Imagerie spatio-temporelle in vivo de systèmes d’administration de médicaments oculaires à l’aide d’une microendoscopie laser confocale à fibre optique

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des liposomes dans l’œil après injection sous-conjonctivale.

Résumé

L’injection sous-conjonctivale est une voie attrayante pour administrer des médicaments oculaires en raison de l’accès transscléral facile qui contourne les barrières oculaires antérieures, telles que la cornée et la conjonctive. Bien que les effets thérapeutiques et la pharmacocinétique des médicaments lors de l’injection sous-conjonctivale aient été décrits dans certaines études, très peu évaluent la distribution oculaire des médicaments ou des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Ce dernier est essentiel pour l’optimisation de la conception du DDS intraoculaire et de la biodisponibilité du médicament afin d’obtenir la localisation oculaire souhaitée et la durée d’action (par exemple, aiguë ou prolongée). Cette étude établit l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier qualitativement la distribution oculaire des liposomes fluorescents en temps réel chez des souris vivantes après injection sous-conjonctivale. Conçu pour l’inspection visuelle in vivo des tissus au niveau microscopique, il s’agit également de la première description complète de la méthode d’imagerie CLM pour étudier la distribution spatio-temporelle des injectables dans l’œil après injection sous-conjonctivale.

Introduction

La clairance sanguine, la distribution tissulaire et l’occupation cible des médicaments dans les systèmes vivants sont des piliers pour comprendre la disposition in vivo des médicaments. Dans les modèles animaux précliniques, ces paramètres sont généralement évalués par des prélèvements sanguins et tissulaires fréquents à des moments particuliers après l’administration du médicament. Cependant, ces procédures sont généralement invasives, incluent souvent des mesures de non-survie et nécessitent de grandes cohortes d’animaux pour l’alimentation statistique. Il peut y avoir des coûts et du temps supplémentaires, ainsi que des préoccupations éthiques pour l’utilisation excessive d’animaux. En conséquence, l’imagerie non invasive devient rapidement une étape essentielle dans les études sur les biodistributions. La microendoscopie laser confocale (^CLM1,2) est bien adaptée aux applications oculaires pour imager de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des produits thérapeutiques dans les yeux d’animaux vivants avec une sensibilité et une résolution ^{élevées1,3,4}.

Le CLM a le potentiel de faciliter le dépistage robuste des systèmes d’administration de médicaments oculaires (DDS), tels que les liposomes, avant la quantification complète du DDS et la biodisponibilité des médicaments. Les liposomes sont attrayants pour leur flexibilité dans le réglage de leurs propriétés physico-chimiques et biophysiques5,6,7,8,9,10,11 pour encapsuler une grande variété de cargaisons thérapeutiques et contrôler le site tissulaire de libération du médicament et la durée d’action. Les liposomes ont été utilisés dans des applications oculaires pour l’administration de grosses molécules, telles que l’anticorps monoclonal bevacizumab12, et de petites molécules comme la cyclosporine13 et le ganciclovir14. Les liposomes chargés de médicaments ont des demi-vies biologiques plus longues et des effets thérapeutiques prolongés par rapport aux formulations non liposomiques de « médicaments libres ». Cependant, la distribution des médicaments dans le tissu oculaire est généralement extrapolée à partir des concentrations de médicaments dans les composants fluides de l’œil (c.-à-d. le sang, l’humeur aqueuse et l’humeur vitrée15,16,17). Comme le devenir initial in vivo de la cargaison de médicament chargée est défini par les propriétés du nanotransporteur lui-même, l’imagerie CLM des liposomes fluorescents peut servir de substitut au médicament pour révéler le ciblage tissulaire et les temps de résidence tissulaire in situ. En outre, les preuves visuelles de l’administration avec CLM peuvent orienter la refonte du DDS, évaluer les avantages thérapeutiques du médicament et peut-être même prédire les événements biologiques indésirables (par exemple, la toxicité tissulaire due à la localisation indésirable du DDS pendant de longues périodes).

Ici, une procédure étape par étape est détaillée sur la façon d’étudier la biodistribution oculaire des liposomes chez les souris vivantes avec un système CLM à double bande. Ce système CLM spécifique peut détecter la fluorescence bicolore (avec des lasers d’excitation vert et rouge à 488 nm et 660 nm) en temps réel, avec une fréquence de 8 images / s. En plaçant physiquement la sonde de détection sur l’œil, le protocole démontre l’acquisition d’images et l’analyse de liposomes fluorescents verts lors de l’administration sous-conjonctivale chez des souris pré-injectées par voie intraveineuse (IV) avec un colorant Evans Blue (EB) à 2%. Le colorant EB aide à visualiser les structures vascularisées dans le canal de fluorescence rouge. Nous montrons les résultats représentatifs d’une étude évaluant des liposomes neutres de 100 nm composés du phospholipide POPC (c.-à-d. 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine) et dopés avec du phospholipide Fl-DHPE marqué à la fluorescéine (c.-à-d. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoéthanolamine) à un rapport de 95 % POPC : 5 % Fl-DHPE (Figure 1B ). Le CLM est capable de capturer les liposomes verts marqués à la fluorescéine à une résolution axiale de 15 μm et latérale de 3,30 μm par délimitation des limites des tissus oculaires colorés par EB.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de SingHealth (Singapour). Des souris femelles C57BL/6 J (âgées de 6 à 8 semaines; 18 à 20 g) ont été obtenues à InVivos, à Singapour, et logées dans un vivarium à température et à lumière contrôlées de la Duke-NUS Medical School, à Singapour. Les animaux ont été traités conformément aux lignes directrices de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

REMARQUE : Un organigramme mettant en évidence les principales procédures est illustré à la figure 2.

1. Préparation d’agents de contraste: Evans Blue (EB) et liposomes

1. Pour une solution de colorant EB à 2%, dissoudre 1 g d’EB dans 50 mL de solution saline stérile. Filtrer la solution à l’aide de filtres de 0,22 μm dans des tubes stériles de 1,5 mL et les stocker à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
2. Pour les liposomes fluorescents verts, ajouter POPC/Fl-DHPE (95:5), chloroforme/méthanol (2:1) dans une fiole à fond rond de 100 mL. Utilisez un évaporateur rotatif à 150 tr/min à 40 °C pendant 1 h, avec un vide maintenu à 0 ^mbar1 pour créer un film lipidique mince.
   REMARQUE: Lorsque vous comparez les effets des propriétés liposomales (p. ex., taille, charge, saturation lipidique, longueur de la chaîne lipidique) sur la distribution, maintenir un pourcentage fixe de Fl-DHPE ou d’autres lipides fluorescents pour confirmer que les résultats observés sont dus à l’effet des propriétés testées et non à la charge variable de grands colorants hydrophobes.
3. Hydrater le film lipidique avec une solution saline tamponnée au phosphate (pour obtenir 26,3 mM de liposomes fluorescents) à 40 °C pour former des vésicules multilamellaires (MLV). Chargez les MLV dans une seringue en verre pour l’extrusion manuelle (30 fois à l’aide d’un filtre en polycarbonate de 0,08 μm de taille de pore) pour atteindre la taille souhaitée de 100 nm.
   REMARQUE: La température d’hydratation doit être supérieure à la température de transition des lipides.
4. Filtrez les liposomes en les faisant passer à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm. Confirmer le diamètre hydrodynamique (_DH) des liposomes à l’aide d’un système de diffusion dynamique de la lumière.

2. Administration d’EB et de liposomes chez des souris vivantes

1. Injecter à la souris l’EB IV (intraveineuse) par la veine caudale (2,5 mg/kg), 2 h avant l’injection sous-conjonctivale.
2. Pour l’injection sous-conjonctivale, commencez par calmer la souris en utilisant 5% d’isoflurane par inhalation dans une chambre d’induction pour obtenir un plan d’anesthésie adéquat. Transférer la souris dans un cône de nez et maintenir la sédation à 2% -2,5% d’isoflurane sur un coussin chauffant tout au long de la procédure.
3. Couper les moustaches près de l’œil à injecter et instiller une goutte d’anesthésique topique 0,5% de solution de chlorhydrate de métacaraïne directement sur l’œil.
4. Charger une seringue en verre de 10 μL (avec aiguille de 32 G) avec des liposomes fluorescents (Fl-DHPE: 0,78 mg / kg) et dissiper toutes les bulles d’air dans la seringue avant l’injection.
   REMARQUE: Jusqu’à 20 μL d’injectate peuvent être logés dans l’espace sous-conjonctival des ^souris18,19.
5. À l’aide d’une pince, soulevez légèrement la conjonctive et injectez lentement dans l’espace sous-conjonctival (Figure 1A). Retirez l’aiguille lentement pour éviter tout reflux. Assurez-vous qu’un bleb visible rempli de liposomes fluorescents est formé (Figure 1C).
6. Administrer une goutte d’antibiotique 1% d’acide fusidique sur l’œil après l’injection et surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.

3. Configuration du CLM

1. Allumez le système CLM et assurez-vous que le connecteur et l’extrémité distale de la sonde de balayage sont propres.
2. Nettoyez le connecteur de la sonde de balayage à l’aide d’un nettoyeur de connecteur optique en suivant les instructions du fabricant.
   1. Appuyez sur le rachet (souvent coloré) du nettoyeur de connecteur optique pour révéler un ruban de nettoyage.
   2. Placez le connecteur en contact avec le ruban de nettoyage et faites glisser le connecteur le long du ruban tout en maintenant le contact.
3. Nettoyez l’embout distal (également appelé embout de balayage) de la sonde en le trempant dans la solution nettoyante, suivie de la solution de rinçage fournie par le fabricant. Un applicateur de pointe en coton peut également être utilisé pour un nettoyage plus approfondi si la pointe est très sale.
4. Connectez la sonde au système CLM. Choisissez le champ de vision (FOV) et l’emplacement des fichiers d’acquisition à ce stade.
   REMARQUE: Ajustez l’intensité du laser à cette étape pour vous assurer que la détection de fluorescence pour Fl-DHPE est dans la plage linéaire. L’intensité du laser doit rester constante pour la comparaison entre les images prises à différents moments.
5. Laissez le système se réchauffer pendant 15 minutes comme indiqué et utilisez le kit d’étalonnage pour calibrer le système conformément aux instructions du fabricant.
   REMARQUE: Dans le kit d’étalonnage, il y a trois flacons pour chaque laser contenant les solutions suivantes: solution nettoyante, solution de rinçage et solution de fluorophore 488/660 nm pour l’étalonnage interne. Les étapes d’étalonnage sont demandées par le système et doivent être suivies en conséquence.
   1. Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Laissez-le en l’air pour l’enregistrement en arrière-plan pour les deux canaux.
      REMARQUE: Cette étape est très cruciale car elle normalise les valeurs d’arrière-plan des différentes fibres de la sonde et assure l’uniformité de l’image.
   2. Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Immergez la pointe dans un flacon de fluorophore de 488 nm pendant 5 secondes pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.
   3. Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Immergez la pointe dans le flacon de rinçage jusqu’au signal de fluorescence enregistré au point 3.5.2. Disparaît. Plongez la pointe dans un flacon de fluorophore de 660 nm pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.
      REMARQUE: Suivez toutes les étapes d’étalonnage afin d’obtenir un étalonnage correct et une qualité d’image optimale.
6. Après avoir étalonné la sonde, vérifiez que les valeurs d’arrière-plan des sondes sont aussi basses que possible. Pour le système CLM utilisé, maintenez les valeurs d’arrière-plan en dessous de 100. Effectuez un nettoyage répété de la sonde à l’aide d’un applicateur à pointe en coton et un étalonnage si les valeurs sont supérieures à 100/valeur utilisateur définie ou si la sonde semble sale. Il s’agit de s’assurer que le bruit de fond est conservé à peu près à la même valeur.
   REMARQUE : Il est important de définir la valeur d’arrière-plan maximale (par exemple, 100 comme indiqué à l’étape 3.6) pour vous assurer que les conditions de la sonde sont similaires. Cela permettra une comparaison quantitative appropriée entre les images prises à différents moments. La valeur peut différer selon les systèmes et les conditions de la sonde.
7. Allumez le régulateur de température animal (ATC). Réglez l’ATC à 37 °C. Couvrez le coussin chauffant avec un drap chirurgical et fixez le cône de nez sur le coussin chauffant.
   REMARQUE: ATC avec un coussin chauffant attaché est nécessaire pour s’assurer que l’animal est maintenu au chaud pendant toute la durée de l’imagerie.
8. Fixez le support du microscope à dissection sur le dessus de la table pour le fixer. Faites pivoter et ajustez l’oculaire du microscope pour voir l’œil de la souris de manière ergonomique à travers l’oculaire lorsque l’utilisateur est assis (effectuez les ajustements après avoir placé l’animal).
9. Calmer la souris en utilisant 5% d’isoflurane dans une chambre à induction. Transférer la souris dans le cône du nez une fois que l’animal ne réagit pas et maintenir la sédation à 2% -2,5% d’isoflurane pendant qu’il est sur un coussin chauffant tout au long de la procédure.
10. Couper les moustaches de la souris et instiller une goutte de solution anesthésique de 0,5% de chlorhydrate de métamétacine sur l’œil.
11. Pour vous assurer que les yeux sont propres, laissez tomber quelques gouttes de solution saline pour laver la surface oculaire.
12. Ajustez le microscope de sorte que l’œil de la souris soit en mise au point directe à un grossissement de 0,67x.
    REMARQUE: Assurez-vous de lubrifier les yeux avec une solution saline. Si les yeux ne sont pas lubrifiés tout au long de la séance d’imagerie, ils peuvent devenir secs, ce qui provoque la cristallisation de la lentille. En conséquence, lors de l’imagerie CLM, la lentille peut émettre une fluorescence rouge de fond.

4. Imagerie en direct des yeux de souris avec CLM et acquisition

1. Allumez le laser, placez la sonde sur l’œil et commencez à enregistrer l’acquisition pour observer la fluorescence dans l’œil aux régions indiquées sur la carte oculaire de la figure 3.
   REMARQUE: Tenez la sonde comme un stylo avec l’extrémité distale de la sonde directement sur la région à imager.
2. Arrêtez l’enregistrement lorsque toutes les régions ont été marquées et étiquetées. Les fichiers d’acquisition seront enregistrés automatiquement à l’emplacement choisi à l’étape 3.4.
   REMARQUE: Le fichier sera enregistré en tant que fichier vidéo qui peut être exporté vers des images individuelles. Étiquetez le drapeau en fonction de la carte des yeux pour connaître exactement l’emplacement de la sonde à la trame exacte où l’enregistrement a été effectué.

5. Analyse d’images

1. À l’aide du même logiciel d’acquisition CLM, exportez les fichiers d’acquisition d’images pour une analyse plus approfondie. Cliquez sur File | Exportez et choisissez le format vers lequel exporter. Les fichiers au format Mkt permettront d’ajuster la table de recherche (LUT) et d’autres exportations vers des formats de fichiers image à l’aide du logiciel de visualisation CLM.
2. Pour une comparaison précise de l’intensité de fluorescence, utilisez la même LUT ajustée pour chaque canal lors de l’exportation de tous les fichiers image.
   REMARQUE: Choisissez le seuil de LUT minimum et maximum par rapport à ceux de la souris témoin (sans liposomes injectés) pour minimiser les lectures de fluorescence de fond.
3. Ouvrez l’image dans un logiciel de traitement d’image / logiciel gratuit approprié (par exemple, ImageJ). Dessinez la région d’intérêt (ROI).
   REMARQUE: Le retour sur investissement fait ici référence à la région d’intérêt dans le programme de traitement. Dans la plupart des cas, le retour sur investissement sera l’ensemble de l’image numérisée. Cependant, dans le cas de l’imagerie du limbe, la sonde ne peut pas simplement obtenir l’image du limbe séparément. Par conséquent, un retour sur investissement doit être dessiné pour « quantifier » la fluorescence dans la région des limbes, comme indiqué à la figure 4. Pour que le retour sur investissement reste cohérent, utilisez le même retour sur investissement pour toutes les images.
4. Mesurez et enregistrez les valeurs de retour sur investissement pour la fluorescence verte. Entrez les valeurs dans une feuille de calcul. Tabulez les valeurs moyennes et d’intensité de fluorescence (a.u.) du roi.

6. Évaluation histologique

1. Euthanasier la souris en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC local.
2. Énucléez l’œil et fixez l’œil dans 1 mL de solution de formaldéhyde à 4 % ou de formol à 10 % pendant la nuit.
3. Coupez l’excès de graisse et incorporez l’œil dans le composé optimal de température de coupe (OCT) et conservez-le congelé dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins un jour.
4. Couper des sections de 5 μm d’épaisseur dans le cryostat avec une température de coupe maintenue à 20 °C. Transférez la section sur une lame de microscope revêtue de poly-L-lysine.
   REMARQUE: L’histologie peut servir de validation supplémentaire de la distribution de DDS. Cependant, cela nécessite une optimisation supplémentaire, une expertise technique et des sacrifices d’animaux que l’étude vise à réduire en utilisant CLM.

Résultats

Le protocole démontre l’utilité de la CLM pour évaluer la distribution oculaire spatio-temporale des liposomes fluorescents verts administrés par injection sous-conjonctivale. Pour tirer parti de la capacité bicolore (longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 660 nm) du système CLM, des liposomes POPC neutres de 100 nm à injecter ont été dopés avec 5% de Fl-DHPE (les données de composition et de caractérisation sont montrées à la figure 1B), et EB a été injecté IV pou...

Discussion

Comme le montrent les résultats, CLM fournit une méthode simple et réalisable pour imager la distribution oculaire des liposomes dans l’œil. Nous avons déjà démontré l’utilisation du CLM pour caractériser la localisation de diverses formulations liposomales dans l’œil de la souris au fil du ^temps1. Pour les applications non invasives, le CLM permet une imagerie en temps réel de la surface oculaire antérieure pour mieux comprendre comment les liposomes sont distribués dans l’œ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3