השתלת צינורית ישירה ב"ציסטרנה מגנה של חזירים"

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב להשתלת צינורית ישירה בבור החזירים.

Abstract

מערכת גלימפטית היא מערכת פינוי פסולת במוח הנשענת על זרימת נוזל השדרתי (CSF) בחללי כלי דם הקשורים לאסטרוציטים, והיא הייתה מעורבת בסיווג של פפטידים נוירוטוקסיים כגון עמילואיד-בטא. תפקוד גלימפטי לקוי מחריף את הפתולוגיה של המחלה במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות, כגון אלצהיימר, המדגיש את החשיבות של הבנת מערכת סיווג זו. מערכת גלימפטית נחקרת לעתים קרובות על ידי cannulations מגנה בור (CMc), שבו מעקבים מועברים ישירות לתוך הנוזל השדרתי (CSF). עם זאת, רוב המחקרים בוצעו במכרסמים. כאן, אנו מדגימים הסתגלות של טכניקת CMC בחזירים. באמצעות CMc בחזירים, ניתן ללמוד את המערכת הגלימפטית ברזולוציה אופטית גבוהה במוחות גיראנצפליים ובכך מגשרת על פער הידע בין מכרסמים לגלימפטיקה אנושית.

Introduction

נוזל השדרתי (CSF) הוא אולטרה סינון של דם אשר נמצא בתוך ומסביב למערכת העצבים המרכזית (CNS)^1,2. מלבד מתן ציפה למוח או ספיגת כוחות מכניים מזיקים, CSF ממלא גם תפקיד מרכזי בניקוי פסולת מטבולית מה- ^CNS3. פינוי פסולת מתאפשר על ידי מערכת גלימפטית שאופיינה לאחרונה המאפשרת את זרימת הקונבקטיבית של CSF דרך פרנצ'ימה במוח דרך מרחבים perivascular (PVS), אשר סובבים עורקים חודרים3,4,5. תהליך זה הוכח כתלוי במים-4 (AQP4), תעלת מים המתבטאת בעיקר בקצה האסטרוציטי, הקשור ל- ^PVS4,6. המחקר של המערכת הגלימפטית מושגת הן על ידי דימות ויוו והן על ידי ex vivo, באמצעות מיקרוסקופיה אור מתקדמת או הדמיית תהודה מגנטית (MRI), לאחר כניסתו של מעקב פלואורסצנטי / רדיואקטיבי או סוכן ניגוד לתוך CSF7,8,9,10,11.

דרך יעילה להכניס מכשיר מעקב לתוך CSF מבלי לגרום נזק לפרנצ'ימה במוח היא באמצעות קנוניציה מגנה בור (CMc)^12,13. רוב גדול של כל המחקרים הגלימפטיים, עד כה בוצעו במכרסמים ונמנעו ביונקים גבוהים יותר בגלל הפולשניות של CMc בשילוב עם הפשטות המעשית של עבודה עם יונק קטן. בנוסף, גולגולות דקות של עכברים מאפשרות הדמיית ויוו ללא צורך בחלון גולגולת ולאחר מכן מאפשרות חילוץ מוח לא ^{מסובך11,14}. ניסויים שבוצעו בבני אדם הניבו נתונים מקרוסקופיים בעלי ערך ב-vivo על הפונקציה הגלימפטית, אך הסתמכו על זריקות מעקב תוך-אט-תיא-צילומי בעמוד השדרה המותני הדיסטלי, יתר על כן, משתמשים ב-MRI שאינו מניב רזולוציה מספקת כדי ללכוד את המיקרואנטומיה של המערכת הגלימפטית7,15,16 . הבנת הארכיטקטורה והיקף המערכת הגלימפטית ביונקים גבוהים יותר חיונית לתרגומה לבני אדם. על מנת להקל על תרגום גלימפטי לבני אדם, חשוב ליישם טכניקות המתבצעות במכרסמים ליונקים גבוהים יותר כדי לאפשר השוואות ישירות של המערכת הגלימפטית על פני מינים של קוגניציה גוברת ומורכבות ^המוח17. מוחות חזירים ואנושיים הם gyrencephalic, בעל נוירו-ארכיקטורה מקופלת, בעוד מוחות מכרסמים הם lissencephalic, ובכך יש הבדל משמעותי בין אחד לשני. במונחים של הגודל הכולל, מוחות חזירים דומים יותר לבני אדם, קטנים פי 10-15 מהמוח האנושי, בעוד מוחות העכבר קטנים פי 3,000 ^מ-18. על ידי הבנה טובה יותר של המערכת הגלימפטית ביונקים גדולים, ייתכן שניתן יהיה לנצל את המערכת הגלימפטית האנושית להתערבות טיפולית עתידית בתנאים כגון שבץ מוחי, פגיעה מוחית טראומטית ונוירו-דגנרציה. CMc ישיר בחזירים ב vivo היא שיטה המאפשרת מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה של מערכת גלימפטית ביונק גבוה יותר. יתר על כן, בשל גודל החזירים המשמשים, ניתן ליישם מערכות ניטור דומות לאלה המשמשות בניתוחים אנושיים מה שהופך אותו אפשרי לתעד ולווסת פונקציות חיוניות כדי להעריך כיצד אלה תורמים לתפקוד הגלימפטי.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להוראה האירופית 2010/63/האיחוד האירופי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של מאלמו-לונד לחקר בעלי חיים (Dnr 5.8.18-05527/2019) ונערך על פי הנחיות CODEX של מועצת המחקר השוודית.

1. הכנה

1. מעקב
   1. הכן CSF מלאכותי (126 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ _NaH2PO4, 2 מ"מ _MgCl2, 2 מ"מ _CaCl2, 10 מ"מ גלוקוז, 26 מ"ר NaHCO3; pH 7.4)
   2. כדי 500 μL של CSF מלאכותי, להוסיף 10 מ"ג אלבומין מסרום בקר (BSA) מצומד עם אלכסה פלור 647 (BSA-647).
   3. צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 5 דקות ולהשתמש supernatant.
2. קנולה
   1. צרף מזרק 1 מ"ל לחיבור Luer הנשי של קו תוך ורידי (IV), הקשה 3 דרכים עם הרחבה של 10 ס"מ.
   2. חבר מחט 18 G לקצה הגברי.
   3. פתח את מנעול העצירה ה-3 כיווני כדי לאפשר המשכיות מהמחט למזרק.
   4. בזהירות לפרוק את המחט ולשאף כ 300 μL של תמיסת מלח לתוך קו העירוי.
   5. הסר את המחט מן מלוחים ולהמשיך להציג קצת אוויר כדי ליצור בועת אוויר קטנה (5-10 מ"מ) בקו העירוי.
   6. מניחים את המחט לתוך העוקב ושאפו את כל 500 μL של העוקב. תמיסת מלח בקו העירוי צריכה להיות מופרדת באופן ניכר על ידי בועת אוויר.
   7. השלך את המחט ולסגור את מנעול עצירה 3-way.
3. בעל חיים
   1. יש להסתפיד על חזיר באמצעות הזרקה תוך שרירית (i.m.) של טילטמין (3.75 מ"ג/ק"ג) וזולאזפאם (3.75 מ"ג/ק"ג) ודקסדטומידין (37.5 מיקרוגרם/ק"ג). חכה שזה יהיה מחוסר הכרה.
   2. הכן קו תוך ורידי על ידי החדרת צינורית 20 גרם לתוך וריד האוזן.
      הערה: ודא כי הצינורית היא בווריד על ידי הזרקת 5-10 מ"ל של מלוחים דרך הצינורית. אם הווריד הוחמץ, זה יהיה מורגש על ידי בצקת קטנה ברקמת האוזן.
   3. צנרר את החזיר כדי להבטיח כי קצב הנשימה יכול להיות מוסדר לאורך כל הניתוח.
      הערה: ודא צנרור מוצלח על ידי הפעלת לחץ על בית החזה של החזיר ולאשר כי אוויר שפג תוקפו בכפייה יוצא מתוך צינור הצנרור.
   4. חברו את צינור הצנרור למכונת הנשמה שנקבעה לקצב נשימה של 14 נשימות/דקה.
   5. חבר אוקסימטר דופק ושרוול לזנב כדי לפקח על קצב הלב (HR), לחץ הדם (BP) ורוויה חמצן (ראט). הכנס מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת הליבה.
   6. הכן שקית IV של קטמין (5 מ"ג/ ק"ג / דקה), מידזולם (0.25 מ"ג / קילוגרם / דקה), ופנטניל (2.5 מיקרוגרם / קילוגרם / דקה), מלוחים ולהתחיל להחדיר דרך וריד האוזן בכ 2 טיפות / s.
      הערה: במהלך הניתוח, ייתכן שיהיה צורך להגדיל או להקטין את שיעור העירוי בהתבסס על האיברים החיוניים של החיה.
   7. עם החזיר בתנוחה נוטה, למשיק את החלק האחורי של הראש והצוואר של החיה כדי לאתר ולסמן את הסמל העורפי ואת עמוד השדרה של חוליות בית החזה הראשון ואת הבסיס של כל אוזן.
   8. צייר קו ישר בין הסמל לחוליות לאורך ציר האורך. ציירו שני קווים מהפסגה לבסיס של כל אוזן על-ידי ביצוע בסיס הגולגולת (איור 1A).
   9. בדוק כי החיה נמצאת בשינה עמוקה על ידי הידוק זהיר של הזנב וצפייה בהיעדר רפלקס זנב.
      הערה: אם החיה עדיין רפלקסיבית, יש להגדיל בהדרגה את קצב עירוי ההרדמה עד שבעל החיים כבר לא מציג רפלקס.

2. ניתוח

הערה: לאורך כל הניתוח, יש צורך לפחות עוזר אחד לשאיבה את הדימום הקל לצרוב כל כלי קטוע.

1. באמצעות אזמל עם להב # 21, לבצע זעזוע עורי לאורך קו האורך עד השריר.
2. להאריך שני חותכים עוריים מאונכים בהמשך הכתפיים, 10-15 ס"מ אורך.
3. מהפסגות העורפיות, לעשות חותכים עוריים לאורך הקו עד לבסיס של כל אוזן.
4. אחיזת פינות העור שנוצרו בפסגת העורף במלקחיים אנטומיים, מפרידה בזהירות את העור מהשריר שמתחתיו על ידי הפעלת להב האזמל בקלילות מעל הפאסיה, מעבר מהרוסטרל לקדנציה. לאחר שהעור נפלט בעקבות כל אחד מחמשת החתכים, חלקים משרירי הטרפז צריכים להיות גלויים.
5. בצע חתך אורך עם האזמל, בעומק של כ -1 ס"מ, שבו הטרפז מתאחד בקו האמצע.
   הערה: בעת חיתוך דרך השרירים, יש נטייה מוגברת לדימום, ולכן צובר צריך להיות מוכן. אם כלי גדול יותר מנותק, אדם אחד צריך לדחוס אותו במהירות עם גזה, בעוד האדם השני משתמש צרב.
6. באמצעות שילוב של מלקחיים כירורגיים ישרים ומעוקלים, לבצע ניתוח בוטה עובד לאורך החתך האורך בשרירים. זה יפריד את הבטן של הטרפז, כמו גם את שריר הדו-ונטיטר של הקפיטול למחצה.
7. נתק את כל סיבי השריר המתמשכים עם אזמל ולהמשיך ניתוח בוטה עד קומפלקס הקפיטול למחצה הופך גלוי.
8. נתק את מקורות הטרפז ושרירי הקפיטוס הדו-ונטיטר למחצה לאורך ההיבט האחורי של הגולגולת. בזהירות להפריד אותם אורך עם האזמל ביצוע ניתוח קהה עד קומפלקס הקפיטול למחצה גלוי לחלוטין.
9. לסגת טרפז ושרירי קפיטול קפיטול למחצה באמצעות מפסקים שמירה עצמית.
10. כאשר הבטן של קומפלקס הקפיטוס semispinalis לבוא יחד בקו האמצע, לעשות חתך אורך עם אזמל כ 1 ס"מ עמוק.
    הערה: שים לב לכל דימום נוסף כאן. דימום יכול להיות מנוהל באמצעות שילוב של צמר גפן וצרב.
11. באמצעות מלקחיים כירורגיים, לבצע ניתוח בוטה עובד לאורך החתך האורך בין הבטן שריר עד ההיבט האחורי של האטלס (CI) מוחשי.
12. נתק את מקורות השרירים המורכבים הקפיטוס הקפיטוס למחצה לאורך ההיבט האחורי של הגולגולת והפרד אותו לאורך החוליות הבסיסיות על ידי אזמל וניתוח קהה.
13. לסגת שרירי קומפלקס הקפיטוס הקפיטוס semispinalis באמצעות קבוצה אחרת של מפסקים שמירה עצמית.
14. באמצעות אזמל, להסיר בזהירות כל רקמה שנותרה מעל האזור שבו האטלס פוגש את בסיס הגולגולת.
15. הצבת זרוע אחת מתחת לצוואר החיה ואצבע אחת בצומת האטלס והגולגולת, מרימות בו זמנית את הראש ומכופפות את הצוואר תוך כדי מישוש עם האצבע כדי לחשוף את הבור באמצעות היד השנייה.
    הערה: מגנה בור הים מזוהה כאשר חיוור כמבנה אלסטי חזק עם כמות קטנה של ריבאונד כמו לחץ משתחרר עם האצבע.

3. קנון והזרקה

הערה: צעד זה דורש גם לפחות שני אנשים ומתבצע עם ראשו של בעל החיים מורם וצווארו מכופף.

1. ודא כי אדם אחד מרים ומכופף את הראש והצוואר של החיה בעוד השני palpates עבור בור הים מגנה עושה פתק של המיקום האנטומי שלה.
2. לאט ובזהירות להציג צינורית 22 G דרך הדורה לתוך מגנה בור בזווית עקשנית לציר האורך.
   הערה: אין להכניס את הצינורית עמוק מדי, שכן זה יכול לגרום נזק למוח. לדעת כמה רחוק להכניס את הצינורית מגיע עם ניסיון להבין איך זה מרגיש עבור הצינורית לנקב את הדורה. בעיקרו של דבר, בדיוק כמו הדורה כבר פירסינג, הצינורית היא אז עמוק מספיק עבור זריקת מעקב מוצלחת. עומק זה הוא כ 3-5 מ"מ אבל יהיה שונה בהתבסס על גודל או גיל של החיה. קנוניציה מוצלחת צריכה להיות ניכרת מיד באמצעות הדמיה של CSF ברור ופועם העולה על הצינורית. לקבלת התוצאה הטובה ביותר, מומלץ לתרגל מספר cannulations מראש בבעלי חיים מורדמים כדי לקבל את ההבנה של אחד של פירסינג dural.
3. הסר את המחט מהקנולה והניח מכסה על המנעול.
4. ראשית, להחיל דבק על מאיץ שבו הצינורית נכנסת לרקמה, ואחריו היישום של מלט השיניים. המתן 5 דקות עד שהמלט יתקשה.
5. הסר בזהירות את המכסה מהזפירית וצרף את הקצה הגברי של ברז קו העירוי שהוכן בעבר עם סיומת של 10 ס"מ, עם מכשיר המעקב, אל הצינורית.
6. לאט להזריק את המעקב ביד או באמצעות משאבת מיקרו עירוי בקצב של 100 μL / min. הסר את הקשת קו IV 3-דרכים עם סיומת 10 ס"מ והחלף אותו במכסה. נותב צריך להיות עכשיו פועם בבסיס הצינורית (וידאו משלים 1).
   הערה: אם הזרקה ביד, לעשות את זה עד המעקב הוא פשוט עדיין גלוי בפיר הצינורית, כ 1-2 מ"מ מעל שבו מלט השיניים מכסה את הפיר.
7. לאחר ההזרקה, מניחים שקי חול מתחת לצוואר כדי לשמור על כיפוף מסוים. לאחר מכן הראש עשוי להשתחרר, והחיה נותרת בתנוחה נוטה למנוחה.
8. שחררו את המפסקים לשמירה עצמית והניחו את השרירים כפי שהם שכבו לפני כן. מקרבים את העור על השרירים באמצעות מלחצי מגבות כירורגיים.
9. לכסות מהדקי מגבת ו חבטות עם גזה ולאחר מכן שמיכה כדי להגביל את אובדן החום.
10. אפשר למעקב להסתובב לזמן הרצוי לפני המתת חסד של החיה על ידי i.v. הזרקת פנטוברביטל (140 מ"ג/ק"ג). אשר המתת חסד על ידי היעדר קולות לב על auscultation עם סטטוסקופ.

4. מיצוי ועיבוד המוח

1. בעזרת אזמל עם 20 להבים, הרחיבו את ההסתעפות העורית האורך מהפסג העורפי לכ-7 ס"מ מעל האף.
2. משקפים את העור מעל ההיבט העורי של הגולגולת באמצעות האזמל.
   הערה: ישנן מספר דרכים לחתוך ולהסיר את ההיבט החלקי של גולגולת החזיר על בסיס בעל חיים אחר חיה. להלן ההליך שעבד לרוב עבור ניסוי זה.
3. בעזרת מסור קומפקטי כף יד, בצעו חתך קורונלי בגולגולת, כ-3 ס"מ מעל שני הוורידים הגדולים שנראו ביציאה מהגולגולת. יש להאריך לשני חתכים אנכיים נוספים מהקיצוצים בקורונלי ועוד שני חתכים נוספים כדי לחבר את החתכים האנכיים בקו האמצע.
   הערה: שמור על אחיזה איתנה של המסור בעת ביצוע חיתוך עצם הגולגולת כפי שהוא נוטה למשוך משם על המגע הראשון עם העצם או הרקמה, אשר יכול להוביל לפציעה חמורה.
4. ודא את חתכי הגולגולת הם דרך כל עובי העצם על ידי מעקב עם פטיש ואזמל צר (10 מ"מ) לכל אחד החתכים.
5. באמצעות הפטיש, סוף סוף לדפוק אזמל רחב (25-30 מ"מ) לתוך לחתוך קורונל. עם אדם אחד התומך בראש, ודא כי האדם האחר מיישם מינוף על האזמל כדי להתכווץ לפתוח את הגולגולת גבורת.
6. לאחר שרסיס הגולגולת של הגב הוסר, ניתחו את הדורה מאטר המוגזם באמצעות מספריים כירורגיים מעוקלים.
7. השתמש מרית כדי לפגוע בחוט השדרה מה במוח הקטן בהיבט rostral. לאחר מכן המשיכו להנחות את המרית מתחת למוח מקדימה, תוך ניתוק נורות הריח, בלוטת יותרת המוח ועצבי הגולגולת.
8. מניחים את המרית מאחורי המוח הקטן ולהפעיל כמות לא מבוטלת של לחץ כדי להוציא את המוח מחלל הגולגולת, בזהירות להרים אותו פעם רופפת.
9. מיד לתקן את המוח כולו על ידי טבילת רקמות ב 4% paraformaldehyde לילה.
   הערה: לאחר שלב זה, ניתן לבצע את כל הדמיית המוח באמצעות סטריאוסקופ (איור 1E).
10. למחרת, לעשות פרוסות קורונל של המוח באמצעות סכין סלמון ולתקן את הפרוסות לילה על ידי טבילת רקמות 4% paraformaldehyde.
11. לבסוף, מניחים את הפרוסות ב-0.01% אזיד ב-PBS לאחסון לטווח ארוך.

תוצאות

ברגע שהחזיר חסר הכרה, הוא מפונק, ואנטומיה פני השטח שלו מסומנת, החל בפסגת העורף (OC) ועבודה לכיוון חוליות בית החזה (טלוויזיה) וכל בסיס האוזן (EB). לאורך הקווים הללו נעשים החתכים העוריים (איור 1A). שלוש שכבות השריר, כולל טרפז, דוונטיטר הקפיטוס למחצה ורכב הקפיטוס הקפיטוס למחצה ננותכי...

Discussion

להלן, מתואר, פרוטוקול מפורט לביצוע השיעון הישיר של בור הים בחזירים, כולל ההכנה הדרושה, הליך כירורגי, עירוי מעקב ומיצוי המוח. זה דורש מישהו עם ניסיון והסמכה לעבודה עם בעלי חיים גדולים. אם מתבצע כראוי, זה מאפשר משלוח של מולקולות הרצויות עם בטחון ישירות לתוך CSF, ולאחר מכן סדרה של שיטות הדמיה אור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA