Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Özet

Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Subkonjonktival enjeksiyon, kornea ve konjonktiva gibi ön oküler bariyerleri atlayan kolay trans-skleral erişim nedeniyle oküler ilaçları uygulamak için çekici bir yoldur. Subkonjonktival enjeksiyon üzerine ilaçların terapötik etkileri ve farmakokinetiği bazı çalışmalarda tanımlanmış olmakla birlikte, çok azı ilaçların veya ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) oküler dağılımını değerlendirmemektedir. İkincisi, istenen oküler lokalizasyonu ve etki süresini (örneğin, akut ve uzun süreli) elde etmek için göz içi DDS tasarımının ve ilaç biyoyararlanımının optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu çalışma, floresan lipozomların konjonktival enjeksiyondan sonra canlı farelerde gerçek zamanlı olarak oküler dağılımını niteliksel olarak incelemek için fiberoptik konfokal lazer mikroendoskopi (CLM) kullanımını ortaya çıkarmaktadır. Mikroskobik düzeyde dokuların in vivo görsel muayenesi için tasarlanan bu, aynı zamanda subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki enjekte edilebilirlerin mekano-zamansal dağılımını incelemek için CLM görüntüleme yönteminin ilk tam açıklamasıdır.

Giriş

Canlı sistemlerde ilaçların kan klirensi, doku dağılımı ve hedef doluluğu in vivo ilaç eğilimini anlamanın temel direğidir. Preklinik hayvan modellerinde, bu parametreler tipik olarak ilaç uygulama sonrası belirli zaman noktalarında sık kan ve doku örneklemesi ile değerlendirilir. Bununla birlikte, bu prosedürler genellikle istilacıdır, genellikle hayatta kalma dışı ölçümleri içerir ve istatistiksel güçlenme için büyük hayvan kohortları gerektirir. Hayvanların aşırı kullanımı için etik kaygıların yanı sıra ekstra maliyet ve zaman olabilir. Sonuç olarak, non-invaziv görüntüleme hızla biyodistributions çalışmalarında ayrılmaz bir adım haline gelmektedir. Konfokal lazer miksoskopi (^CLM1,2), yüksek hassasiyetli ve yüksek çözünürlüklü canlı hayvanların gözünde terapötiklerin mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyen oküler uygulamalar için çok ^{uygundur1,3,4}.

CLM, DDS'nin kapsamlı ölçülmesi ve ilaç biyoyararlanımdan önce lipozomlar gibi oküler ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) sağlam taramasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir. Lipozomlar, çok çeşitli terapötik kargoları kapsüllemek ve ilaç salınımının doku bölgesini ve etki süresini ^{kontrol etmek için} fizikokimyasal ve biyofiziksel ^{özelliklerini} ayarlamadaki esneklikleri için çekicidir. Lipozomlar, monoklonal antikor bevacizumab12 gibi büyük moleküllerin ve siklosporin13 ve ganciclovir14 gibi küçük moleküllerin teslimi için oküler uygulamalarda kullanılmıştır. İlaç yüklü lipozomlar, lipozomal olmayan "serbest ilaç" formülasyonlarına kıyasla daha uzun biyolojik yarı ömürlere ve uzun süreli terapötik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, oküler dokudaki ilaç dağılımı tipik olarak gözün sıvı bileşenlerindeki ilaç konsantrasyonlarından (yani kan, sulu mizah ve vitreus ^{mizahı15,16,17}) tahmin edilir. Yüklü ilaç kargosunun ilk in vivo kaderi nanokarrierin özellikleri ile tanımlandığı için, floresan lipozomların CLM görüntülemesi, ilacın doku hedeflemesini ve yerinde doku ikamet sürelerini ortaya çıkarmak için bir taşıyıcı görevi görebilirsiniz. Ayrıca, CLM ile doğumun görsel kanıtları DDS'nin yeniden tasarlanmasını yönlendirebilir, ilacın terapötik faydalarını değerlendirebilir ve hatta belki de olumsuz biyolojik olayları tahmin edebilir (örneğin, DDS'nin uzun süre istenmeyen lokalizasyonuna bağlı doku toksisitesi).

Burada, çift bantlı CLM sistemine sahip canlı farelerde lipozomların oküler biyodistribasyonunun nasıl incelenerek incelenerek adım adım bir prosedür detaylandırılır. Bu özel CLM sistemi, iki renkli floresanları (488 nm ve 660 nm'de yeşil ve kırmızı heyecan lazerleri ile) gerçek zamanlı olarak, 8 kare /s frekansta algılayabilir. Algılama probunun göze fiziksel olarak yerleştirilmesiyle protokol, %2 Evans Blue (EB) boyası ile intravenöz (IV) önceden enjekte edilen farelerde subkonjonktival uygulama üzerine yeşil floresan lipozomların görüntü alımını ve analizini göstermektedir. EB boyası kırmızı floresan kanalındaki damarlı yapıların görselleştirilmesine yardımcı olur. Fosfolipid POPC'den (yani, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin) oluşan ve floresan etiketli fosfolipid Fl-DHPE (örneğin, N-(floresan-5-tiyokarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glisero-3-fosfotianolamin) % 95 POPC: % 5 Fl-DHPE (Şekil 1B) ). CLM, EB lekeli oküler doku sınırlarının tanımlaması ile yeşil floresan etiketli lipozomları 15 μm eksenel ve 3,30 μm yanal çözünürlükte yakalayabilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler SingHealth'teki (Singapur) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dişi C57BL/6 J fareler (6- 8 haftalık; 18-20 g) InVivos, Singapur'dan elde edildi ve Singapur Duke-NUS Tıp Fakültesi'nin sıcaklık ve ışık kontrollü vivariumunda barındırıldı. Hayvanlar, oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) açıklamasından alınan kılavuza uygun olarak tedavi edildi.

NOT: Şekil 2'de ana yordamları vurgulayan bir akış şeması gösterilmiştir.

1. Kontrast ajanların hazırlanması: Evans Blue (EB) ve lipozomlar

1. % 2 EB boya çözeltisi için, 50 mL steril salin içinde 1 g EB çözün. Çözeltiyi 0,22 μm filtre kullanarak 1,5 mL steril tüplere filtreleyin ve daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın.
2. Yeşil floresan lipozomlar için 100 mL yuvarlak alt şişeye POPC/Fl-DHPE (95:5), kloroform/metanol (2:1) ekleyin. İnce bir lipit filmi oluşturmak için 0 mbar1'de vakumla 1 saat boyunca 40 °C'de ¹⁵⁰ rpm'de bir döner evaporatör kullanın.
   NOT: Lipozomal özelliklerin (örneğin, boyut, yük, lipid doygunluğu, lipid zinciri uzunluğu) dağıtım üzerindeki etkilerini karşılaştırırken, gözlemlenen sonuçların büyük hidrofobik boyaların değişken yükünden değil, test edilen özelliklerin etkisinden kaynaklandığını doğrulamak için Fl-DHPE veya diğer floresan lipitlerin sabit bir yüzdesini koruyun.
3. Lipid filmini fosfat tamponlu salinle (26,3 mM floresan lipozom elde etmek için) 40 °C'de çok lameller veziklin (MLV) oluşturmak için nemlendirin. İstenilen 100 nm boyutuna ulaşmak için MLV'leri manuel ekstrüzyon için bir cam şırınna (0,08 μm gözenek boyutu polikarbonat filtre kullanarak 30 kez) yükleyin.
   NOT: Hidrasyon sıcaklığı lipitlerin geçiş sıcaklığından daha yüksek olmalıdır.
4. Lipozomları 0,22 μm steril şırıng filtresinden geçirerek filtreleyin. Dinamik bir ışık saçılma sistemi kullanarak lipozomların hidrodinamik çapını (_DH) onaylayın.

2. Canlı farelerde EB ve lipozomların yönetimi

1. Fareye kuyruk damarı (2,5 mg/kg), subkonjonktival enjeksiyondan önce 2 saat EB IV (intravenöz) enjekte edin.
2. Subkonjonktival enjeksiyon için, ilk olarak, yeterli bir anestezi düzlemi elde etmek için bir indüksiyon odasında soluma yoluyla% 5 izofluran kullanarak fareyi yatıştırın. Fareyi bir burun konisine aktarın ve işlem boyunca bir ısıtma yastığındayken izofluranların% 2-2.5'inde sedasyon sağlayın.
3. Enjekte edilecek gözün yakınındaki bıyıkları kırpın ve bir damla topikal anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisini doğrudan göze aşılayın.
4. Floresan lipozomlarla (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) 10 μL cam şırınga (32 G iğne ile) yükleyin ve enjeksiyondan önce şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını dağıtın.
   NOT: Farelerin altjonktival alanında 20 μL'ye kadar enjekte ^{edilebilir18,19}.
5. Cımbız kullanarak konjonktivayı hafifçe kaldırın ve altjonktival alana yavaşça enjekte edin (Şekil 1A). Geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça çekin. Floresan lipozomlarla dolu görünür bir bleb oluştuğundan emin olun (Şekil 1C).
6. Enjeksiyondan sonra göze bir damla antibiyotik% 1 fusidik asit sürün ve fareyi kendine gelene kadar izleyin.

3. CLM kurulumu

1. CLM sistemini kapatın ve tarama probunun hem konektörünün hem de distal ucunun temiz olduğundan emin olun.
2. Tarama probunun konektörünü, üreticinin yönergelerini izleyerek optik konektör temizleyicisi kullanarak temizleyin.
   1. Temizleme şeridini ortaya çıkarmak için optik konektör temizleyicisinin tırmıklarına (genellikle renkli) basın.
   2. Bağlayıcıyı temizleme şeridiyle temas halinde konumlandırın ve bağlantıyı korurken bağlayıcıyı şerit boyunca kaydırın.
3. Probun distal ucunu (tarama ucu olarak da bilinir) temizleme çözeltisine ve ardından üretici tarafından sağlanan durulama çözeltisine batırarak temizleyin. Uç çok kirliyse daha kapsamlı temizlik için pamuklu uç aplikatörü de kullanılabilir.
4. Sondayı CLM sistemine bağlayın. Bu noktada görüş alanını (FOV) ve edinme dosyalarının konumunu seçin.
   NOT: Fl-DHPE için floresan algılamanın doğrusal aralıkta olduğundan emin olmak için bu adımda lazer yoğunluğunu ayarlayın. Lazer yoğunluğu, farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında karşılaştırma için tutarlı tutulmalıdır.
5. Sistemin söylendiği gibi 15 dakika ısınmasına izin verin ve kalibrasyon kitini kullanarak sistemi üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
   NOT: Kalibrasyon kitinde, her lazer için aşağıdaki çözümleri içeren üç şişe vardır: temizleme çözeltisi, durulama çözeltisi ve dahili kalibrasyon için florofor 488/660 nm çözeltisi. Kalibrasyon adımları sistem tarafından istenir ve buna göre takip edilmelidir.
   1. Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Her iki kanal için arka plan kaydı için havada bırakın.
      NOT: Bu adım, probun farklı liflerinden arka plan değerlerini normalleştirdiği ve görüntü homojenliğini sağladığı için çok önemlidir.
   2. Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu 5 saniye boyunca florofor 488 nm şişeye daldırın.
   3. Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Ucu durulama şişesinin içine 3.5.2'de kaydedilen floresan sinyaline kadar daldırin. Kaybolur. Probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu florofor 660 nm şişeye daldırın.
      NOT: Uygun kalibrasyon ve optimum görüntü kalitesi elde etmek için tüm kalibrasyon adımlarını izleyin.
6. Probu kalibre ettikten sonra, probların arka plan değerlerinin mümkün olduğunca düşük olduğundan emin olun. Kullanılan CLM sistemi için arka plan değerlerini 100'ün altında tutun. Değerler 100/tanımlı kullanıcı değerinin üzerindeyse veya prob kirli görünüyorsa, probun pamuk ucu aplikatörü ve kalibrasyon ile tekrarlanan temizliğini gerçekleştirin. Bu, arka plan gürültüsünün aynı değer etrafında tutulmasını sağlamaktır.
   NOT: Araştırma koşullarının benzer olduğundan emin olmak için maksimum arka plan değerini (örneğin, adım 3.6'da belirtildiği gibi 100) tanımlamak önemlidir. Bu, farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında uygun nicel karşılaştırmaya izin verecektir. Değer farklı sistemlerde ve prob koşullarında farklılık gösterebilir.
7. Hayvan sıcaklığı kontrol cihazını (ATC) kapatın. ATC'yi 37 °C'ye ayarlayın. Isıtma yastığını cerrahi bir örtü ile örtün ve burun konisini ısıtma yastığına sabitleyin.
   NOT: Hayvanın görüntüleme süresi boyunca sıcak tutulmasını sağlamak için ekli bir ısıtma yastığına sahip ATC gereklidir.
8. Parçalama mikroskopunun standını sabitlemek için masanın tepesine sıkıştırın. Kullanıcı oturduğunda fare gözünü göz merceğinden ergonomik olarak görüntülemek için mikroskobun göz merceğini döndürün ve ayarlayın (hayvanı yerleştirdikten sonra ayarlamaları yapın).
9. Bir indüksiyon odasında% 5 izofluran kullanarak fareyi yatıştırın. Hayvan yanıt vermiyorsa fareyi burun konisine aktarın ve işlem boyunca bir ısıtma yastığındayken sedasyonu% 2-% 2.5 izofluranda tutun.
10. Farenin bıyıklarını kırpın ve göze bir damla anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisi aşılayın.
11. Gözlerin temiz olduğundan emin olmak için, oküler yüzeyi yıkamak için birkaç damla salin bırakın.
12. Mikroskobu, fare gözünün 0,67x büyütmede doğrudan odakta olacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Gözleri tuzlu suyla yağlamayı unutmayın. Gözler görüntüleme seansı boyunca yağlanmazsa, kuruyarak lensin kristalleşmesine neden olabilirler. Sonuç olarak, CLM görüntüleme sırasında lens arka plan kırmızı floresan yayabilir.

4. CLM ve edinim ile fare gözlerinin canlı görüntülenmesi

1. Lazeri açın, probu göze yerleştirin ve Şekil 3'te göz haritasında belirtilen bölgelerde gözdeki floresanları gözlemlemek için kazanımı kaydetmeye başlayın.
   NOT: Probu, probun distal ucuyla birlikte bir kalem gibi doğrudan görüntülenecek bölgeye tutun.
2. Tüm bölgeler işaretlendiğinde ve etiketlendiğinde kaydı durdurun. Edinme dosyaları, adım 3.4'te seçilen dosya konumuna otomatik olarak kaydedilir.
   NOT: Dosya, tek tek görüntülere dışa aktarılabilen bir video dosyası olarak kaydedilecektir. Kaydın yapıldığı çerçevede sondanın tam olarak yerini bilmek için bayrağı göz haritasına göre etiketleyin.

5. Görüntü analizi

1. Aynı CLM alma yazılımını kullanarak, daha fazla analiz için görüntü alma dosyalarını dışa aktarın. Dosya | tıklayın Dışa aktar ve dışa aktarılacak biçimi seçin. Mkt biçimli dosyalar, arama tablosunun (LUT) ayarlanmasında ve CLM görüntüleyici yazılımını kullanarak görüntü dosyası biçimlerine daha fazla dışa aktarmaya izin verecektir.
2. Floresan yoğunluğunun doğru karşılaştırması için, tüm görüntü dosyalarını dışa aktarırken her kanal için ayarlanmış aynı LUT'i kullanın.
   NOT: Arka plan floresan okumalarını en aza indirmek için kontrol faresininkilerle ilgili minimum ve maksimum LUT eşiğini (lipozom enjekte etmeden) seçin.
3. Görüntüyü uygun bir görüntü işleme yazılımında/ücretsiz programında açın (ör. ImageJ). İlgi alanı çizin (yatırım getirisi).
   NOT: Buradaki yatırım getirisi, işleme programına ilgi alanı anlamına gelir. Çoğu durumda, yatırım getirisi taranan görüntünün tamamı olacaktır. Bununla birlikte, limbüsün görüntülenmesi durumunda, prob sadece limbüsün görüntüsünü ayrı ayrı alamaz. Bu nedenle, Şekil 4'te çizildiği gibi limbus bölgesindeki floresan 'ölçmek' için bir yatırım getirisi çizilmelidir. Yatırım getirisini tutarlı tutmak için tüm görüntülerde aynı yatırım getirisini kullanın.
4. Yeşil floresan için yatırım getirisi değerlerini ölçün ve kaydedin. Değerleri elektronik tabloya girin. Yatırım getirisinin ortalama ve floresan yoğunluğu (a.u.) değerlerini tablola.

6. Histoloji değerlendirmesi

1. Yerel IACUC tarafından onaylanan bir yöntem kullanarak fareyi ötenazi.
2. Gözü enükle edin ve gözü bir gecede% 4 formaldehit veya% 10 formalin çözeltisinin 1 mL'sinde sabitle.
3. Fazla yağları kesin ve gözü Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve en az bir gün boyunca -80 °C dondurucuda donmuş halde tutun.
4. Kriyostattaki 5 μm kalınlığındaki kesme bölümleri ve kesme sıcaklığı 20 °C'de tutulur. Bölümü Poli-L-Lizin kaplı mikroskop kaydırağı ile aktarın.
   NOT: Histoloji, DDS dağıtımının ek doğrulaması olarak hizmet edebilir. Bununla birlikte, çalışmanın CLM kullanarak azaltmayı amaçladığı ek optimizasyon, teknik uzmanlık ve hayvanların kurban edilmesi gerekir.

Sonuçlar

Protokol, subkonjonktival enjeksiyon yoluyla uygulanan yeşil floresan lipozomların mekano-zamansal oküler dağılımını değerlendirmek için CLM'nin yararını göstermektedir. CLM sisteminin çift renkli yeteneğinden (488 nm ve 660 nm ekscitasyon dalga boyları) yararlanmak için, enjekte edilecek 100 nm nötr POPC lipozomlarına% 5 Fl-DHPE (kompozisyon ve karakterizasyon verileri Şekil 1B'de gösterilmiştir) ve EB'ye gözdeki yer işaretlerini tanımlamak için IV enjekte edildi. ...

Tartışmalar

Sonuçlardan da anlaşılır gibi CLM, gözdeki lipozomların oküler dağılımını görüntüleyen basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Daha önce clm'nin fare gözü içindeki çeşitli lipozomal formülasyonların zaman içinde lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanıldığını ^{göstermiştik1}. İstilacı olmayan uygulamalar için CLM, lipozomların aynı hayvandan göze nasıl dağıtıldığı hakkında bilgi için ön oküler yüzeyin gerçek zamanlı görüntülenmesini iz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3