Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die subkonjunktivale Injektion ist ein attraktiver Weg zur Verabreichung von Augenmedikamenten aufgrund des einfachen transskleralen Zugangs, der anteriore Augenbarrieren wie Hornhaut und Bindehaut umgeht. Während therapeutische Wirkungen und Pharmakokinetik der Arzneimittel bei subkonjunktivaler Injektion in einigen Studien beschrieben wurden, beurteilen nur sehr wenige die Augenverteilung von Arzneimitteln oder Drug Delivery Systems (DDS). Letzteres ist entscheidend für die Optimierung des intraokularen DDS-Designs und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels, um die gewünschte Okularlokalisation und Wirkungsdauer (z. B. akut versus verlängert) zu erreichen. Diese Studie etabliert die Verwendung der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) zur qualitativen Untersuchung der Augenverteilung von fluoreszierenden Liposomen in Echtzeit in lebenden Mäusen nach subkonjunktivaler Injektion. Konzipiert für die visuelle In-vivo-Inspektion von Geweben auf mikroskopischer Ebene, ist dies auch die erste vollständige Beschreibung der CLM-Bildgebungsmethode zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Verteilung von Injektionsmitteln im Auge nach subkonjunktivaler Injektion.

Einleitung

Die Blutclearance, die Gewebeverteilung und die Zielbelegung von Medikamenten in lebenden Systemen sind Säulen für das Verständnis der In-vivo-Wirkstoffdisposition. In präklinischen Tiermodellen werden diese Parameter typischerweise durch häufige Blut- und Gewebeentnahmen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verabreichung des Arzneimittels beurteilt. Diese Verfahren sind jedoch im Allgemeinen invasiv, beinhalten oft Nicht-Überlebensmessungen und erfordern große Tierkohorten für die statistische Auswertung. Es können zusätzliche Kosten und Zeit anfallen, zusammen mit ethischen Bedenken für übermäßigen Gebrauch von Tieren. Infolgedessen wird die nicht-invasive Bildgebung schnell zu einem integralen Schritt in Bioverteilungsstudien. Die konfokale Lasermikroendoskopie (^CLM1,2) eignet sich gut für okuläre Anwendungen, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Therapeutika in den Augen lebender Tiere mit hoher Empfindlichkeit und hoher Auflösung nicht-invasiv abzubilden1,3,4.

CLM hat das Potenzial, ein robustes Screening von okulären Drug Delivery Systemen (DDS) wie Liposomen vor einer umfassenden Quantifizierung des DDS und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu erleichtern. Liposomen sind attraktiv für ihre Flexibilität bei der Abstimmung ihrer physikalisch-chemischen und biophysikalischen Eigenschaften5,6,7,8,9,10,11, um eine Vielzahl von therapeutischen Ladungen zu verkapseln und die Gewebestelle der Wirkstofffreisetzung und die Wirkungsdauer zu kontrollieren. Liposomen wurden in okulären Anwendungen zur Abgabe großer Moleküle wie dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab12 und kleinen Molekülen wie Cyclosporin13 und Ganciclovir14 eingesetzt. Arzneimittelbeladene Liposomen haben längere biologische Halbwertszeiten und verlängerte therapeutische Wirkungen im Vergleich zu nicht-liposomalen "freien Arzneimittel" -Formulierungen. Die Arzneimittelverteilung im Augengewebe wird jedoch typischerweise aus arzneimittelkonzentrationen in flüssigen Komponenten des Auges (d. H. Blut, Kammerwasser und Glaskörper⁾ extrapoliert15,16,17). Da das anfängliche In-vivo-Schicksal der beladenen Wirkstoffladung durch die Eigenschaften des Nanocarriers selbst definiert wird, kann die CLM-Bildgebung der fluoreszierenden Liposomen als Surrogat für das Medikament dienen, um Gewebe-Targeting und In-situ-Gewebeverweilzeiten aufzudecken. Darüber hinaus kann der visuelle Nachweis der Verabreichung mit CLM das DDS-Redesign steuern, den therapeutischen Nutzen des Arzneimittels bewerten und möglicherweise sogar unerwünschte biologische Ereignisse vorhersagen (z. B. Gewebetoxizität aufgrund unerwünschter Lokalisation von DDS über einen längeren Zeitraum).

Hierin wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben, wie die okuläre Bioverteilung von Liposomen in lebenden Mäusen mit einem Dual-Band-CLM-System untersucht werden kann. Dieses spezielle CLM-System kann zweifarbige Fluoreszenz (mit grünen und roten Anregungslasern bei 488 nm und 660 nm) in Echtzeit mit einer Frequenz von 8 Bildern/s erkennen. Durch die physische Platzierung der Nachweissonde auf dem Auge demonstriert das Protokoll die Bilderfassung und Analyse von grün fluoreszierenden Liposomen bei subkonjunktivaler Verabreichung in Mäusen, die intravenös (IV) mit 2% Evans Blue (EB) Farbstoff vorinjiziert wurden. EB-Farbstoff hilft, die vaskularisierten Strukturen im roten Fluoreszenzkanal sichtbar zu machen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse aus einer Studie, in der 100 nm neutrale Liposomen untersucht wurden, die aus dem Phospholipid POPC (d.h. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin) bestehen und mit Fluorescein-markiertem Phospholipid Fl-DHPE (d.h. N-(Fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamin dotiert sind) im Verhältnis von 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Abbildung 1B ). CLM ist in der Lage, die grünen Fluorescein-markierten Liposomen mit 15 μm axialer und 3,30 μm lateraler Auflösung durch Abgrenzung von EB-gefärbten Augengewebegrenzen zu erfassen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei SingHealth (Singapur) genehmigt. Weibliche C57BL/6 J-Mäuse (6-8 Wochen alt; 18-20 g) wurden aus InVivos, Singapur, gewonnen und in einem temperatur- und lichtkontrollierten Vivarium der Duke-NUS Medical School, Singapur, untergebracht. Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Verfahren hervorhebt, ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Herstellung von Kontrastmitteln: Evans Blue (EB) und Liposomen

1. Für 2% ige EB-Farbstofflösung 1 g EB in 50 ml steriler Kochsalzlösung auflösen. Die Lösung wird mit 0,22-μm-Filtern in sterile 1,5-ml-Röhrchen filtriert und für die spätere Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.
2. Für grün fluoreszierende Liposomen POPC/Fl-DHPE (95:5), Chloroform/Methanol (2:1) in einen 100 ml Rundkolben geben. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer mit 150 U / min bei 40 ° C für 1 h, wobei das Vakuum bei 0 ^mbar1 gehalten wird, um einen dünnen Lipidfilm zu erzeugen.
   HINWEIS: Halten Sie beim Vergleich der Auswirkungen liposomaler Eigenschaften (z. B. Größe, Ladung, Lipidsättigung, Lipidkettenlänge) auf die Verteilung einen festen Prozentsatz an Fl-DHPE oder anderen fluoreszierenden Lipiden ein, um zu bestätigen, dass die beobachteten Ergebnisse auf die Wirkung der getesteten Eigenschaften und nicht auf die variable Belastung großer hydrophober Farbstoffe zurückzuführen sind.
3. Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (um 26,3 mM fluoreszierende Liposomen zu erreichen) bei 40 °C, um mehrlamelläre Vesikel (MLV) zu bilden. Laden Sie die MLVs zur manuellen Extrusion in eine Glasspritze (30 Mal mit einem Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,08 μm), um die gewünschte Größe von 100 nm zu erreichen.
   HINWEIS: Die Temperatur für die Hydratation muss höher sein als die Übergangstemperatur der Lipide.
4. Filtern Sie die Liposomen, indem Sie sie durch einen sterilen 0,22 μm-Spritzenfilter führen. Bestätigen Sie den hydrodynamischen Durchmesser (_DH) der Liposomen mit einem dynamischen Lichtstreusystem.

2. Verabreichung von EB und Liposomen in lebenden Mäusen

1. Der Maus wird EB IV (intravenös) über die Schwanzvene (2,5 mg/kg) 2 h vor der subkonjunktivalen Injektion injiziert.
2. Für die subkonjunktivale Injektion wird die Maus zunächst mit 5% Isofluran durch Inhalation in einer Induktionskammer sediert, um eine ausreichende Anästhesieebene zu erreichen. Übertragen Sie die Maus auf einen Nasenkegel und halten Sie die Sedierung bei 2% -2,5% Isofluran während des gesamten Eingriffs auf einem Heizkissen.
3. Schneiden Sie die Schnurrhaare in der Nähe des zu injizierenden Auges ab und geben Sie einen Tropfen topisches Anästhetikum 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung direkt auf das Auge.
4. Bestücken Sie eine 10 μL Glasspritze (mit 32 G Nadel) mit fluoreszierenden Liposomen (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze vor der Injektion.
   HINWEIS: Bis zu 20 μL Injektat können im subkonjunktivalen Raum von Mäusen untergebracht ^werden18,19.
5. Heben Sie die Bindehaut mit einer Pinzette leicht an und injizieren Sie langsam in den Subkonjunktivalraum (Abbildung 1A). Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um einen Rückfluss zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass eine sichtbare, mit fluoreszierenden Liposomen gefüllte Blase gebildet wird (Abbildung 1C).
6. Verabreichen Sie nach der Injektion einen Tropfen Antibiotikum 1% Fusidinsäure auf das Auge und überwachen Sie die Maus, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt hat.

3. CLM-Einrichtung

1. Schalten Sie das CLM-System ein und stellen Sie sicher, dass sowohl der Anschluss als auch die distale Spitze der Scansonde sauber sind.
2. Reinigen Sie den Anschluss der Scanning-Sonde mit einem optischen Steckerreiniger, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
   1. Drücken Sie auf die Rachet (oft farbig) des optischen Anschlussreinigers, um ein Reinigungsband freizulegen.
   2. Positionieren Sie den Stecker in Kontakt mit dem Reinigungsband und schieben Sie den Stecker entlang des Bandes, während der Kontakt erhalten bleibt.
3. Reinigen Sie die distale Spitze (auch als Scanspitze bezeichnet) der Sonde, indem Sie sie in die Reinigungslösung tauchen, gefolgt von der vom Hersteller bereitgestellten Spüllösung. Ein Baumwollspitzenapplikator kann auch für eine gründlichere Reinigung verwendet werden, wenn die Spitze sehr schmutzig ist.
4. Schließen Sie die Sonde an das CLM-System an. Wählen Sie an dieser Stelle das Sichtfeld (FOV) und den Speicherort für die Erfassungsdateien aus.
   HINWEIS: Stellen Sie die Laserintensität in diesem Schritt ein, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzdetektion für Fl-DHPE im linearen Bereich liegt. Die Laserintensität ist für den Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, konsistent zu halten.
5. Lassen Sie das System wie angewiesen 15 Minuten lang aufwärmen und verwenden Sie das Kalibrierkit, um das System gemäß den Anweisungen des Herstellers zu kalibrieren.
   HINWEIS: Im Kalibrierkit befinden sich für jeden Laser drei Durchstechflaschen, die die folgenden Lösungen enthalten: Reinigungslösung, Spüllösung und Fluorophor 488/660 nm Lösung für die interne Kalibrierung. Die Kalibrierschritte werden vom System vorgefragt und sind entsprechend zu befolgen.
   1. Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Lassen Sie es in der Luft für Hintergrundaufnahmen für beide Kanäle.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, da er die Hintergrundwerte aus verschiedenen Fasern der Sonde normalisiert und die Bildgleichmäßigkeit sicherstellt.
   2. Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Tauchen Sie die Spitze für 5 Sekunden in eine Fluorophor-488-nm-Durchstechflasche, um die Signalwerte verschiedener Fasern in der Sonde zu normalisieren.
   3. Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Die Spitze wird in die Spülflasche getaucht, bis das Fluoreszenzsignal in Abschnitt 3.5.2 aufgezeichnet ist. verschwindet. Tauchen Sie die Spitze in eine Fluorophor-660-nm-Durchstechflasche, um die Signalwerte verschiedener Fasern in der Sonde zu normalisieren.
      HINWEIS: Befolgen Sie alle Kalibrierungsschritte, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung und optimale Bildqualität zu erreichen.
6. Überprüfen Sie nach der Kalibrierung der Sonde, ob die Hintergrundwerte für die Sonden so niedrig wie möglich sind. Halten Sie für das verwendete CLM-System die Hintergrundwerte unter 100. Führen Sie eine wiederholte Reinigung der Sonde mit einem Baumwollspitzenapplikator durch und kalibrieren Sie sie, wenn die Werte über 100/definiertem Benutzerwert liegen oder wenn die Sonde verschmutzt zu sein scheint. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Hintergrundrauschen in etwa auf dem gleichen Wert gehalten wird.
   HINWEIS: Es ist wichtig, den maximalen Hintergrundwert zu definieren (z. B. 100, wie in Schritt 3.6 angegeben), um sicherzustellen, dass die Prüfpunktbedingungen ähnlich sind. Dies ermöglicht einen angemessenen quantitativen Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Der Wert kann in verschiedenen Systemen und Sondenbedingungen unterschiedlich sein.
7. Schalten Sie den Tiertemperaturregler (ATC) ein. Stellen Sie den ATC auf 37 °C ein. Decken Sie das Heizkissen mit einem CHIRURGISCHEN Vorhang ab und befestigen Sie den Nasenkonus auf dem Heizkissen.
   HINWEIS: ATC mit einem angebrachten Heizkissen ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das Tier während der gesamten Bildgebungsdauer warm gehalten wird.
8. Klemmen Sie den Ständer des Seziermikroskops an die Tischplatte, um ihn zu befestigen. Drehen und justieren Sie das Okular des Mikroskops, um das Mausauge ergonomisch durch das Okular zu betrachten, wenn der Benutzer sitzt (nehmen Sie die Einstellungen nach dem Platzieren des Tieres vor).
9. Sedieren Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Induktionskammer. Übertragen Sie die Maus auf den Nasenkegel, sobald das Tier nicht ansprechbar ist, und halten Sie die Sedierung während des gesamten Eingriffs bei 2% -2,5% Isofluran aufrecht.
10. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Maus ab und geben Sie einen Tropfen anästhetische 0,5% ige Proxymetacainhydrochlorid-Lösung auf das Auge.
11. Um sicherzustellen, dass die Augen sauber sind, lassen Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung fallen, um die Augenoberfläche zu waschen.
12. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass das Mausauge bei 0,67-facher Vergrößerung direkt fokussiert ist.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Augen mit Kochsalzlösung schmieren. Wenn die Augen während der gesamten Bildgebungssitzung nicht geschmiert werden, können sie trocken werden, wodurch die Linse kristallisiert. Infolgedessen kann die Linse während der CLM-Bildgebung eine rote Hintergrundfluoreszenz emittieren.

4. Live-Bildgebung von Mausaugen mit CLM und Erfassung

1. Schalten Sie den Laser ein, legen Sie die Sonde auf das Auge und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Erfassung, um die Fluoreszenz im Auge an den in Abbildung 3 angegebenen Bereichen auf der Augenkarte zu beobachten.
   HINWEIS: Halten Sie die Sonde wie einen Stift mit dem distalen Ende der Sonde direkt auf den zu fotografierenden Bereich.
2. Stoppen Sie die Aufzeichnung, wenn alle Regionen gekennzeichnet und gekennzeichnet wurden. Die Erfassungsdateien werden automatisch an dem in Schritt 3.4 ausgewählten Dateispeicherort gespeichert.
   HINWEIS: Die Datei wird als Videodatei gespeichert, die in einzelne Bilder exportiert werden kann. Beschriften Sie die Flagge gemäß der Augenkarte, um genau zu wissen, wo sich die Sonde genau in dem Rahmen befindet, in dem die Aufnahme durchgeführt wurde.

5. Bildanalyse

1. Exportieren Sie die Bilderfassungsdateien mit derselben CLM-Erfassungssoftware zur weiteren Analyse. Klicken Sie auf Datei | Exportieren Sie und wählen Sie das Format aus, in das exportiert werden soll. Mkt-Formatdateien ermöglichen Anpassungen der Nachschlagetabelle (LUT) und weitere Exporte in Bilddateiformate mit der CLM-Viewer-Software.
2. Für einen genauen Vergleich der Fluoreszenzintensität verwenden Sie beim Exportieren aller Bilddateien die gleiche LUT, die für jeden Kanal angepasst ist.
   HINWEIS: Wählen Sie den minimalen und maximalen LUT-Schwellenwert in Bezug auf den der Kontrollmaus (ohne injizierte Liposomen), um die Hintergrundfluoreszenzwerte zu minimieren.
3. Öffnen Sie das Bild in einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware/Freeware(z.B. ImageJ). Zeichnen Sie die Region of Interest (ROI).
   HINWEIS: Der ROI bezieht sich hier auf die Region, die im Verarbeitungsprogramm von Interesse ist. In den meisten Fällen wird der ROI das gesamte gescannte Bild sein. Bei der Abbildung des Limbus kann die Sonde jedoch nicht einfach das Bild des Limbus separat erhalten. Daher muss ein ROI gezogen werden, um die Fluoreszenz in der Limbusregion zu "quantifizieren", wie in Abbildung 4 dargestellt. Um den ROI konsistent zu halten, verwenden Sie den gleichen ROI für alle Bilder.
4. Messen und erfassen Sie die ROI-Werte für die grüne Fluoreszenz. Geben Sie die Werte in eine Kalkulationstabelle ein. Tabellieren Sie die durchschnittlichen und Fluoreszenzintensitätswerte (a.u.) des ROI.

6. Histologische Beurteilung

1. Die Maus wird mit einer von der örtlichen IACUC zugelassenen Methode eingeschläfert.
2. Enukleieren Sie das Auge und fixieren Sie das Auge in 1 ml 4% igem Formaldehyd oder 10% iger Formalinlösung über Nacht.
3. Schneiden Sie überschüssige Fette ab und betten Sie das Auge in die Optimum Cutting Temperature (OCT) -Verbindung ein und bewahren Sie es mindestens einen Tag lang in einem Gefrierschrank von -80 ° C auf.
4. Schnittabschnitte von 5 μm Dicke im Kryostaten bei einer Schnitttemperatur von 20 °C. Übertragen Sie den Schnitt auf einen Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger.
   HINWEIS: Die Histologie kann als zusätzliche Validierung der Verteilung von DDS dienen. Es erfordert jedoch zusätzliche Optimierung, technisches Fachwissen und Tieropfer, die die Studie durch den Einsatz von CLM reduzieren will.

Ergebnisse

Das Protokoll zeigt den Nutzen von CLM zur Beurteilung der räumlich-zeitlichen Augenverteilung von grün fluoreszierenden Liposomen, die durch subkonjunktivale Injektion verabreicht werden. Um die zweifarbige Fähigkeit (488 nm und 660 nm Anregungswellenlängen) des CLM-Systems zu nutzen, wurden 100 nm neutrale POPC-Liposomen, die injiziert werden sollten, mit 5% Fl-DHPE dotiert (Zusammensetzungs- und Charakterisierungsdaten sind in Abbildung 1B dargestellt), und EB wurde IV injiziert, um L...

Diskussion

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, bietet CLM eine einfache und praktikable Methode, um die Augenverteilung von Liposomen im Auge abzubilden. Wir haben zuvor die Verwendung von CLM demonstriert, um die Lokalisation verschiedener liposomaler Formulierungen im Mausauge im Laufe der Zeit zu ^{charakterisieren1}. Für nicht-invasive Anwendungen ermöglicht CLM die Echtzeit-Bildgebung der vorderen Augenoberfläche, um Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie Liposomen vom selben Tier im Auge verteilt sind....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3