Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Abstract

L'iniezione subcongiuntivale è una via interessante per somministrare farmaci oculari a causa del facile accesso trans-sclerale che bypassa le barriere oculari anteriori, come la cornea e la congiuntiva. Mentre gli effetti terapeutici e la farmacocinetica dei farmaci dopo iniezione subcongiuntivale sono stati descritti in alcuni studi, pochissimi valutano la distribuzione oculare dei farmaci o dei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS). Quest'ultimo è fondamentale per l'ottimizzazione della progettazione della DDS intraoculare e della biodisponibilità del farmaco per ottenere la localizzazione oculare desiderata e la durata dell'azione (ad esempio, acuta contro prolungata). Questo studio stabilisce l'uso della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare qualitativamente la distribuzione oculare dei liposomi fluorescenti in tempo reale in topi vivi dopo iniezione sub-congiuntivale. Essendo progettato per l'ispezione visiva in vivo dei tessuti a livello microscopico, questa è anche la prima descrizione completa del metodo di imaging CLM per studiare la distribuzione spazio-temporale degli iniettabili nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Introduzione

La clearance del sangue, la distribuzione dei tessuti e l'occupazione target dei farmaci nei sistemi viventi sono pilastri per comprendere la disposizione dei farmaci in vivo. Nei modelli animali preclinici, questi parametri sono tipicamente valutati mediante frequenti campionamenti di sangue e tessuti in particolari momenti successivi alla somministrazione del farmaco. Tuttavia, queste procedure sono generalmente invasive, spesso includono misurazioni di non sopravvivenza e richiedono grandi coorti di animali per l'alimentazione statistica. Potrebbero esserci costi e tempi aggiuntivi sostenuti, insieme a preoccupazioni etiche per l'uso eccessivo di animali. Di conseguenza, l'imaging non invasivo sta rapidamente diventando un passo fondamentale negli studi di biodistribuzione. La microscopia laser confocale (^CLM1,2) è adatta per applicazioni oculari per l'immagine non invasiva della distribuzione spazio-temporale delle terapie negli occhi di animali vivi ad alta sensibilità e alta risoluzione1,3,4.

Il CLM ha il potenziale per facilitare uno screening robusto dei sistemi di somministrazione oculare dei farmaci (DDS), come i liposomi, prima della quantificazione completa della DDS e della biodisponibilità dei farmaci. I liposomi sono attraenti per la loro flessibilità nel sintonizzare le loro proprietà fisico-chimiche e biofisiche5,6,7,8,9,10,11 per incapsulare una grande varietà di carico terapeutico e controllare il sito tissutale di rilascio del farmaco e la durata dell'azione. I liposomi sono stati utilizzati in applicazioni oculari per la somministrazione di grandi molecole, come l'anticorpo monoclonale bevacizumab12, e piccole molecole come la ciclosporina13 e il ganciclovir14. I liposomi caricati con farmaci hanno emivite biologiche più lunghe ed effetti terapeutici prolungati rispetto alle formulazioni "free drug" non liposomiali. Tuttavia, la distribuzione del farmaco nel tessuto oculare è tipicamente estrapolata dalle concentrazioni di farmaco nei componenti fluidi dell'occhio (cioè sangue, umore acqueo e umore vitreo15,16,17). Poiché il destino iniziale in vivo del carico di farmaci caricato è definito dalle proprietà del nanovettore stesso, l'imaging CLM dei liposomi fluorescenti può servire come surrogato del farmaco per rivelare il targeting dei tessuti e i tempi di permanenza dei tessuti in situ. Inoltre, l'evidenza visiva della somministrazione con CLM può guidare la riprogettazione della DDS, valutare i benefici terapeutici del farmaco e forse anche prevedere eventi biologici avversi (ad esempio, tossicità tissutale dovuta alla localizzazione indesiderata della DDS per periodi di tempo prolungati).

Qui, una procedura passo-passo è dettagliata su come studiare la biodistribuzione oculare dei liposomi in topi vivi con un sistema CLM a doppia banda. Questo specifico sistema CLM è in grado di rilevare la fluorescenza bicolore (con laser di eccitazione verde e rosso a 488 nm e 660 nm) in tempo reale, con una frequenza di 8 fotogrammi/s. Posizionando fisicamente la sonda di rilevamento sull'occhio, il protocollo dimostra l'acquisizione e l'analisi delle immagini dei liposomi verde-fluorescenti dopo somministrazione subcongiuntivale in topi pre-iniettati per via endovenosa (IV) con colorante Evans Blue (EB) al 2%. Il colorante EB aiuta a visualizzare le strutture vascolarizzate nel canale di fluorescenza rossa. Mostriamo risultati rappresentativi da uno studio che valuta i liposomi neutri a 100 nm composti dal fosfolipide POPC (cioè 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) e drogati con fosfolipide Fl-DHPE marcato con fluoresceina (cioè N-(fluoresceina-5-tiocarbamoil)-1,2-diesa-decanoil-glicero-glicero-3-fosfoetanolammina) con un rapporto del 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM è in grado di catturare i liposomi verdi marcati con fluoresceina a 15 μm assiale e 3,30 μm di risoluzione laterale delineando i confini del tessuto oculare colorato con EB.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di SingHealth (Singapore). Topi femminili C57BL / 6 J (6- 8 settimane di età; 18-20 g) sono stati ottenuti da InVivos, Singapore, e alloggiati in un vivaio a temperatura e luce controllata della Duke-NUS Medical School, Singapore. Gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida della dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

NOTA: nella Figura 2 è riportato un diagramma di flusso che evidenzia le procedure principali.

1. Preparazione di mezzi di contrasto: Evans Blue (EB) e liposomi

1. Per la soluzione colorante EB al 2%, sciogliere 1 g di EB in 50 ml di soluzione salina sterile. Filtrare la soluzione utilizzando filtri da 0,22 μm in tubi sterili da 1,5 ml e conservarli a temperatura ambiente per un uso successivo.
2. Per i liposomi verde-fluorescenti, aggiungere POPC/Fl-DHPE (95:5), cloroformio/metanolo (2:1) in un matraccio a fondo tondo da 100 ml. Utilizzare un evaporatore rotativo a 150 giri/min a 40 °C per 1 ora, con vuoto mantenuto a 0 ^mbar1 per creare un film lipidico sottile.
   NOTA: Quando si confrontano gli effetti delle proprietà liposomiali (ad esempio, dimensioni, carica, saturazione lipidica, lunghezza della catena lipidica) sulla distribuzione, mantenere una percentuale fissa di Fl-DHPE o altri lipidi fluorescenti per confermare che i risultati osservati sono dovuti all'effetto delle proprietà testate e non al carico variabile di coloranti idrofobici di grandi dimensioni.
3. Idratare il film lipidico con soluzione salina tamponata con fosfato (per ottenere 26,3 mM di liposomi fluorescenti) a 40 °C per formare vescicole multilamellari (MLV). Caricare gli MLV in una siringa di vetro per l'estrusione manuale (30 volte utilizzando un filtro in policarbonato di dimensioni dei pori di 0,08 μm) per ottenere la dimensione desiderata di 100 nm.
   NOTA: La temperatura per l'idratazione deve essere superiore alla temperatura di transizione dei lipidi.
4. Filtrare i liposomi facendoli passare attraverso un filtro a siringa sterile da 0,22 μm. Confermare il diametro idrodinamico (_DH) dei liposomi utilizzando un sistema di diffusione dinamica della luce.

2. Somministrazione di EB e liposomi in topi vivi

1. Iniettare nel topo EB IV (per via endovenosa) attraverso la vena della coda (2,5 mg/kg), 2 ore prima dell'iniezione subcongiuntivale.
2. Per l'iniezione subcongiuntivale, in primo luogo, sedare il topo usando il 5% di isoflurano per inalazione in una camera di induzione per ottenere un piano di anestesia adeguato. Trasferire il mouse in un cono nasale e mantenere la sedazione al 2% -2,5% di isoflurano mentre si è su una piastra riscaldante durante la procedura.
3. Tagliare i baffi vicino all'occhio da iniettare e infondere una goccia di anestetico topico soluzione di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% direttamente sull'occhio.
4. Caricare una siringa di vetro da 10 μL (con ago da 32 G) con liposomi fluorescenti (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) e dissipare tutte le bolle d'aria nella siringa prima dell'iniezione.
   NOTA: Fino a 20 μL di iniettato possono essere alloggiati nello spazio subcongiuntivale dei ^topi18,19.
5. Usando una pinzetta, sollevare leggermente la congiuntiva e iniettare lentamente nello spazio subcongiuntivale (Figura 1A). Prelevare l'ago lentamente per evitare il riflusso. Assicurarsi che si formi un bleb visibile pieno di liposomi fluorescenti (Figura 1C).
6. Somministrare una goccia di antibiotico acido fusidico all'1% sull'occhio dopo l'iniezione e monitorare il topo fino a quando non riprende conoscenza.

3. Configurazione CLM

1. Accendere il sistema CLM e assicurarsi che sia il connettore che la punta distale della sonda di scansione siano puliti.
2. Pulire il connettore della sonda di scansione utilizzando un detergente per connettori ottici seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Premere il rachet (spesso colorato) del detergente del connettore ottico per rivelare un nastro di pulizia.
   2. Posizionare il connettore a contatto con il nastro di pulizia e far scorrere il connettore lungo il nastro mantenendo il contatto.
3. Pulire la punta distale (nota anche come punta di scansione) della sonda immergendola nella soluzione detergente, seguita dalla soluzione di risciacquo fornita dal produttore. Un applicatore di punta in cotone può anche essere utilizzato per una pulizia più accurata se la punta è molto sporca.
4. Collegare la sonda al sistema CLM. Scegliere il campo visivo (FOV) e la posizione per i file di acquisizione a questo punto.
   NOTA: regolare l'intensità del laser in questa fase per garantire che il rilevamento della fluorescenza per Fl-DHPE sia nell'intervallo lineare. L'intensità del laser deve essere mantenuta coerente per il confronto tra immagini scattate in diversi punti temporali.
5. Lasciare riscaldare il sistema per 15 minuti come indicato e utilizzare il kit di calibrazione per calibrare il sistema secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Nel kit di calibrazione sono presenti tre flaconcini per ogni laser contenenti le seguenti soluzioni: soluzione detergente, soluzione di risciacquo e soluzione di fluoroforo 488/660 nm per la calibrazione interna. Le fasi di calibrazione sono richieste dal sistema e devono essere seguite di conseguenza.
   1. Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Lascialo in aria per la registrazione in background per entrambi i canali.
      NOTA: questo passaggio è molto cruciale in quanto normalizza i valori di sfondo da diverse fibre della sonda e garantisce l'uniformità dell'immagine.
   2. Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Immergere la punta in un flaconcino di fluoroforo da 488 nm per 5 secondi per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.
   3. Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Immergere la punta nel flaconcino di risciacquo fino al segnale di fluorescenza registrato al punto 3.5.2. Scompare. Immergere la punta in un flaconcino di fluoroforo da 660 nm per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.
      NOTA: seguire tutte le fasi di calibrazione per ottenere una calibrazione corretta e una qualità dell'immagine ottimale.
6. Dopo aver calibrato la sonda, verificare che i valori di sfondo per le sonde siano il più bassi possibile. Per il sistema CLM utilizzato, mantenere i valori di sfondo al di sotto di 100. Eseguire la pulizia ripetuta della sonda con un applicatore a punta di cotone e la calibrazione se i valori sono superiori a 100 / valore utente definito o se la sonda sembra essere sporca. Questo per garantire che il rumore di fondo sia mantenuto intorno allo stesso valore.
   NOTA: è importante definire il valore di sfondo massimo (ad esempio, 100 come indicato nel passaggio 3.6) per garantire che le condizioni della sonda siano simili. Ciò consentirà un corretto confronto quantitativo tra immagini scattate in diversi punti temporali. Il valore può differire in diversi sistemi e condizioni della sonda.
7. Accendere il regolatore di temperatura animale (ATC). Regolare l'ATC a 37 °C. Coprire la piastra riscaldante con un telo chirurgico e fissare il cono del naso sulla piastra riscaldante.
   NOTA: l'ATC con una piastra riscaldante collegata è necessario per garantire che l'animale sia tenuto al caldo per tutta la durata dell'imaging.
8. Fissare il supporto del microscopio di dissezione al piano del tavolo per fissarlo. Ruotare e regolare l'oculare del microscopio per visualizzare ergonomicamente l'occhio del mouse attraverso l'oculare quando l'utente è seduto (effettuare le regolazioni dopo aver posizionato l'animale).
9. Sedare il mouse usando il 5% di isoflurano in una camera di induzione. Trasferire il mouse al cono del naso una volta che l'animale non risponde e mantenere la sedazione al 2% -2,5% di isoflurano mentre si trova su una piastra riscaldante durante la procedura.
10. Tagliare i baffi del topo e instillare una goccia di soluzione anestetica di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% sull'occhio.
11. Per assicurarsi che gli occhi siano puliti, lasciare cadere alcune gocce di soluzione salina per lavare la superficie oculare.
12. Regolare il microscopio in modo che l'occhio del mouse sia a fuoco diretto con un ingrandimento di 0,67x.
    NOTA: Assicurarsi di lubrificare gli occhi con soluzione salina. Se gli occhi non sono lubrificati durante la sessione di imaging, possono asciugarsi, causando la cristallizzazione della lente. Di conseguenza, durante l'imaging CLM, l'obiettivo può emettere una fluorescenza rossa di fondo.

4. Imaging dal vivo degli occhi di topo con CLM e acquisizione

1. Accendere il laser, posizionare la sonda sull'occhio e iniziare a registrare l'acquisizione per osservare la fluorescenza nell'occhio nelle regioni indicate sulla mappa oculare nella Figura 3.
   NOTA: tenere la sonda come una penna con l'estremità distale della sonda direttamente sulla regione da visualizzare.
2. Interrompere la registrazione quando tutte le regioni sono state contrassegnate ed etichettate. I file di acquisizione verranno salvati automaticamente nella posizione del file scelta nel passaggio 3.4.
   NOTA: Il file verrà salvato come file video che può essere esportato in singole immagini. Etichettare la bandiera in base alla mappa oculare per conoscere esattamente la posizione della sonda nel fotogramma esatto in cui è stata eseguita la registrazione.

5. Analisi delle immagini

1. Utilizzando lo stesso software di acquisizione CLM, esportare i file di acquisizione delle immagini per ulteriori analisi. Clicca su File | Esporta e scegli il formato in cui esportare. I file in formato MKT consentiranno regolazioni della tabella di ricerca (LUT) e ulteriori esportazioni in formati di file immagine utilizzando il software di visualizzazione CLM.
2. Per un confronto accurato dell'intensità di fluorescenza, utilizzare la stessa LUT regolata per ciascun canale durante l'esportazione di tutti i file di immagine.
   NOTA: Scegliere la soglia minima e massima LUT rispetto a quelle del mouse di controllo (senza liposomi iniettati) per ridurre al minimo le letture di fluorescenza di fondo.
3. Aprire l'immagine in un software di elaborazione delle immagini appropriato / programma freeware (ad esempio, ImageJ). Disegna la regione di interesse (ROI).
   NOTA: il ROI qui si riferisce alla regione di interesse nel programma di elaborazione. Nella maggior parte dei casi, il ROI sarà l'intera immagine scansionata. Tuttavia, nel caso dell'imaging del limbus, la sonda non può semplicemente ottenere l'immagine del limbus separatamente. Pertanto, è necessario disegnare un ROI per "quantificare" la fluorescenza nella regione del limbus, come disegnato nella Figura 4. Per mantenere coerente il ROI, utilizza lo stesso ROI su tutte le immagini.
4. Misura e registra i valori di ROI per la fluorescenza verde. Immettere i valori in un foglio di calcolo. Tabulare i valori medi e di intensità di fluorescenza (u.a.) del ROI.

6. Valutazione istologica

1. Eutanasia del mouse utilizzando un metodo approvato dalla IACUC locale.
2. Enucleare l'occhio e fissare l'occhio in 1 mL di soluzione di formaldeide al 4% o formalina al 10% durante la notte.
3. Tagliare i grassi in eccesso e incorporare l'occhio nel composto OCT (Optimal Cutting Temperature) e tenerlo congelato in un congelatore a -80 °C per almeno un giorno.
4. Tagliare sezioni di spessore 5 μm nel criostato con temperatura di taglio mantenuta a 20 °C. Trasferire la sezione su un vetrino per microscopio rivestito con Poly-L-Lysine.
   NOTA: l'istologia può servire come ulteriore convalida della distribuzione di DDS. Tuttavia, richiede ulteriore ottimizzazione, competenza tecnica e sacrificio di animali che lo studio mira a ridurre utilizzando CLM.

Risultati

Il protocollo dimostra l'utilità della LMC per valutare la distribuzione oculare spazio-temporale dei liposomi fluorescenti verdi somministrati attraverso l'iniezione subcongiuntivale. Per sfruttare la capacità a doppio colore (lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 660 nm) del sistema CLM, i liposomi POPC neutri da 100 nm da iniettare sono stati drogati con il 5% di Fl-DHPE (i dati di composizione e caratterizzazione sono mostrati nella Figura 1B) e EB è stato iniettato IV per ident...

Discussione

Come mostrato dai risultati, CLM fornisce un metodo semplice e fattibile per visualizzare la distribuzione oculare dei liposomi nell'occhio. In precedenza abbiamo dimostrato l'uso della LMC per caratterizzare la localizzazione di varie formulazioni liposomiali all'interno dell'occhio del topo nel ^tempo1. Per le applicazioni non invasive, CLM consente l'imaging in tempo reale della superficie oculare anteriore per approfondimenti su come i liposomi sono distribuiti nell'occhio dallo stesso animale....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3