Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.

Abstract

הזרקה תת-ימית היא דרך אטרקטיבית למתן תרופות עיניות בשל גישה טרנס-סקלרלית קלה העוקפת מחסומי עיניים קדמיים, כגון הקרנית והלחמית. בעוד השפעות טיפוליות ופרמקוקינטיקה של התרופות על הזרקה תת-כיוונית תוארו במחקרים מסוימים, מעטים מאוד להעריך את ההפצה העין של תרופות או מערכות אספקת תרופות (DDS). זה האחרון הוא קריטי עבור אופטימיזציה של עיצוב DDS תוך עיני וזמינות ביולוגית סמים כדי להשיג את לוקליזציה העין הרצוי ומשך הפעולה (למשל, חריף לעומת ממושך). מחקר זה קובע את השימוש במיקרואנדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן איכותי את התפלגות העין של ליפוזומים פלואורסצנטיים בזמן אמת בעכברים חיים לאחר הזרקת תת-הלחמית. להיות מתוכנן לבדיקה חזותית ויוו של רקמות ברמה המיקרוסקופית, זהו גם התיאור המלא הראשון של שיטת ההדמיה CLM לחקור התפלגות מרחבית-זמנית של הזרקה בעין לאחר הזרקה תת-כיוונית.

Introduction

סיווג הדם, חלוקת הרקמות ותפוסת היעד של תרופות במערכות חיות הם עמודי התווך להבנה בטבע התרופה של vivo. במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, פרמטרים אלה מוערכים בדרך כלל על ידי דגימת דם ורקמות תכופה בנקודות זמן מסוימות לאחר מתן התרופה. עם זאת, הליכים אלה הם בדרך כלל פולשניים, לעתים קרובות כוללים מדידות שאינן הישרדות, ומחייבים קבוצות גדולות של בעלי חיים להנעה סטטיסטית. ייתכנו עלות וזמן נוספים, יחד עם חששות אתיים לשימוש מופרז בבעלי חיים. כתוצאה מכך, הדמיה לא פולשנית הופכת במהירות לצעד אינטגרלי במחקרים על ייחוס ביולוגי. מיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית (^CLM1,2) מתאימה היטב ליישומי עיניים כדי לדמיין באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של טיפולים בעיני בעלי חיים חיים בעלי רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה ^1,3,4.

CLM יש פוטנציאל להקל על הקרנה חזקה של מערכות אספקת תרופות עינית (DDS), כגון ליפוזומים, לפני כימות מקיף של DDS וזמינות ביולוגית סמים. ליפוזומים אטרקטיביים עבור הגמישות שלהם כוונון התכונות הפיזיקוכימיות והביופיסיות שלהם5,6,7,7,8,9,10,11 כדי לתמצת מגוון גדול של מטען טיפולי ולשלוט באתר הרקמה של שחרור סמים ומשך הפעולה. ליפוזומים שימשו ביישומים עיניים להעברת מולקולות גדולות, כגון נוגדן חד שבטי ^{אווסטין12}, ומולקולות קטנות כמו ציקלוספורין13 ו ganciclovir14. ליפוזומים טעונים בתרופות יש מחצית חיים ביולוגית ארוכה יותר, השפעות טיפוליות ממושכות לעומת ניסוחים "תרופה חופשית" לא ליפוזומית. עם זאת, הפצת סמים ברקמת העין מוערכת בדרך כלל מריכוז סמים ברכיבי נוזלים של העין (כלומר, דם, הומור מימי והומור זגוגי15,16,17). כמו הגורל הראשוני ב vivo של מטען התרופה טעון מוגדר על ידי המאפיינים של nanocarrier עצמו, הדמיה CLM של ליפוזומים פלואורסצנטי יכול לשמש פונדקאית עבור התרופה לחשוף מיקוד רקמות בזמני מגורים רקמה במקום. יתר על כן, ראיות חזותיות של משלוח עם CLM יכול לנווט DDS מחדש עיצוב, להעריך את היתרונות הטיפוליים של התרופה, ואולי אפילו לחזות אירועים ביולוגיים שליליים (למשל, רעילות רקמות עקב לוקליזציה לא רצויה של DDS לתקופות ממושכות של זמן).

להלן, הליך שלב אחר שלב מפורט על איך ללמוד את הייחוס הביולוגי העין של ליפוזומים בעכברים חיים עם מערכת CLM כפולת פסים. מערכת CLM ספציפית זו יכולה לזהות פלואורסצנטיות בשני צבעים (עם לייזרי עירור ירוקים ואדומים ב-488 ננומטר ו-660 ננומטר) בזמן אמת, בתדירות של 8 פריימים לשנייה. על ידי הצבה פיזית של גשושית הזיהוי על העין, הפרוטוקול מדגים רכישת תמונה וניתוח של ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים על ניהול תת-קומוניאלי בעכברים שהוזרקו מראש תוך ורידי (IV) עם 2% צבע כחול אוונס (EB). צבע EB מסייע לדמיין את המבנים הסקולריים בערוץ הפלואורסצנטיות האדום. אנו מציגים תוצאות מייצגות ממחקר המעריך 100 ננומטר ליפוזומים ניטרליים המורכבים מ- POPC פוספוליפידי (כלומר, 1-פלמיטואיל-2-אולואיל-גליצרו-3-פוספוצולין) ו מסוממים עם פוספוליפיד Fl-DHPE מתויג פלואורסצין (כלומר, N-(פלואורסצ'ין-5-תיוקרבאמול) -1,2-דיהקסה-דקנויל-גליצרו-3-פוספוטהנולמין) ביחס של 95% POPC: 5% Fl-DHPE (איור 1B ). CLM הוא מסוגל ללכוד את ליפוזומים מתויג פלואורסצ'ין ירוק ברזולוציה צירית 15 מיקרומטר ו 3.30 מיקרומטר לרוחב על ידי תיחום של גבולות רקמת העין מוכתמת EB.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) ב- SingHealth (סינגפור). נקבות C57BL/6 J עכברים (6- 8 שבועות; 18-20 גרם) התקבלו מ InVivos, סינגפור, ושוכנו ב טמפרטורה ויבריום מבוקר אור של בית הספר לרפואה דיוק-NUS, סינגפור. בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות האגודה לחקר הראייה ורפואת עיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

הערה: תרשים זרימה המדגיש את ההליכים העיקריים מוצג באיור 2.

1. הכנת חומרי ניגודיות: אוונס בלו (EB) וליפוזומים

1. לתמיסת צבע EB של 2% EB, יש להמיס 1 גרם של EB ב-50 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית. סנן את הפתרון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר לצינורות סטריליים בגודל 1.5 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.
2. לליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים, הוסיפו את POPC/Fl-DHPE (95:5), כלורופורם/מתנול (2:1) לבקבוקון תחתון עגול של 100 מ"ל. השתמש מאייד סיבובי ב 150 סל"ד ב 40 °C (50 °F) עבור 1 שעות, עם ואקום נשמר ב 0 ^mbar1 כדי ליצור סרט שומנים דק.
   הערה: בעת השוואת ההשפעות של תכונות liposomal (למשל, גודל, מטען, רוויית שומנים בדם, אורך שרשרת השומנים) על הפצה, לשמור על אחוז קבוע של Fl-DHPE או שומנים פלואורסצנטיים אחרים כדי לאשר כי התוצאות שנצפו נובעות ההשפעה של המאפיינים שנבדקו, ולא את העומס המשתנה של צבעים הידרופוביים גדולים.
3. לחות את סרט השומנים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (כדי להשיג 26.3 מ"מ של ליפוזומים פלואורסצנטיים) ב 40 °C (40 °F) כדי ליצור שלפוחיות רב lamellar (MLV). טען את MLVs לתוך מזרק זכוכית עבור שחול ידני (30 פעמים באמצעות מסנן פוליקרבונט בגודל 0.08 מיקרומטר) כדי להשיג את הגודל הרצוי של 100 ננומטר.
   הערה: הטמפרטורה עבור הידרציה חייבת להיות גבוהה יותר מטמפרטורת המעבר של השומנים.
4. לסנן את הליפוזומים על ידי העברתם דרך מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר. אשר את הקוטר ההידרודינמי (_DH) של הליפוזומים באמצעות מערכת פיזור אור דינמית.

2. ניהול של EB וליפוזומים בעכברים חיים

1. הזרק עכבר עם EB IV (תוך ורידי) דרך וריד הזנב (2.5 מ"ג / קילוגרם), 2 שעות לפני הזרקת תת-צינור.
2. עבור הזרקה תת-כיוונית, ראשית, להרדים את העכבר באמצעות 5% איזופלוריין באמצעות שאיפה בתא אינדוקציה כדי להשיג מישור נאות של הרדמה. מעבירים את העכבר לקונוס אף ושומרים על הרגעה ב-2%-2.5% איזופלוריין בזמן שאתם על כרית חימום לאורך כל ההליך.
3. לקצץ את השפם ליד העין כדי להיות מוזרק ולהחדיר טיפה של הרדמה אקטואלי 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון ישירות על העין.
4. לטעון מזרק זכוכית 10 μL (עם מחט 32 G) עם ליפוזומים פלואורסצנטיים (Fl-DHPE: 0.78 מ"ג / קילוגרם) ולהפיג את כל בועות האוויר במזרק לפני ההזרקה.
   הערה: עד 20 μL של הזרקה ניתן לאכלס בחלל התת-ימי של ^{עכברים18,19}.
5. באמצעות פינצטה, הרימו מעט את הלחמית והזריקו באיטיות לחלל התת-ימי (איור 1A). הסר את המחט לאט כדי למנוע זרימה אחורית. ודאו שנוצרת בלם גלוי מלא בליפוזומים פלואורסצנטיים (איור 1C).
6. תן טיפה של אנטיביוטיקה 1% חומצה fusidic על העין לאחר הזריקה לפקח על העכבר עד שהוא חוזר להכרה.

3. הגדרת CLM

1. הפעל את מערכת CLM וודא שגם המחבר וגם הקצה הדיסטלי של בדיקית הסריקה נקיים.
2. נקה את המחבר של בדיקית הסריקה באמצעות מנקה מחבר אופטי על-ידי ביצוע הוראות היצרן.
   1. לחץ על הראצ'ט (לעתים קרובות צבעוני) של מנקה המחברים האופטיים כדי לחשוף רצועת כלים לניקוי.
   2. מקם את המחבר במגע עם רצועת הכלים לניקוי והחלק את המחבר לאורך רצועת הכלים תוך שמירה על קשר.
3. נקו את הקצה הדיסטלי (הידוע גם כקצה הסריקה) של הגשושית על ידי טבילתו בתמיסת הניקוי, ואחריה פתרון השטיפה המסופק על ידי היצרן. אפליקטור קצה כותנה יכול לשמש גם לניקוי יסודי יותר אם הקצה מלוכלך מאוד.
4. חבר את הגשוש למערכת CLM. בחר את שדה הראייה (FOV) ואת המיקום עבור קבצי הרכישה בשלב זה.
   הערה: התאם את עוצמת הלייזר בשלב זה כדי להבטיח שזיהוי פלואורסצנטיות עבור Fl-DHPE נמצא בטווח הליניארי. יש לשמור על עוצמת הלייזר עקבית להשוואה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות.
5. אפשר למערכת להתחמם במשך 15 דקות לפי ההוראות והשתמש בערכת הכיול לכיול המערכת בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: בערכת הכיול, ישנם שלושה בקבוקונים לכל לייזר המכילים את הפתרונות הבאים: פתרון ניקוי, פתרון שטיפה ופתרון פלואורופור 488/660 ננומטר לכיול פנימי. שלבי הכיול מתבקשים על-ידי המערכת ויש לבצעם בהתאם.
   1. טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). השאר אותו באוויר להקלטת רקע עבור שני הערוצים.
      הערה: שלב זה חיוני מאוד מכיוון שהוא מנרמל את ערכי הרקע מסיבים שונים של הבדיקה ומבטיח אחידות תמונה.
   2. טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). טבול את הקצה בבקבוקון פלואורופור 488 ננומטר למשך 5 שניות כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.
   3. טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). טבול את הקצה בבקבוקון השטיפה עד לאות הפלואורסצנטיות שנרשם ב-3.5.2. נעלם. טבול את הקצה בבקבוקון פלואורופור 660 ננומטר כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.
      הערה: בצע את כל שלבי הכיול כדי להשיג כיול נכון ואיכות תמונה אופטימלית.
6. לאחר כיול הגשושית, ודא שערכי הרקע עבור הבדיקות נמוכים ככל האפשר. עבור מערכת CLM המשמשת, שמור את ערכי הרקע מתחת ל- 100. בצע ניקוי חוזר ונשנה של הבדיקה עם אפליקטור וכיול קצה כותנה אם הערכים הם מעל 100/ערך משתמש מוגדר או אם הבדיקה נראית מלוכלכת. זאת כדי להבטיח שרעשי הרקע יישמרו סביב אותו ערך.
   הערה: חשוב להגדיר את ערך הרקע המרבי (לדוגמה, 100 כאמור בשלב 3.6) כדי להבטיח שתנאי הבדיקה דומים. הדבר יאפשר השוואה כמותית נכונה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות. הערך עשוי להיות שונה במערכות ובתנאי בדיקה שונים.
7. הפעל את בקר הטמפרטורה של בעלי החיים (ATC). כוונן את ה-ATC ל-37°C(50°F). לכסות את כרית החימום עם וילון כירורגי ולתקן את חרוט האף על כרית החימום.
   הערה: ATC עם כרית חימום מחוברת נדרש כדי להבטיח כי החיה נשמרת חמה לאורך כל תקופת ההדמיה.
8. הדקו את מעמד המיקרוסקופ המנתח לראש השולחן כדי לאבטח אותו. סובב וכוון את העין של המיקרוסקופ כדי להציג את עין העכבר ארגונומית דרך העין כאשר המשתמש יושב (בצע את ההתאמות לאחר הצבת החיה).
9. יש להרדים את העכבר באמצעות 5% איזופלוריין בתא אינדוקציה. מעבירים את העכבר לחרוט האף ברגע שהחיה אינה מגיבה ושומרים על הרגעה בטמפרטורה של 2%-2.5% איזופלוריין בזמן שהם על כרית חימום לאורך כל ההליך.
10. חותכים את השפם של העכבר ולהחדיר טיפה של הרדמה 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון על העין.
11. כדי לוודא שהעיניים נקיות, טיפה כמה טיפות של תמיסת מלח כדי לשטוף את פני השטח העין.
12. התאם את המיקרוסקופ כך שעין העכבר תהיה בפוקוס ישיר בהגדלה של פי 0.67.
    הערה: הקפד לשמן את העיניים עם תמיסת מלח. אם העיניים אינן משומנות לאורך כל מפגש ההדמיה, הן יכולות להתייבש ולגרום לעדשה להתגבש. כתוצאה מכך, במהלך הדמיית CLM, העדשה יכולה לפלוט פלואורסצנטיות אדומה ברקע.

4. הדמיה חיה של עיני עכבר עם CLM ורכישה

1. הפעילו את הלייזר, הניחו את הגשושית על העין והתחלו להקליט רכישה כדי לבחון את הפלואורסצנטיות בעין באזורים המצוינים במפת העיניים באיור 3.
   הערה: החזק את הגשוש כמו עט עם הקצה הדיסטלי של הגשושית ישירות על האזור כדי להיות בתמונה.
2. הפסק את ההקלטה כאשר כל האזורים סומנו בדגל ותויגו. קבצי הרכישה יישמרו באופן אוטומטי במיקום הקובץ שנבחר בשלב 3.4.
   הערה: הקובץ יישמר כקובץ וידאו שניתן לייצא לתמונות בודדות. סמן את הדגל על פי מפת העין כדי לדעת בדיוק את מיקום הגשוש במסגרת המדויקת שההקלטה נעשתה.

5. ניתוח תמונה

1. באמצעות אותה תוכנת רכישת CLM, יצא את קבצי רכישת התמונה לניתוח נוסף. לחץ על | קובץ יצא ובחר את התבנית שאליה יש לייצא. קבצי תבנית Mkt יאפשרו התאמות של טבלת חיפוש למעלה (LUT) ויצוא נוסף לתבניות קובץ תמונה באמצעות תוכנת מציג CLM.
2. להשוואה מדויקת של עוצמת הפלואורסצנטיות, השתמשו באותו LUT המותאם לכל ערוץ בעת ייצוא כל קבצי התמונה.
   הערה: בחר את סף ה- LUT המינימלי והמקסימלי ביחס לסף של עכבר הבקרה (ללא ליפוזומים מוזרקים) כדי למזער את קריאות הפלואורסצנטיות ברקע.
3. פתח את התמונה בתוכנת עיבוד תמונה מתאימה / תוכנית freeware (לדוגמה, ImageJ). צייר את אזור העניין (ROI).
   הערה: החזר ההשקעה כאן מתייחס לאזור העניין בתוכנית העיבוד. ברוב המקרים, החזר ההשקעה יהיה התמונה כולה נסרקה. עם זאת, במקרה של הדמיה הלימבוס, הבדיקה לא יכולה פשוט לקבל את התמונה של הלימבוס בנפרד. לכן, יש למשוך החזר השקעה כדי 'לכמת' את הפלואורסצנטיות באזור הלימבוס, כפי שצויר באיור 4. כדי לשמור על החזר ההשקעה עקבי, השתמש באותה החזר השקעה על ההשקעה בכל התמונות.
4. מדוד ורשום את ערכי ההחזר על ההשקעה עבור פלואורסצנטיות ירוקה. הזן את הערכים בגיליון אלקטרוני. סמן את הערכים הממוצעים ואת עוצמת הפלואורסצנטיות (a.u.) של ההחזר על ההשקעה.

6. הערכה היסטולוגית

1. הרדים את העכבר באמצעות שיטה שאושרה על-ידי IACUC המקומי.
2. לחתוך את העין ולתקן את העין ב 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד או 10% פתרון פורמלין בן לילה.
3. חותכים שומנים עודפים ומטביעים את העין בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) ושומרים אותה קפואה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות.
4. חותכים קטעים בעובי 5 מיקרומטר בהקפאה עם טמפרטורת חיתוך שנשמרה ב 20 °C (60 °F). העבר את המקטע לשקופית מיקרוסקופ מצופה פולי-L-ליזין.
   הערה: היסטולוגיה יכולה לשמש אימות נוסף של הפצת DDS. עם זאת, זה דורש אופטימיזציה נוספת, מומחיות טכנית, והקרבה של בעלי חיים אשר המחקר שואף להפחית באמצעות CLM.

תוצאות

הפרוטוקול מדגים את התועלת של CLM כדי להעריך את התפלגות העין המרחבית-זמנית של ליפוזומים פלואורסצנטיים ירוקים המנוהלים באמצעות הזרקה תת-ימית. כדי לעשות שימוש ביכולת הצבע הכפול (488 ננומטר ואורכי גל של 660 ננומטר עירור) של מערכת CLM, 100 ננומטר ליפוזומי POPC ניטרליים להזרקה סוממו עם 5% Fl-DHPE (נתוני הרכב ו...

Discussion

כפי שמוצג מהתוצאות, CLM מספק שיטה פשוטה וישימה לדמיין את התפלגות העין של ליפוזומים בעין. הדגמנו בעבר את השימוש ב- CLM כדי לאפיין את הלוקליזציה של ניסוחים ליפוזומיים שונים בתוך עין העכבר לאורך ^זמן1. עבור יישומים לא פולשניים, CLM מאפשר הדמיה בזמן אמת של פני השטח העין הקדמית לקבלת תובנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3