unter Verwendung fortgeschrittener Lichtmikroskopie oder Magnetresonanztomographie (MRT), nachdem ein fluoreszierender/radioaktiver Tracer oder ein Kontrastmittel in das CSF7,8,9,10,11 eingeführt wurde.

Eine effektive Möglichkeit, einen Tracer in das Liquor einzuführen, ohne das Parenchym des Gehirns zu schädigen, ist die Cisterna Magna Cannulation (CMc)^12,13. Eine große Mehrheit aller glymphatischen Studien wurde bisher an Nagetieren durchgeführt und bei höheren Säugetieren wegen der Invasivität von CMc in Verbindung mit der praktischen Einfachheit der Arbeit mit einem kleinen Säugetier vermieden. Darüber hinaus erlauben die dünnen Schädel von Mäusen eine In-vivo-Bildgebung ohne Schädelfenster und ermöglichen anschließend eine unkomplizierte ^{Hirnextraktion11,14}. Experimente, die am Menschen durchgeführt wurden, haben wertvolle makroskopische In-vivo-Daten über die glymphatische Funktion ergeben, stützten sich jedoch auf intrathekale Tracer-Injektionen in die distale Lendenwirbelsäule und verwendeten darüber hinaus MRT, die keine ausreichende Auflösung liefert, um die Mikroanatomie des glymphatischen Systems zu erfassen7,15,16 . Das Verständnis der Architektur und des Ausmaßes des glymphatischen Systems bei höheren Säugetieren ist für seine Übertragung auf den Menschen unerlässlich. Um die glymphatische Translation auf den Menschen zu erleichtern, ist es wichtig, Techniken, die bei Nagetieren durchgeführt werden, auf höhere Säugetiere anzuwenden, um direkte Vergleiche des glymphatischen Systems zwischen Arten mit zunehmender Kognitions- und Gehirnkomplexität zu ^{ermöglichen17}. Schweine- und menschliche Gehirne sind gyrenzephal und besitzen eine gefaltete Neuroarchitektur, während Nagetiergehirne lissenzephal sind und dadurch erhebliche Unterschiede zueinander aufweisen. In Bezug auf die Gesamtgröße sind Schweinegehirne auch eher mit Menschen vergleichbar, da sie 10-15 Mal kleiner sind als das menschliche Gehirn, während Mausgehirne 3.000 Mal kleiner ^sind18. Durch ein besseres Verständnis des glymphatischen Systems bei großen Säugetieren könnte es möglich sein, das menschliche glymphatische System für zukünftige therapeutische Interventionen bei Erkrankungen wie Schlaganfall, Schädel-Hirn-Trauma und Neurodegeneration zu nutzen. Direct CMc in Pigs in vivo ist eine Methode, die die hochauflösende Lichtmikroskopie des glymphatischen Systems bei einem höheren Säugetier ermöglicht. Darüber hinaus ist es aufgrund der Größe der verwendeten Schweine möglich, Überwachungssysteme anzuwenden, die denen in menschlichen Operationen ähneln, so dass es möglich ist, Vitalfunktionen streng zu dokumentieren und zu regulieren, um zu beurteilen, wie diese zur glymphatischen Funktion beitragen.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt und vom Malmö-Lund Ethikausschuss für Tierversuche (Dnr 5.8.18-05527/2019) genehmigt und gemäß den CODEX-Richtlinien des schwedischen Forschungsrats durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Tracer
   1. Künstliches LIQUOR herstellen (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM Glucose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
   2. Zu 500 μL künstlichem CSF werden 10 mg Albumin aus Rinderserum (BSA) hinzugefügt, das mit Alexa Fluor 647 (BSA-647) konjugiert ist.
   3. Zentrifugiere bei 5.000 x g für 5 min und benutze den Überstand.
2. Kanüle
   1. Befestigen Sie eine 1 mL Spritze an der Luer-Buchse der intravenösen (IV) Leitung, 3-Wege-Hahn mit 10 cm Verlängerung.
   2. Befestigen Sie eine 18 G Nadel am männlichen Ende.
   3. Öffnen Sie die 3-Wege-Stoppsperre, um eine Kontinuität von der Nadel bis zur Spritze zu ermöglichen.
   4. Vorsichtig die Nadel abziehen und ca. 300 μL der Kochsalzlösung in die IV-Leitung absaugen.
   5. Entfernen Sie die Nadel von der Kochsalzlösung und führen Sie etwas Luft ein, um eine kleine Luftblase (5-10 mm) in der IV-Linie zu erzeugen.
   6. Legen Sie die Nadel in den Tracer und aspirieren Sie alle 500 μL des Tracers. Die Kochsalzlösung in der IV-Leitung sollte durch eine Luftblase sichtbar getrennt sein.
   7. Entsorgen Sie die Nadel und schließen Sie die 3-Wege-Stoppsperre.
3. Tier
   1. Sedieren Sie ein Schwein durch intramuskuläre (i.m.) Injektion von Tiletamin (3,75 mg/kg) und Zolazepam (3,75 mg/kg) und Dexmedetomidin (37,5 μg/kg). Warten Sie, bis es bewusstlos wird.
   2. Bereiten Sie eine intravenöse Leitung vor, indem Sie eine 20 G-Kanüle in die Ohrvene einführen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Kanüle in der Vene befindet, indem Sie 5-10 ml Kochsalzlösung durch die Kanüle injizieren. Wenn die Vene übersehen wurde, macht sich dies durch kleine Ödeme im Ohrgewebe bemerkbar.
   3. Intubieren Sie das Schwein, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz während der gesamten Operation reguliert werden kann.
      HINWEIS: Stellen Sie eine erfolgreiche Intubation sicher, indem Sie Druck auf den Brustkorb des Schweins ausüben und bestätigen, dass gewaltsam ausgelaufene Luft aus dem Intubationsrohr austritt.
   4. Befestigen Sie den Intubationsschlauch an einem Beatmungsgerät mit einer Atemfrequenz von 14 Atemzügen/min.
   5. Schließen Sie ein Pulsoximeter und eine Manschette an den Schwanz an, um die Herzfrequenz (HR), den Blutdruck (BP) und die Sauerstoffsättigung (Sats) zu überwachen. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Kerntemperatur zu überwachen.
   6. Bereiten Sie einen IV-Beutel mit Ketamin (5 mg / kg / min), Midazolam (0,25 mg / kg / min) und Fentanyl (2,5 μg / kg / min) in Kochsalzlösung vor und beginnen Sie mit etwa 2 Tropfen / s durch die Ohrvene zu infundieren.
      HINWEIS: Während der gesamten Operation muss die Infusionsrate möglicherweise erhöht oder verringert werden, basierend auf den Vitalwerten des Tieres.
   7. Tasten Sie mit dem Schwein in Bauchlage den Hinterkopf und den Nacken des Tieres ab, um den Hinterhauptkamm und die Wirbelsäule der ersten Brustwirbel und die Basis jedes Ohrs zu lokalisieren und zu markieren.
   8. Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen dem Kamm und den Wirbeln entlang der Längsachse. Zeichnen Sie zwei Linien vom Kamm bis zur Basis jedes Ohres, indem Sie der Schädelbasis folgen (Abbildung 1A).
   9. Überprüfen Sie, ob sich das Tier in einem tiefen Schlaf befindet, indem Sie den Schwanz vorsichtig festklemmen und auf das Fehlen eines Schwanzreflexes achten.
      HINWEIS: Wenn das Tier immer noch reflexiv ist, sollte die Anästhesie-Infusionsrate schrittweise erhöht werden, bis das Tier keinen Reflex mehr zeigt.

2. Chirurgie

HINWEIS: Während der gesamten Operation ist es notwendig, mindestens einen Assistenten zu haben, um die leichten Blutungen abzusaugen und alle durchtrennten Gefäße zu kauterisieren.

1. Verwenden Sie ein Skalpell mit einer # 21-Klinge, machen Sie einen dermalen Schnitt entlang der Längslinie bis zum Muskel.
2. Strecken Sie zwei senkrechte hautnahe Schnitte weiter entlang der Schultern aus, 10-15 cm lang.
3. Machen Sie von den Okzipitalkämmen dermale Einschnitte entlang der Linie bis zur Basis jedes Ohres.
4. Wenn Sie die am Hinterhauptkamm gebildeten Hautecken mit einer anatomischen Pinzette greifen, trennen Sie die Haut vorsichtig vom darunter liegenden Muskel, indem Sie die Skalpellklinge leicht über die Faszie führen und sich vom Rostral zum Schwanz bewegen. Sobald die Haut nach jedem der fünf Schnitte reseziert wurde, sollten Teile der Trapezmuskeln sichtbar sein.
5. Machen Sie einen Längsschnitt mit dem Skalpell, etwa 1 cm tief, wo der Trapezius an der Mittellinie zusammenkommt.
   HINWEIS: Beim Durchschneiden der Muskeln besteht eine erhöhte Blutungsneigung, daher sollte der Kauterizer bereit sein. Wenn ein größeres Gefäß durchtrennt wird, sollte eine Person es schnell mit der Gaze komprimieren, während die andere Person den Kauterizer verwendet.
6. Führen Sie mit einer Kombination aus gerader und gekrümmter chirurgischer Pinzette eine stumpfe Dissektion entlang des Längsschnitts in den Muskeln durch. Dies trennt die Bäuche des Trapezius sowie den darunter liegenden Musculus semispinalis capitus biventer.
7. Trennen Sie alle verbleibenden Muskelfasern mit einem Skalpell und setzen Sie die stumpfe Dissektion fort, bis Semispinalis capitus complexus sichtbar wird.
8. Trennen Sie die Ursprünge der Musculi trapezius und semispinalis capitus biventer entlang des hinteren Aspekts des Schädels. Trennen Sie sie vorsichtig in Längsrichtung mit dem Skalpell, das eine stumpfe Dissektion durchführt, bis der Semispinalis capitus complexus vollständig sichtbar ist.
9. Ziehen Sie die Musculus trapezius und semispinalis capitus biventer mit selbsterhaltenden Retraktoren ein.
10. Wo die Bäuche des Semispinalis capitus complexus in der Mittellinie zusammenkommen, machen Sie einen Längsschnitt mit dem Skalpell etwa 1 cm tief.
    HINWEIS: Achten Sie hier auf zusätzliche Blutungen. Blutungen können mit einer Kombination aus Wattestäbchen und Kauterisation behandelt werden.
11. Führen Sie mit einer chirurgischen Pinzette eine stumpfe Dissektion durch, die entlang des Längsschnitts zwischen den Muskelbäuchen arbeitet, bis der dorsale Aspekt des Atlas (CI) tastbar ist.
12. Trennen Sie die Ursprünge der Muskeln semispinalis capitus complexus entlang des hinteren Aspekts des Schädels und trennen Sie ihn längs von den darunter liegenden Wirbeln durch Skalpell und stumpfe Dissektion.
13. Ziehen Sie die Muskeln semispinalis capitus complexus mit einem anderen Satz selbsterhaltender Retraktoren zurück.
14. Entfernen Sie mit einem Skalpell vorsichtig das verbleibende Gewebe, das über der Region liegt, in der der Atlas auf die Schädelbasis trifft.
15. Legen Sie einen Arm unter den Hals des Tieres und einen Finger an der Schnittstelle von Atlas und Schädel, heben Sie gleichzeitig den Kopf an und beugen Sie den Hals, während Sie mit dem Finger tasten, um die Cisterna magna mit der anderen Hand zu enthüllen.
    HINWEIS: Die Cisterna magna ist beim Abtasten als starke elastische Struktur mit einem geringen Rückprall erkennbar, wenn der Druck mit dem Finger freigesetzt wird.

3. Kanülierung und Injektion

HINWEIS: Dieser Schritt erfordert auch mindestens zwei Personen und wird mit erhöhtem Kopf des Tieres und gebeugtem Hals durchgeführt.

1. Stellen Sie sicher, dass eine Person den Kopf und den Hals des Tieres anhebt und beugt, während die andere person für die Cisterna magna palpiert und sich ihre anatomische Lage notiert.
2. Langsam und vorsichtig eine 22 G Kanüle durch die Dura und in die Cisterna magna in einem schrägen Winkel zur Längsachse einführen.
   HINWEIS: Führen Sie die Kanüle nicht zu tief ein, da dies das Gehirn schädigen kann. Zu wissen, wie weit die Kanüle eingeführt werden muss, kommt mit der Erfahrung, zu verstehen, wie es sich für die Kanüle anfühlt, die Dura zu durchbohren. Im Wesentlichen, so wie die Dura durchstochen wurde, ist die Kanüle dann tief genug für eine erfolgreiche Tracer-Injektion. Diese Tiefe beträgt ca. 3-5 mm, unterscheidet sich jedoch je nach Größe oder Alter des Tieres. Eine erfolgreiche Kanülierung sollte sofort durch die Visualisierung von klarem, pulsierendem Liquor, der die Kanüle hinaufsteigt, offensichtlich sein. Für das beste Ergebnis wird empfohlen, bei eingeschläferten Tieren vorher mehrere Kanülen zu üben, um das Duralpiercing zu verstehen.
3. Ziehen Sie die Nadel von der Kanüle zurück und setzen Sie eine Kappe auf das Schloss.
4. Wenden Sie zuerst Sekundenkleber und einen Beschleuniger an, wo die Kanüle in das Gewebe eindringt, gefolgt von der Anwendung des Zahnzements. Warten Sie 5 Minuten, bis der Zement ausgehärtet ist.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe von der Kanüle und befestigen Sie das männliche Ende des zuvor vorbereiteten IV-Leinenhahns mit 10 cm Verlängerung mit dem Tracer an der Kanüle.
6. Injizieren Sie den Tracer langsam von Hand oder mit einer Mikroinfusionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 100 μL/min. Entfernen Sie den 3-Wege-IV-Line-Hahn mit 10 cm Verlängerung und ersetzen Sie ihn durch die Kappe. Tracer sollte nun an der Basis der Kanüle pulsierend sichtbar sein (Ergänzungsvideo 1).
   HINWEIS: Wenn Sie von Hand injizieren, tun Sie dies, bis der Tracer noch im Kanülenschaft sichtbar ist, etwa 1-2 mm über der Stelle, an der der Zahnzement den Schaft bedeckt.
7. Legen Sie nach der Injektion Sandsäcke unter den Hals, um eine gewisse Beugung zu erhalten. Der Kopf kann dann losgelassen werden, und das Tier wird in einer ruhenden Bauchlage gelassen.
8. Lassen Sie die selbsthaltenden Retraktoren los und platzieren Sie die Muskeln so, wie sie vorher lagen. Bringen Sie die Haut mit chirurgischen Handtuchklemmen über die Muskeln zusammen.
9. Decken Sie Handtuchklemmen und Schnitt mit Gaze und dann einer Decke ab, um den Wärmeverlust zu begrenzen.
10. Lassen Sie den Tracer für die gewünschte Zeit zirkulieren, bevor Sie das Tier per i.v. einschläfern. Pentobarbital-Injektion (140 mg/kg). Bestätigen Sie die Euthanasie durch das Fehlen von Herztönen bei der Auskultation mit einem Stethoskop.

4. Extraktion und Verarbeitung des Gehirns

1. Verlängern Sie mit einem Skalpell mit 20 Klingen den longitudinalen Hautschnitt vom Hinterhauptkamm bis etwa 7 cm über der Nase.
2. Reflektieren Sie die Haut über dem dorsalen Aspekt des Schädels mit dem Skalpell.
   HINWEIS: Es gibt mehrere Möglichkeiten, den dorsalen Aspekt des Schweineschädels tierweise zu schneiden und zu entfernen. Was folgt, ist das Verfahren, das für dieses Experiment am häufigsten funktioniert hat.
3. Machen Sie mit einer Handsäge einen koronalen Schnitt in den Schädel, etwa 3 cm über den beiden großen Venen, die aus dem Schädel austreten. Erweitern Sie zwei weitere vertikale Schnitte von den koronalen Schnitten und zwei weitere Schnitte, um die vertikalen Schnitte in der Mittellinie zusammenzubringen.
   HINWEIS: Behalten Sie einen festen Griff der Säge bei, wenn Sie den Schädelknochen schneiden, da er beim ersten Kontakt mit dem Knochen oder Gewebe dazu neigt, sich wegzuziehen, was zu einer schweren Verletzung führen kann.
4. Stellen Sie sicher, dass die Schädelschnitte die gesamte Knochendicke durchgehen, indem Sie mit einem Hammer und einem schmalen Meißel (10 mm) zu jedem der Schnitte folgen.
5. Schlagen Sie mit dem Hammer schließlich einen breiten Meißel (25-30 mm) in den koronalen Schnitt. Wenn eine Person den Kopf stützt, stellen Sie sicher, dass die andere Person einen Hebel auf den Meißel ausübt, um den dorsalen Schädel zu öffnen.
6. Sobald das dorsale Schädelfragment entfernt wurde, sezieren Sie die darüber liegende Dura mater mit einer gekrümmten chirurgischen Schere.
7. Verwenden Sie einen Spatel, um das Rückenmark vom Kleinhirn am rostralen Aspekt zu durchtrennen. Dann fahren Sie fort, den Spatel unter dem Gehirn von vorne zu führen und die Riechkolben, die Hypophyse und die Hirnnerven zu durchtrennen.
8. Legen Sie den Spatel hinter das Kleinhirn und üben Sie einen angemessenen Druck aus, um das Gehirn aus der Schädelhöhle zu entfernen, und heben Sie es vorsichtig heraus, sobald es losgelassen ist.
9. Fixieren Sie sofort das gesamte Gehirn durch Eintauchen des Gewebes in 4% Paraformaldehyd über Nacht.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt ist es möglich, die Bildgebung des gesamten Gehirns mit einem Stereoskop durchzuführen (Abbildung 1E).
10. Machen Sie am nächsten Tag koronale Scheiben des Gehirns mit einem Lachsmesser und fixieren Sie die Scheiben über Nacht durch Eintauchen des Gewebes in 4% Paraformaldehyd.
11. Zum Schluss legen Sie die Scheiben in 0,01% Azid in PBS für die Langzeitlagerung.

Ergebnisse

Sobald das Schwein bewusstlos ist, wird es palpiert und seine Oberflächenanatomie wird markiert, beginnend am Hinterhauptkamm (OC) und in Richtung der Brustwirbel (TV) und jeder Ohrbasis (EB). In diesem Sinne werden die hautnahen Schnitte vorgenommen (Abbildung 1A). Die drei Muskelschichten, darunter Trapezius, Semispinalis capitus biventer und Semispinalis capitus complexus, werden von zwei Sätzen selbsthaltender Retraktoren reseziert und offen gehalten, um die Cisterna magna (CM) freizul...

Diskussion

Hierin wird ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der direkten Kanülierung der Cisterna magna bei Schweinen beschrieben, einschließlich der notwendigen Vorbereitung, des chirurgischen Eingriffs, der Tracerinfusion und der Extraktion des Gehirns. Dies erfordert jemanden mit Erfahrung und Zertifizierung für die Arbeit mit großen Tieren. Bei korrekter Durchführung ermöglicht dies die Abgabe der gewünschten Moleküle mit Sicherheit direkt in das Liquor, wonach eine Reihe verschiedener fortschrittlicher Lichtbi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA