التصوير المكاني الصدغي في الجسم الحي لأنظمة توصيل الأدوية العينية باستخدام المجهر الليزري البؤري الليفي البصري

Summary

نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.

Abstract

الحقن تحت الملتحمة هو طريق جذاب لإدارة أدوية العين بسبب سهولة الوصول عبر الصلبة التي تتجاوز حواجز العين الأمامية ، مثل القرنية والملتحمة. في حين تم وصف الآثار العلاجية والحركية الدوائية للأدوية عند الحقن تحت الملتحمة في بعض الدراسات ، فإن عددا قليلا جدا منها يقيم التوزيع العيني للأدوية أو أنظمة توصيل الدواء (DDS). هذا الأخير أمر بالغ الأهمية لتحسين تصميم DDS داخل العين والتوافر البيولوجي للأدوية لتحقيق التوطين العيني المطلوب ومدة العمل (على سبيل المثال ، الحادة مقابل الطويلة). تثبت هذه الدراسة استخدام المجهر بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة نوعية للتوزيع العيني للجسيمات الشحمية الفلورية في الوقت الفعلي في الفئران الحية بعد الحقن تحت الملتحمة. كونها مصممة للفحص البصري في الجسم الحي للأنسجة على المستوى المجهري ، وهذا هو أيضا أول وصف كامل لطريقة التصوير CLM لدراسة التوزيع المكاني والزماني للحقن في العين بعد الحقن تحت الملتحمة.

Introduction

إن إزالة الدم وتوزيع الأنسجة والإشغال المستهدف للعقاقير في الأنظمة الحية هي ركائز لفهم التصرف في الأدوية في الجسم الحي. في النماذج الحيوانية قبل السريرية ، يتم تقييم هذه المعلمات عادة عن طريق أخذ عينات الدم والأنسجة بشكل متكرر في نقاط زمنية معينة بعد إعطاء الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غازية بشكل عام ، وغالبا ما تتضمن قياسات عدم البقاء على قيد الحياة ، وتتطلب مجموعات كبيرة من الحيوانات للتشغيل الإحصائي. قد تكون هناك تكلفة إضافية ووقت متكبد ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية للاستخدام المفرط للحيوانات. ونتيجة لذلك ، أصبح التصوير غير الجراحي بسرعة خطوة أساسية في دراسات التوزيعات الحيوية. يعد التنظير المجهري بالليزر البؤري (^CLM1,2) مناسبا تماما للتطبيقات العينية لتصوير التوزيع المكاني والزماني للعلاجات بشكل غير جراحي في عيون الحيوانات الحية ذات الحساسية العالية والدقة ^{العالية1,3,4}.

لدى CLM القدرة على تسهيل الفحص القوي لأنظمة توصيل الأدوية العينية (DDS) ، مثل الجسيمات الشحمية ، قبل التحديد الكمي الشامل ل DDS والتوافر البيولوجي للأدوية. الجسيمات الشحمية جذابة لمرونتها في ضبط خصائصها الفيزيائية والكيميائية ^{الحيوية5،6،7،8،9،10،11} لتغليف مجموعة كبيرة ومتنوعة من البضائع العلاجية والتحكم في موقع الأنسجة لإطلاق الدواء ومدة العمل. تم استخدام الجسيمات الشحمية في تطبيقات العين لتوصيل جزيئات كبيرة ، مثل الجسم المضاد أحادي النسيلة bevacizumab12 ، والجزيئات الصغيرة مثل السيكلوسبورين13 و ganciclovir14. الجسيمات الشحمية المحملة بالأدوية لها عمر نصف بيولوجي أطول وتأثيرات علاجية طويلة الأمد مقارنة بتركيبات "الدواء الحر" غير الشحمية. ومع ذلك ، عادة ما يتم استقراء توزيع الدواء في أنسجة العين من تركيزات المخدرات في المكونات السائلة للعين (أي الدم ، والفكاهة المائية ، والفكاهة الزجاجية ^15،16،17). نظرا لأن المصير الأولي في الجسم الحي لشحنة الدواء المحملة يتم تحديده من خلال خصائص الناقل النانوي نفسه ، فإن تصوير CLM للجسيمات الشحمية الفلورية يمكن أن يكون بمثابة بديل للدواء للكشف عن استهداف الأنسجة وأوقات إقامة الأنسجة في الموقع. علاوة على ذلك ، يمكن للأدلة المرئية على التسليم باستخدام CLM توجيه إعادة تصميم DDS ، وتقييم الفوائد العلاجية للدواء ، وربما حتى التنبؤ بالأحداث البيولوجية الضارة (على سبيل المثال ، سمية الأنسجة بسبب التوطين غير المرغوب فيه ل DDS لفترات طويلة من الزمن).

هنا ، يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة حول كيفية دراسة التوزيع الحيوي للجسيمات الشحمية في العين في الفئران الحية باستخدام نظام CLM ثنائي النطاق. يمكن لنظام CLM المحدد هذا اكتشاف التألق بلونين (مع ليزر الإثارة الأخضر والأحمر عند 488 نانومتر و 660 نانومتر) في الوقت الفعلي ، بتردد 8 إطارات / ثانية. من خلال وضع مسبار الكشف جسديا على العين ، يوضح البروتوكول الحصول على صورة وتحليل الجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء عند تناولها تحت الملتحمة في الفئران التي تم حقنها مسبقا عن طريق الوريد (IV) مع صبغة إيفانز بلو (EB) بنسبة 2٪. تساعد صبغة EB على تصور الهياكل الوعائية في قناة التألق الحمراء. نعرض نتائج تمثيلية من دراسة تقيم الجسيمات الشحمية المحايدة 100 نانومتر المكونة من الفوسفوليبيد POPC (أي 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين) والمنشطات مع الفوسفوليبيد Fl-DHPE الموسوم بالفلوريسين (أي N-(فلوريسين-5-ثيوكاربامويل) -1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine) بنسبة 95٪ POPC: 5٪ Fl-DHPE (الشكل 1B ). CLM قادر على التقاط الجسيمات الشحمية الخضراء الموسومة بالفلوريسين عند 15 ميكرومتر محوري و 3.30 ميكرومتر جانبي عن طريق ترسيم حدود أنسجة العين الملطخة ب EB.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في SingHealth (سنغافورة). تم الحصول على إناث الفئران C57BL/6 J (6-8 أسابيع ؛ 18-20 جم) من InVivos ، سنغافورة ، وتم وضعها في درجة حرارة و vivarium التي يتم التحكم فيها بالضوء في كلية الطب Duke-NUS ، سنغافورة. تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

ملاحظة: يظهر في الشكل 2 مخطط انسيابي يسلط الضوء على الإجراءات الرئيسية.

1. إعداد عوامل التباين: إيفانز الأزرق (EB) والجسيمات الشحمية

1. للحصول على محلول صبغ EB بنسبة 2٪ ، قم بإذابة 1 غرام من EB في 50 مل من محلول ملحي معقم. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر في أنابيب معقمة سعة 1.5 مل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها لاحقا.
2. بالنسبة للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء ، أضف POPC / Fl-DHPE (95: 5) ، الكلوروفورم / الميثانول (2: 1) في قارورة سفلية مستديرة 100 مل. استخدم مبخرا دوار عند 150 دورة في الدقيقة عند 40 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الحفاظ على الفراغ عند 0 مللي ^بار1 لإنشاء طبقة دهنية رقيقة.
   ملاحظة: عند مقارنة تأثيرات الخصائص الشحمية (مثل الحجم والشحنة وتشبع الدهون وطول سلسلة الدهون) على التوزيع، حافظ على نسبة مئوية ثابتة من Fl-DHPE أو غيرها من الدهون الفلورية للتأكد من أن النتائج التي لوحظت ترجع إلى تأثير الخصائص التي تم اختبارها، وليس إلى الحمل المتغير للأصباغ الكبيرة الكارهة للماء.
3. قم بترطيب طبقة الدهون باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (لتحقيق 26.3 ملليمتر من الجسيمات الشحمية الفلورية) عند 40 درجة مئوية لتشكيل حويصلات متعددة الصفائح (MLV). قم بتحميل MLVs في حقنة زجاجية للبثق اليدوي (30 مرة باستخدام مرشح بولي كربونات بحجم المسام 0.08 ميكرومتر) لتحقيق الحجم المطلوب البالغ 100 نانومتر.
   ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة الترطيب أعلى من درجة حرارة انتقال الدهون.
4. قم بتصفية الجسيمات الشحمية عن طريق تمريرها عبر مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر. تأكد من القطر الهيدروديناميكي (_DH) للجسيمات الشحمية باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي.

2. إعطاء EB والجسيمات الشحمية في الفئران الحية

1. حقن الفأر مع EB IV (عن طريق الوريد) عن طريق الوريد الذيل (2.5 ملغم / كغم) ، 2 ساعة قبل الحقن تحت الملتحمة.
2. للحقن تحت الملتحمة ، أولا ، قم بتخدير الماوس باستخدام 5٪ isoflurane عن طريق الاستنشاق في غرفة الحث لتحقيق مستوى كاف من التخدير. انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران أثناء وجوده على وسادة تسخين طوال العملية.
3. تقليم الشعيرات بالقرب من العين ليتم حقنها وغرس قطرة من التخدير الموضعي 0.5٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine مباشرة على العين.
4. قم بتحميل حقنة زجاجية سعة 10 ميكرولتر (مع إبرة 32 جم) باستخدام الجسيمات الشحمية الفلورية (Fl-DHPE: 0.78 مجم / كجم) وقم بتبديد جميع فقاعات الهواء في المحقنة قبل الحقن.
   ملاحظة: يمكن استيعاب ما يصل إلى 20 ميكرولتر من الحقن في الفضاء تحت الملتحمة للفئران18,19.
5. باستخدام ملاقط ، ارفع الملتحمة قليلا وحقن ببطء في الفضاء تحت الملتحمة (الشكل 1A). اسحب الإبرة ببطء لمنع التدفق العكسي. تأكد من تشكيل بليب مرئي مملوء بالجسيمات الشحمية الفلورية (الشكل 1C).
6. إعطاء قطرة من المضادات الحيوية 1٪ حمض الفوسيديك على العين بعد الحقن ومراقبة الماوس حتى يستعيد وعيه.

3. إعداد CLM

1. قم بتشغيل نظام CLM وتأكد من نظافة كل من الموصل والطرف البعيد لمسبار المسح الضوئي.
2. قم بتنظيف موصل مسبار المسح الضوئي باستخدام منظف موصل بصري باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   1. اضغط على الراشيت (الملون غالبا) الخاص بمنظف الموصل البصري للكشف عن شريط التنظيف.
   2. ضع الموصل على اتصال بشريط التنظيف وحرك الموصل على طول الشريط مع الحفاظ على التلامس.
3. قم بتنظيف الطرف البعيد (المعروف أيضا باسم طرف المسح) للمسبار عن طريق غمسه في محلول التطهير ، متبوعا بمحلول الشطف الذي توفره الشركة المصنعة. يمكن أيضا استخدام قضيب طرف قطني لتنظيف أكثر شمولا إذا كان الطرف متسخا جدا.
4. قم بتوصيل المسبار بنظام CLM. اختر مجال العرض (FOV) وموقع ملفات الاستحواذ في هذه المرحلة.
   ملاحظة: اضبط شدة الليزر في هذه الخطوة للتأكد من أن الكشف عن التألق ل Fl-DHPE في النطاق الخطي. يجب الحفاظ على كثافة الليزر متسقة للمقارنة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة.
5. اسمح للنظام بالإحماء لمدة 15 دقيقة وفقا للتعليمات واستخدم مجموعة المعايرة لمعايرة النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: في مجموعة المعايرة، توجد ثلاث قوارير لكل ليزر تحتوي على المحاليل التالية: محلول التنظيف، ومحلول الشطف، ومحلول الفلوروفور 488/660 نانومتر للمعايرة الداخلية. يتم طلب خطوات المعايرة بواسطة النظام ويجب اتباعها وفقا لذلك.
   1. اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اتركه في الهواء لتسجيل الخلفية لكلتا القناتين.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة للغاية لأنها تطبيع قيم الخلفية من الألياف المختلفة للمسبار وتضمن توحيد الصورة.
   2. اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اغمر الطرف في قارورة الفلوروفور 488 نانومتر لمدة 5 ثوان لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.
   3. اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اغمر الطرف في قارورة الشطف حتى تسجل إشارة التألق في 3.5.2. يختفي. اغمر الطرف في قارورة الفلوروفور 660 نانومتر لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.
      ملاحظة: اتبع جميع خطوات المعايرة من أجل تحقيق المعايرة المناسبة وجودة الصورة المثلى.
6. بعد معايرة المسبار، تحقق للتأكد من أن قيم الخلفية للمجسات منخفضة قدر الإمكان. بالنسبة لنظام CLM المستخدم، احتفظ بقيم الخلفية أقل من 100. قم بإجراء التنظيف المتكرر للمسبار باستخدام قضيب طرف قطني ومعايرة إذا كانت القيم أعلى من 100 / قيمة مستخدم محددة أو إذا بدا أن المسبار متسخ. هذا هو التأكد من أن ضوضاء الخلفية يتم الاحتفاظ بها حول نفس القيمة.
   ملاحظة: من المهم تحديد الحد الأقصى لقيمة الخلفية (على سبيل المثال، 100 كما هو مذكور في الخطوة 3.6) للتأكد من أن ظروف التحقيق متشابهة. سيسمح ذلك بإجراء مقارنة كمية مناسبة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة. قد تختلف القيمة في الأنظمة المختلفة وظروف التحقيق.
7. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة حرارة الحيوان (ATC). اضبط ATC على 37 درجة مئوية. قم بتغطية وسادة التدفئة بستارة جراحية وقم بإصلاح مخروط الأنف على وسادة التدفئة.
   ملاحظة: مطلوب ATC مع وسادة تدفئة مرفقة لضمان الحفاظ على دفء الحيوان طوال مدة التصوير.
8. قم بتثبيت حامل المجهر التشريحي على سطح الطاولة لتثبيته. قم بتدوير وضبط عدسة المجهر لعرض عين الماوس بشكل مريح من خلال العدسة عندما يكون المستخدم جالسا (قم بإجراء التعديلات بعد وضع الحيوان).
9. تخدير الماوس باستخدام 5 ٪ isoflurane في غرفة الحث. انقل الماوس إلى مخروط الأنف بمجرد أن يكون الحيوان غير مستجيب وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -2.5٪ isoflurane أثناء وجوده على وسادة تسخين طوال العملية.
10. تقليم شعيرات الماوس وغرس قطرة من مخدر 0.5 ٪ من محلول هيدروكلوريد المخدر الوكيل على العين.
11. للتأكد من نظافة العينين ، أسقط بضع قطرات من المياه المالحة لغسل سطح العين.
12. اضبط المجهر بحيث تكون عين الماوس في بؤرة تركيز مباشرة عند تكبير 0.67x.
    ملاحظة: تأكد من تليين العينين بمحلول ملحي. إذا لم يتم تشحيم العينين طوال جلسة التصوير ، فقد تجف ، مما يتسبب في تبلور العدسة. نتيجة لذلك ، أثناء تصوير CLM ، يمكن للعدسة أن تنبعث منها فلورة حمراء في الخلفية.

4. التصوير الحي لعيون الفئران مع CLM والاستحواذ

1. قم بتشغيل الليزر ، وضع المسبار على العين وابدأ في تسجيل الاكتساب لمراقبة التألق في العين في المناطق المشار إليها على خريطة العين في الشكل 3.
   ملاحظة: أمسك المسبار مثل القلم مع الطرف البعيد من المسبار مباشرة على المنطقة المراد تصويرها.
2. أوقف التسجيل عند وضع علامة على جميع المناطق وتصنيفها. سيتم حفظ ملفات الاستحواذ تلقائيا في موقع الملف المحدد في الخطوة 3.4.
   ملاحظة: سيتم حفظ الملف كملف فيديو يمكن تصديره إلى صور فردية. قم بتسمية العلم وفقا لخريطة العين لمعرفة موقع المسبار بالضبط في الإطار الدقيق الذي تم فيه التسجيل.

5. تحليل الصور

1. باستخدام نفس برنامج الحصول على CLM ، قم بتصدير ملفات الحصول على الصور لمزيد من التحليل. انقر على ملف | تصدير واختيار التنسيق المراد التصدير إليه. ستسمح ملفات تنسيق Mkt بتعديلات جدول البحث (LUT) والمزيد من الصادرات إلى تنسيقات ملفات الصور باستخدام برنامج عارض CLM.
2. للمقارنة الدقيقة لشدة التألق ، استخدم نفس LUT المعدل لكل قناة عند تصدير جميع ملفات الصور.
   ملاحظة: اختر الحد الأدنى والحد الأقصى لعتبة LUT فيما يتعلق بعتبة ماوس التحكم (بدون حقن الجسيمات الشحمية) لتقليل قراءات التألق في الخلفية.
3. افتح الصورة في برنامج مناسب لمعالجة الصور /برنامج مجاني (على سبيل المثال ، ImageJ). ارسم منطقة الاهتمام (ROI).
   ملاحظة: يشير عائد الاستثمار هنا إلى المنطقة التي تحظى باهتمام برنامج المعالجة. في معظم الحالات ، سيكون عائد الاستثمار هو الصورة بأكملها الممسوحة ضوئيا. ومع ذلك ، في حالة تصوير النسيج ، لا يمكن للمسبار الحصول على صورة النسيان بشكل منفصل. لذلك ، يجب رسم عائد استثمار "لقياس" التألق في منطقة limbus ، كما هو موضح في الشكل 4. للحفاظ على اتساق عائد الاستثمار، استخدم نفس عائد الاستثمار عبر جميع الصور.
4. قياس وتسجيل قيم عائد الاستثمار للتألق الأخضر. أدخل القيم في جدول بيانات. جدولة متوسط وقيم شدة التألق (a.u) لعائد الاستثمار.

6. تقييم الأنسجة

1. القتل الرحيم للماوس باستخدام طريقة معتمدة من قبل IACUC المحلي.
2. قم باستئصال العين وإصلاح العين في 1 مل من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ أو محلول الفورمالين بنسبة 10٪ بين عشية وضحاها.
3. قم بتقليم الدهون الزائدة وتضمين العين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) واحتفظ بها مجمدة في فريزر -80 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل.
4. قطع أجزاء بسماكة 5 ميكرومتر في cryostat مع الحفاظ على درجة حرارة القطع عند 20 درجة مئوية. انقل القسم إلى شريحة مجهر مغلفة ب Poly-L-Lysine.
   ملاحظة: يمكن أن يكون علم الأنسجة بمثابة التحقق الإضافي من توزيع DDS. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تحسينا إضافيا وخبرة تقنية وتضحية بالحيوانات التي تهدف الدراسة إلى تقليلها باستخدام CLM.

النتائج

يوضح البروتوكول فائدة CLM لتقييم التوزيع العيني المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء التي تدار عن طريق الحقن تحت الملتحمة. للاستفادة من القدرة المزدوجة اللون (488 نانومتر و 660 نانومتر من الأطوال الموجية للإثارة) لنظام CLM ، تم تخدير الجسيمات الشحمية POPC المحايدة التي سيتم حقنها ب 5?...

Discussion

كما هو موضح من النتائج ، يوفر CLM طريقة بسيطة ومجدية لتصوير التوزيع العيني للجسيمات الشحمية في العين. لقد أظهرنا سابقا استخدام CLM لتوصيف توطين التركيبات الشحمية المختلفة داخل عين الفأر بمرور ^الوقت1. بالنسبة للتطبيقات غير الغازية ، يسمح CLM بالتصوير في الوقت الفعلي لسطح العين الأ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3