광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

요약

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

수축기 주사는 각막및 결막과 같은 전방 안구 장벽을 우회하는 쉬운 트랜스 경피성 접근으로 인해 안구 약물을 투여하는 매력적인 경로입니다. 구축 주사 시 약물의 치료 효과 및 약동학은 일부 연구에서 설명되었지만 약물 또는 약물 전달 시스템 (DDS)의 안구 분포를 평가하는 것은 거의 없습니다. 후자는 원하는 안구 국소화 및 작용 기간(예: 급성 대 장시간)을 달성하기 위해 내구 DDS 설계 및 약물 생체 이용률의 최적화에 매우 중요합니다. 이 연구는 섬유섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)를 사용하여 항결체 주입 후 살아있는 마우스에서 실시간으로 형광 리포좀의 안구 분포를 질적으로 연구합니다. 현미경 수준에서 조직의 생체 내육검사를 위해 설계되고, 이것은 또한 수축 주사 후 눈에 주사의 주체의 현수체 분포를 연구하는 CLM 이미징 방법의 첫 번째 전체 설명이다.

서문

혈액 정리, 조직 분포 및 살아있는 시스템에서 약물의 표적 점유율은 생체 내 약물 처분에 대한 이해를 위한 기둥입니다. 전임상 동물 모델에서, 이러한 매개 변수는 전형적으로 약물 투여 후 특정 시점에서 빈번한 혈액 및 조직 샘플링에 의해 평가된다. 그러나, 이 절차는 일반적으로 침략적입니다, 수시로 비 생존 측정을 포함하고, 통계적인 전원을 위한 큰 동물 집단을 필요로 합니다. 동물의 과도한 사용에 대한 윤리적 우려와 함께 추가 비용과 시간이 발생할 수 있습니다. 그 결과, 비침습적 이미징은 빠르게 바이오 유통 연구에서 필수적인 단계가 되고 있습니다. 공초점 레이저 미세 내시경검사(^CLM1,2)는 높은 감도와 ^{고해상도를} 가진 살아있는 동물의 눈에 치료제의 스파티오-측두형 분포를 비침습적으로 이미지화하기 위해 안구 응용 분야에 적합합니다^1,3,4.

CLM은 DDS 및 약물 생체 이용률의 포괄적 인 정량화 전에 리포솜과 같은 안구 약물 전달 시스템 (DDS)의 강력한 선별을 촉진 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 리포솜은 물리화학적 및 생물^{학적 특성}5,6,7,8,9,10,11을 조정하여 다양한 치료화물을 캡슐화하고 약물 방출 및 작용 기간의 조직 부위를 제어하는 유연성에 매력적입니다. 리포솜은 단일클론 항체 bevacizumab12와 같은 대형 분자의 전달을 위한 안구 응용 분야에서 사용되어 왔으며, 사이클로스포린13 및 간시클로비르¹⁴와 같은 작은 분자가 사용되어 왔다. 약물로 적재된 리포솜은 비리포소말 "무료 약물" 제형에 비해 생물학적 반감기와 장기간치료 효과가 있습니다. 그러나, 안구 조직의 약물 분포는 전형적으로 눈의 유체 성분에 있는 약물 농도에서 추정됩니다 (즉, 혈액, 수성 유머 및 유리체 humor15,16,17). 적재된 약물 화물의 초기 생체 내 운명은 나노캐리어 자체의 특성에 의해 정의되기 때문에, 형광 리포솜의 CLM 이미징은 조직 표적화 및 시투 조직 거주 시간에 대한 약물의 대리역할을 할 수 있다. 더욱이, CLM을 가진 납품의 시각적 증거는 DDS 재설계를 조종하고, 약의 치료 이득을 평가하고, 아마 불리한 생물학 사건을 예측할 수 있습니다 (예를 들어, 시간의 연장된 기간 동안 DDS의 바람직하지 않은 현지화로 인한 조직 독성).

본원에서, 단계별 절차는 이중 대역 CLM 시스템을 가진 살아있는 마우스에서 리포솜의 안구 생체 분포를 연구하는 방법에 대해 상세하게 설명된다. 이 특정 CLM 시스템은 8 프레임 / s의 주파수와 함께 실시간으로 2 색 형광 (488 nm 및 660 nm에서 녹색 및 빨간색 여기 레이저 포함)을 감지 할 수 있습니다. 검출 프로브를 눈에 물리적으로 배치함으로써, 프로토콜은 2%의 에반스 블루(EB) 염료를 가진 마우스에 있는 정맥 내(IV)에서 하반수 투여 시 녹색 형광 리포좀의 이미지 수집 및 분석을 보여줍니다. EB 염료는 적색 형광 채널에서 혈관 구조를 시각화하는 데 도움이됩니다. 우리는 인지질 POPC (즉, 1-팔미토일-2-올레오일-글리페로-3-인포콜린)로 구성된 100 nm 중성 리포솜을 평가하는 연구에서 대표적인 결과를 보여주고 형광에 태그된 인지질 Fl-DHPE (즉, 1.e., doped)를 보여줍니다. N-(플루오레세인-5-티오카바모일)-1,2-디헥사-데카노일센-글리케로-3-인포에탄놀라민) 95% POPC의 비율: 5% Fl-DHPE (그림 1B ). CLM은 EB 염색 안구 조직 경계의 묘사에 의해 15 μm 축 및 3.30 μm 측삭 분해능에서 녹색 형광 태그 리포솜을 캡처할 수 있다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 SingHealth (싱가포르)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 여성 C57BL/6 J 마우스(6-8주 전, 18-20g)는 싱가포르 인비보스에서 수득되었으며 싱가포르 듀크-NUS 의과대학의 온도 및 빛 제어 생체관리에 보관되었다. 동물은 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을위한 비전과 안과 (ARVO) 성명서에 대한 연구를위한 협회의 지침에 따라 치료되었다.

참고: 주 프로시저를 강조 표시하는 플로우 차트가 그림 2에 표시됩니다.

1. 조영제 준비: 에반스 블루 (EB) 및 리포솜

1. EB 염료 용액 2%의 경우 멸균 식염수 50mL에 EB 1 g을 녹입니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 1.5mL 멸균 튜브로 필터링하고 나중에 사용할 수 있도록 실온에 보관하십시오.
2. 녹색 형광 리포솜의 경우 POPC / Fl-DHPE (95:5), 클로로폼 / 메탄올 (2:1)을 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 추가하십시오. 1h에 40°C에서 150rpm의 회전 증발기를 사용하고 진공은 0 ^mbar1 에서 유지되어 얇은 지질 필름을 만듭니다.
   참고: 지질학적 특성(예: 크기, 전하, 지질 포화도, 지질 사슬 길이)의 효과를 분배에 비교할 때, 관찰된 결과가 테스트된 특성의 효과 때문이 아니라 큰 소수성 염료의 가변 부하가 아니라는 것을 확인하기 위해 Fl-DHPE 또는 기타 형광 지질의 고정 비율을 유지한다.
3. 40°C에서 인산염 완충식식염(형광 리포솜 26.3mMMMMMM)으로 지질 필름을 수분하여 다중 라멜라 소포(MLV)를 형성한다. MlV를 수동 압출용 유리 주사기에 적재(0.08 μm 모공 크기 폴리카보네이트 필터를 사용하여 30회)를 100nm의 원하는 크기를 달성한다.
   참고: 수분 공급 온도는 지질의 전이 온도보다 높어야 합니다.
4. 0.22 μm 멸균 주사기 필터를 통과하여 리포솜을 필터링합니다. 동적 광 산란 시스템을 사용하여 리포솜의 유체 역학 직경(_DH)을 확인합니다.

2. 살아있는 마우스에 있는 EB와 리포솜의 행정

1. 꼬리 정맥 (2.5 mg/kg)을 통해 EB IV (정맥)로 마우스를 주입, 2 섭막 주사 전에 시간.
2. 아결체 주입의 경우, 먼저, 마취의 적절한 평면을 달성하기 위해 유도 챔버에서 흡입을 통해 5 % 이소플루란을 사용하여 마우스를 진정. 마우스를 코 콘으로 옮기고 시술 내내 가열 패드에 있는 동안 이소플루란의 2%-2.5%에서 체기를 유지합니다.
3. 눈 근처의 수염을 다듬어 주입하고 국소 마취제 0.5% 프록시메타카인 염산염 용액을 눈에 직접 주입합니다.
4. 10 μL 유리 주사기(32G 바늘)를 형광 리포솜(Fl-DHPE: 0.78 mg/kg)으로 적재하고 주사 전에 주사기의 모든 기포를 제거합니다.
   참고: 최대 20μL의 인젝트는 생쥐의 하변 공간에서 수용될 수 있다^18,19.
5. 트위저를 사용하여 결막을 약간 들어 올리고 하위 경련 공간에 천천히 주입하십시오(그림 1A). 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 철회하십시오. 형광 리포솜으로 채워진 눈에 보이는 결점이 형성되는지 확인합니다(그림 1C).
6. 주사 후 눈에 항생제 1% fusidic 산의 방울을 관리 하 고 의식을 회복 할 때까지 마우스를 모니터링.

3. CLM 설정

1. CLM 시스템을 전환하고 스캐닝 프로브의 커넥터와 단부 팁이 모두 깨끗한지 확인합니다.
2. 제조업체의 지시에 따라 광학 커넥터 클리너를 사용하여 스캐닝 프로브의 커넥터를 청소합니다.
   1. 광학 커넥터 클리너의 라셰(종종 색)를 눌러 클리닝 리본을 드러냅니다.
   2. 커넥터를 클리닝 리본과 접촉하고 접촉을 유지하면서 리본을 따라 커넥터를 밀어 놓습니다.
3. 프로브의 말단 팁(스캐닝 팁이라고도 함)을 클렌징 솔루션에 담그고 제조업체에서 제공하는 헹구는 용액을 청소합니다. 팁이 매우 더러워지면 면 팁 어플리케이터를 보다 철저한 세척에 사용할 수도 있습니다.
4. 프로브를 CLM 시스템에 연결합니다. 이 시점에서 FOV(뷰 필드)와 수집 파일의 위치를 선택합니다.
   참고: 이 단계에서 레이저 강도를 조정하여 Fl-DHPE에 대한 형광 검출이 선형 범위에 있는지 확인합니다. 레이저 강도는 다른 시점에서 찍은 이미지 간의 비교를 위해 일관되게 유지되어야 합니다.
5. 시스템이 지시에 따라 15분 동안 워밍업하고 교정 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 시스템을 보정할 수 있도록 합니다.
   참고: 교정 키트에는 클렌징 솔루션, 헹구는 솔루션 및 내부 교정을 위한 플루오로포어 488/660 nm 솔루션의 다음 솔루션을 포함하는 각 레이저에 대한 3개의 바이알이 있습니다. 교정 단계는 시스템에 의해 메시지가 표시되며 그에 따라 따라야 합니다.
   1. 클렌징 바이알에 팁을 담그고 헹구는 바이알(각 바이알5개)을 넣습니다. 두 채널모두에 대한 배경 녹화를 위해 공중에 떠두십시오.
      참고: 이 단계는 프로브의 다양한 섬유에서 배경 값을 정규화하고 이미지 균일성을 보장하기 때문에 매우 중요합니다.
   2. 클렌징 바이알에 팁을 담그고 헹구는 바이알(각 바이알5개)을 넣습니다. 플뢰로포어 488 nm 바이알에 5초 간 팁을 담그고 프로브의 다른 섬유로부터 신호 값을 정규화합니다.
   3. 클렌징 바이알에 팁을 담그고 헹구는 바이알(각 바이알5개)을 넣습니다. 형광 신호가 3.5.2로 기록될 때까지 헹구는 유리병에 팁을 담급하십시오. 사라집니다. 플뢰로포레 660 nm 바이알에 팁을 담그고 프로브의 다른 섬유로부터 신호 값을 정상화합니다.
      참고: 적절한 교정과 최적의 이미지 품질을 달성하기 위해 모든 교정 단계를 따르십시오.
6. 프로브를 보정한 후 프로브의 배경 값이 가능한 한 낮은지 확인합니다. 사용되는 CLM 시스템의 경우 배경 값을 100 미만으로 유지합니다. 값이 100/정의 된 사용자 값 이상이거나 프로브가 더러워 보이는 경우 면 팁 어플리케이터 및 교정으로 프로브를 반복 청소하십시오. 이는 배경 노이즈가 동일한 값 주위에 유지되도록 하기 위한 것입니다.
   참고: 프로브 조건이 유사한지 확인하기 위해 최대 배경 값(예: 3.6단계에서 명시된 대로 100)을 정의하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 다른 시점에서 찍은 이미지 간의 적절한 정량적 비교가 허용됩니다. 값은 다른 시스템 및 프로브 조건에서 다를 수 있습니다.
7. 동물 온도 컨트롤러(ATC)를 켭니다. ATC를 37°C로 조정합니다. 수술 용 커튼으로 가열 패드를 덮고 가열 패드에 코 콘을 고정합니다.
   참고: 가열 패드가 부착된 ATC는 동물이 이미징 기간 내내 따뜻하게 유지되도록 해야 합니다.
8. 해부 현미경의 스탠드를 탁상에 고정하여 고정합니다. 현미경의 안면을 회전시키고 조정하여 사용자가 앉을 때 마우스 눈을 인체공학적으로 볼 수 있습니다(동물을 배치한 후 조정하십시오).
9. 유도 챔버에서 5% 이소플루란을 사용하여 마우스를 진정시합니다. 동물이 반응하지 않는 후 마우스를 코 콘으로 옮기고 시술 내내 가열 패드에 있는 동안 2%-2.5%의 이소플루란에서 진정을 유지합니다.
10. 마우스의 수염을 다듬고 마취0.5% 프록시메타카인 염산염 용액을 눈에 주입합니다.
11. 눈이 깨끗하다는 것을 확인하려면 식염수 몇 방울을 떨어 뜨려 안구 표면을 씻으십시오.
12. 마우스 눈이 0.67배 배율로 직접 초점을 맞출 수 있도록 현미경을 조정합니다.
    참고: 식염수로 눈을 윤활해야합니다. 이미징 세션 내내 눈이 윤활되지 않으면 건조해져 렌즈가 결정화될 수 있습니다. 그 결과, CLM 이미징 중에 렌즈는 배경적 적색 형광을 방출할 수 있습니다.

4. CLM 및 인수와 마우스 눈의 라이브 이미징

1. 레이저를 켜고, 눈에 프로브를 배치하고 도 3의 눈맵에 표시된 영역에서 눈의 형광을 관찰하기 위해 수집을 기록하기 시작합니다.
   참고: 프로브의 단단 끝이 있는 펜처럼 프로브를 이미지할 영역에 직접 고정합니다.
2. 모든 영역에 플래그가 지정되고 레이블이 지정되면 녹화를 중지합니다. 수집 파일은 3.4 단계에서 선택한 파일 위치에 자동으로 저장됩니다.
   참고: 파일은 개별 이미지로 내보낼 수 있는 비디오 파일로 저장됩니다. 눈 맵에 따라 플래그에 레이블을 지정하여 레코딩이 수행된 정확한 프레임에서 프로브의 위치를 정확하게 알 수 있습니다.

5. 이미지 분석

1. 동일한 CLM 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집 파일을 내보내 추가 분석을 합니다. 파일 | 클릭 내보낼 형식을 내보내고 선택할 수 있습니다. Mkt 형식 파일은 조회 테이블(LUT)을 조정하고 CLM 뷰어 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일 형식으로 추가로 내보내기할 수 있습니다.
2. 형광 강도를 정확하게 비교하려면 모든 이미지 파일을 내보낼 때 각 채널에 대해 조정된 동일한 LUT를 사용합니다.
   참고: 배경 형광 판독값을 최소화하기 위해 컨트롤 마우스(리포솜 주입 없음)와 관련하여 최소 및 최대 LUT 임계값을 선택합니다.
3. 적절한 이미지 처리 소프트웨어/프리웨어 프로그램(예: ImageJ)에서 이미지를 엽니다. 관심 영역(ROI)을 그립니다.
   참고: ROI는 여기서 처리 프로그램에 대한 관심 영역을 나타냅니다. 대부분의 경우 ROI는 전체 이미지 스캔이 됩니다. 그러나, 림푸스를 이미징의 경우, 프로브는 단지 림푸스의 이미지를 별도로 얻을 수 없다. 따라서 , ROI는 도 4에 그려진 바와 같이, 림푸스 영역의 형광을 '정량화'하도록 그려져야 한다. ROI를 일관되게 유지하려면 모든 이미지에서 동일한 ROI를 사용합니다.
4. 녹색 형광에 대한 ROI 값을 측정하고 기록합니다. 스프레드시트에 값을 입력합니다. ROI의 평균 및 형광 강도(a.u.) 값을 표로 합니다.

6. 히스토로지 평가

1. 로컬 IACUC에서 승인한 방법을 사용하여 마우스를 안락사시합니다.
2. 눈을 이결시키고 하룻밤 사이에 포름알데히드 또는 10% 포름알데히드 또는 10% 포름알린 용액의 1mL로 눈을 고정시합니다.
3. 여분의 지방을 다듬고 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물에 눈을 포함하고 적어도 하루 동안 -80 ° C 냉동고에 냉동 유지.
4. 20°C에서 유지되는 절삭 온도로 극저온에서 5 μm 두께의 절단 섹션을 절단합니다. 섹션을 폴리 L-리신 코팅 현미경 슬라이드로 옮기.
   참고: 히스토로지는 DDS 분포에 대한 추가 검증 역할을 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 추가 최적화를 필요로, 기술 전문 지식, 그리고 연구 CLM을 사용 하 여 감소 하는 것을 목표로 하는 동물의 희생.

결과

이 프로토콜은 경내 주입을 통해 투여된 녹색 형광 리포솜의 스파티오 측두엽 안구 분포를 평가하기 위해 CLM의 유용성을 입증한다. CLM 시스템의 듀얼 컬러 기능(488nm 및 660 nm 포크 파장)을 사용하기 위해 주입할 100nm 중립 POPC 리포솜은 5% Fl-DHPE( 도 1B에 도시됨)로 도핑되었고, EB는 눈의 랜드마크를 식별하기 위해 IV를 주입하였다. 에피클레라의 얇은 층과 결막의 존재는 모두 ?...

토론

결과에서 볼 수 있듯이 CLM은 눈에서 리포솜의 안구 분포를 이미지화하는 간단하고 실행 가능한 방법을 제공합니다. 앞서 CLM의 사용을 통해 시간이 지남에 따라 마우스 눈 내의 다양한 리포소말 제형의 국소화를 특징으로 하는 것을 입증^하였다1. 비침습적 응용 프로그램의 경우 CLM은 리포솜이 동일한 동물의 눈에 어떻게 분포되는지에 대한 통찰력을 위해 전방 안구 표면의 실시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3