Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن تقرير طريقة الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الخلايا الفلكية القشرية مورين للأنسجة الحيوية مثل العصبية لدراسة وظائف الخلايا الفلكية في الجهاز العصبي المركزي والآليات التي تنطوي على الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية والعلاجات.

Abstract

الخلايا الفلكية هي خلايا جلبقية لها دور أساسي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك دعم الخلايا العصبية ووظائفها. هذه الخلايا تستجيب أيضا للإصابات العصبية وتعمل على حماية الأنسجة من الأحداث التنكسية. الدراسات المختبرية من وظائف الخلايا الفلكية مهمة لتوضيح الآليات المشاركة في مثل هذه الأحداث والمساهمة في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع بنية أنسجة تشبه العصبية غنية بالخلايا الفلكية عن طريق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية المحملة بالفينك الحيوي. تم استخدام طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد تعتمد على البثق في هذا العمل ، وتم استخراج الخلايا الفلكية من قشريات الدماغ C57Bl/6 الفئران. تم إعداد bioink عن طريق خلط الخلايا الفلكية القشرية من ما يصل إلى الممر 3 إلى محلول المواد الحيوية المكون من الجيلاتين والجيلاتين الميثاكريلويل (GelMA) والفيبرينوجين ، المكمل باللامينين ، والذي قدم ظروف الطباعة الحيوية المثلى. قللت ظروف الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من إجهاد الخلايا ، مما ساهم في البقاء العالي للخلايا الفلكية أثناء العملية ، حيث كان 74.08٪ ± 1.33٪ من الخلايا قابلة للحياة مباشرة بعد الطباعة الحيوية. بعد أسبوع واحد من الحضانة ، زادت صلاحية الخلايا الفلكية بشكل كبير إلى 83.54٪ ± 3.00٪، مما يشير إلى أن البناء ثلاثي الأبعاد يمثل بيئة دقيقة مناسبة لنمو الخلايا. سمح تكوين المادة الحيوية بتعلق الخلية وحفز السلوك الفلكي ، مع الخلايا التي تعبر عن الخلايا الفلكية المحددة علامة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وامتلاك مورفولوجيا فلكية نموذجية. يوفر هذا البروتوكول القابل للاستنساخ طريقة قيمة لتصنيع الأنسجة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالخلايا العصبية الغنية بالخلايا الفلكية التي تشبه البيئة الدقيقة الأصلية للخلايا ، مفيدة للباحثين الذين يهدفون إلى فهم وظائف الخلايا الفلكية وعلاقتها بالآليات المشاركة في الأمراض العصبية.

Introduction

الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا رئيسيا في التوازن الدماغي. بالإضافة إلى دعم الخلايا العصبية دائمة, الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن تحوير امتصاص الناقلات العصبية, الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ, وتنظيم تولد الخلايا العصبية1,2. الخلايا الفلكية أيضا دورا أساسيا في التهاب الجهاز العصبي المركزي, الاستجابة لإصابات الدماغ في عملية تؤدي إلى التفاعل الفلكي أو astrogliosisالتفاعلية 3,4, تشكيل ندبة الدبقية التي تمنع معرض الأنسجة السليمة للعوامل التنكسية5. ينتج عن هذا الحدث تغييرات في التعبير الجيني للخلايا الفلكية، ومورفولوجيا، ووظيفة6،7. لذلك، تساعد الدراسات التي تنطوي على وظائف الخلايا الفلكية في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية.

في المختبر نماذج حاسمة لدراسة الآليات المتعلقة بالإصابات العصبية، وعلى الرغم من العزلة الناجحة والثقافة ثنائية الأبعاد (2D) من الخلايا الفلكية القشرية قد أنشئت8،وهذا النموذج يفشل في توفير بيئة واقعية تحاكي سلوك الخلايا الأصلية وإعادة إنتاج تعقيد الدماغ9 . في حالة 2D، وضعف الدعم الميكانيكية والبيوكيميائية، وانخفاض الخلايا الخلية والتفاعلات مصفوفة الخلية، وتسطيح الخلايا مما يؤدي إلى عدم وجود قطبية القاعدية apical، تؤثر على ديناميات إشارات الخلايا والنتائج التجريبية مما يؤدي إلى تغيير مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني، والتي تعرض للخطر الاستجابة للعلاجات10. لذلك، من المهم تطوير بدائل توفر بيئة عصبية أكثر واقعية، تهدف إلى ترجمة النتائج إلى العيادة.

ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة الخلية يمثل نموذجا أكثر تقدما أن يلخص مع زيادة ميزات الدقة من الأجهزة والأنسجة, بما في ذلك CNS11. وفيما يتعلق بالثقافة الدبقية، تساهم النماذج ثلاثية الأبعاد في الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا الفلكية، والقطبية القاعدية القاعدية للخلايا، وإشارة الخلية12،13. ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كأداة قوية لتصنيع الأنسجة الحية ثلاثية الأبعاد بطريقة خاضعة للرقابة باستخدام الخلايا والمواد الحيوية لإعادة إنشاء بنية وخصائص الأنسجة الأصلية. وقد أدى استخدام هذه التكنولوجيا إلى تحسن كبير في التنبؤ بالنتائج وساهم في الطب التجديدي المطبق على CNS14،15،16.

البروتوكول الموصوف هنا تفاصيل العزلة والثقافة من الخلايا الفلكية القشرية. البروتوكول تفاصيل أيضا طريقة استنساخها للخلايا الفلكية bioprint جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين / الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) / الفيبرينوجين، تكملها لامينين. في هذا العمل، تم استخدام طابعة بيولوجية تعتمد على البثق لطباعة تكوين المادة الحيوية التي تحتوي على الخلايا الفلكية القشرية بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. تم تقليل إجهاد القص الطباعة الحيوية عن طريق التحكم في سرعة الطباعة ، وأظهرت الخلايا الفلكية قابلية عالية للحياة بعد العملية. تم استزراع البنى المطبوعة بيولوجيا لمدة أسبوع واحد ، وتمكنت الخلايا الفلكية من الانتشار والإرفاق والبقاء على قيد الحياة داخل الهيدروجيل ، والحفاظ على مورفولوجيا الفلكية والتعبير عن بروتين حمضي الرجفان الرجفي الرجفي المحدد (GFAP)4.

يتوافق هذا الإجراء مع الطابعات الحيوية القائمة على البثق القائم على المكبس ويمكن استخدامه للطباعة الحيوية للخلايا الفلكية المشتقة من مصادر مختلفة. النموذج المطبوع بيولوجيا ثلاثي الأبعاد المقترح هنا مناسب لمجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة العصبية ، مثل دراسات الآليات المشاركة في وظائف الخلايا الفلكية في الأنسجة السليمة وفهم تطور الأمراض العصبية وتطوير العلاج.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ التوجيهية الدولية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث (http://www.iclas.org) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في أبحاث جامعة ساو باولو الاتحادية (CEUA 2019 / 9292090519).

1. الفئران تشريح الدماغ

  1. نقل 10 مل من محلول الملح البارد هانكس المخزنة (HBSS) إلى طبق ثقافة 100 ملم و 1 مل إلى 1.5 مل ميكروب. إعداد واحد الأنابيب الدقيقة لكل.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بكل من طبق الثقافة والميكروبيوب على الجليد.
  2. إعداد الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة باستخدام DMEM F12 + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2٪ الجلوتامين، و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين (P/S). قم بتعقيم الوسط عن طريق التصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
  3. القتل الرحيم C57Bl/6 الفئران الجراء (بعد الولادة اليوم 1) عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص التشغيل حادة. باستخدام ملقط، سحب الجلد وفضح الجمجمة. تأكد من تعقيم كل من المقص والمملقط بالإيثانول بنسبة 70٪.
  4. قطع الجمجمة من ماغنوم foramen إلى أعلى الرأس على طول الطائرة القوس باستخدام مقص تلميح منحني حاد.
    ملاحظة: تأكد من عدم تلف النسيج الدماغي.
  5. باستخدام ملعقة تعقيمها سابقا مع الإيثانول 70٪، ورفع الدماغ من تجويف الجمجمة ووضعه في طبق الثقافة التي تحتوي على 10 مل من HBSS الباردة.
  6. وضع طبق الثقافة التي تحتوي على الدماغ تحت مجسم، وباستخدام اثنين من ملقط طرف حاد، وإزالة السحاي من الدماغ(الشكل 1).
  7. فصل القشريات من بقية الدماغ عن طريق المتداول بلطف لهم بعيدا عن الخط المتوسط للدماغ باستخدام ملعقة.
  8. جمع كل من القشريات ونقلها على الفور إلى نفس microtube تحتوي على 1 مل من HBSS الباردة.

2. العزلة الفلكية والثقافة

  1. تحت تدفق صفح، وقطع الأنسجة القشرية إلى قطع صغيرة باستخدام مقص صغير منحني، وغسلها مع 1 مل من HBSS عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3x. انتظر حتى يستقر النسيج. إزالة HBSS وإضافة HBSS جديدة، وتكرار العملية مرتين أخريين.
  2. إزالة HBSS واحتضان الأنسجة مع 1 مل من 0.05٪ تريبسين في 37 °C لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: هضم التريبسين فقط كافية عند هذه النقطة.
  3. ينفصم ميكانيكيا الأنسجة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا 15x.
    ملاحظة: يلاحظ التفكك الكامل للأنسجة من خلال زيادة عكر التعليق وعدم وجود شظايا كبيرة من الأنسجة في التعليق.
  4. نقل الحل إلى أنبوب مخروطي 15 مل، تحييد نشاط التربسين بإضافة حجم متساو من FBS، وتصفية الحل في مرشح مصفاة الخلية من 0.4 ميكرومتر لإزالة شظايا غير مفككة.
  5. غسل مرشح مع 1 مل من الخلايا الفلكية المتوسطة، وجمع تعليق الخلية التي مرت من خلال مصفاة، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز و 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant وتعليق بيليه في 1 مل من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة.
  6. نقل تعليق الخلية إلى قارورة الثقافة T25، تشكل حجم المتوسط إلى 3.5 مل، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. تأكد من أن بعد 24 ساعة، والخلايا هي المنضمة. ثم، استبدال المتوسط وتغييره كل 3 أيام.
  8. بعد 7 أيام، وإزالة microglia وoligodendrocytes من الثقافة عن طريق غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
  9. استبدال حل برنامج تلفزيوني مع الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة وترك قارورة الثقافة في شاكر المدارية في 180 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تشكل الخلايا الفلكية طبقة أحادية التقاء في حوالي 10-12 يوما من الثقافة.

3. توليف الجيلاتين ميثاكريلويل (جيلما)

  1. وزن 10 غرام من الجيلاتين التي تم الحصول عليها من الجلد porcine وتذوب في 100 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق السماح للحل يحرك على لوحة التدفئة في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية حتى حل كامل.
  2. تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 2 مل من أنهيدريد الميثاكرليك (MA) للحصول على درجة منخفضة من الوظيفية، والسماح للمستحلب الجيلاتين اثارة في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    تحذير: بيان مخاطر MA: H302 + H332 (ضار إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه)، H311 (سام في ملامسة الجلد)، 314 (يسبب حروق الجلد الشديدة وتلف العين)، 315 (يسبب تهيج الجلد), H317 (قد يسبب رد فعل تحسسي الجلد), H318 (يسبب تلف العين خطيرة), 331 (السامة إذا استنشق), H332 (ضارة إذا استنشق), H335 (قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي). إرشادات المناولة: P261 (تجنب تنفس الغبار / الدخان / الغاز / الضباب / الأبخرة / الرش) ، P305 + P351 + P338 + P310 (IF IN EYES: اشطف بحذر بالماء لعدة دقائق. إزالة العدسات اللاصقة، إذا كانت موجودة وسهلة للقيام. اتصل فورا بمركز السموم / الطبيب)، P301 + P312 + P330 (إذا ابتلع: اتصل بمركز السموم / الطبيب إذا كنت تشعر بتوعك. شطف الفم).
    ملاحظة: إضافة MA ببطء شديد، إسقاط بالإفلات.
  3. تمييع الحل الجيلاتين MA في 100 مل من برنامج تلفزيوني مسخن (50 درجة مئوية) للحصول على 200 مل من الحجم النهائي والسماح للحل يحرك في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قطع ~ 20 سم من غشاء غسيل الكلى (قطع الجزيئية 12-14 كيلودا) ونقع في الماء deionized حتى يصبح لينة.
    ملاحظة: ملء الأغشية مع الماء deionized للتأكد من عدم وجود ثقوب أو عيوب.
  5. باستخدام قمع، نقل الحل الجيلاتين MA إلى الأغشية.
    ملاحظة: أغلق كلا الجانبين تاركا مساحة إضافية في الداخل للسماح بالخليط.
  6. ضع الأغشية التي تحتوي على محلول الجيلاتين-MA في وعاء يحتوي على 2 لتر من الماء المقطر لغسيل الكلى، مما يسمح لها بالإثارة عند 40 درجة مئوية لمدة 5 أيام (500 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: قم بتغطية الحاوية لتجنب تبخر الماء.
  7. تغيير الماء المقطر مرتين في اليوم. في كل مرة، والوجه الأغشية رأسا على عقب لتحقيق التجانس.
  8. في اليوم الخامس، اخلطي 200 مل من المياه فائقة التسخين (40 درجة مئوية) إلى الجيلاتين-MA الممسخن، واتركيه يحرك لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  9. نقل الحل الجيلاتين MA إلى أنابيب مخروطية 50 مل تصل إلى 25 مل والسماح للأنابيب تبقى في -80 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    ملاحظة: تخزين الأنابيب أفقيا لتسهيل lyophilization.
  10. Lyophilize الحلول المجمدة لمدة 3-5 أيام وتخزين GelMA lyophilized المحمية من الرطوبة.

4. إعداد بيوينك

ملاحظة: من أجل الحصول على 1 مل من bioink، فمن المستحسن لتصنيع ما لا يقل عن 3 مل من محلول المواد الحيوية، كما قد يكون هناك خسائر أثناء الترشيح.

  1. إعداد محلول الفيبرينوجين
    1. إعداد محلول ملحي (NaCl 0.9٪) في الماء deionized، وتذوب 10 ملغ من الفيبرينوجين من البلازما البقرية في 1 مل من محلول ملحي للحصول على تركيز 10 ملغم / مل.
      ملاحظة: كما الامتزازات الفيبرينوجين إلى الزجاج، لا تستخدم قوارير الزجاج لإعداد محلول الفيبرينوجين.
    2. اترك الحل تحت الهياج عند 37 درجة مئوية حتى الانحلال الكامل للفيبرينوجين.
      ملاحظة: لحل الفيبرينوجين، استخدم نظام دوار يوضع داخل الفرن عند 37 درجة مئوية. الهياج المغناطيسي (180 دورة في الدقيقة) من الفيبرينوجين على طبق ساخن عند 37 درجة مئوية هو أيضا مناسبة. تحت هذه الحالة، 10 ملغم/مل الفيبرينوجين يستغرق حوالي 40 دقيقة لتذوب.
  2. إعداد الجيلاتين / جيلما الحل
    1. وزن 0.12 غرام من الجيلاتين وإضافته إلى 1.9 مل من برنامج تلفزيوني مسخن (40 درجة مئوية) للحصول على تركيز نهائي من 4٪ (ث / الخامس) الجيلاتين. دوامة لتسهيل حل.
    2. الحفاظ على مستحلب في 40 درجة مئوية حتى حل كامل.
    3. وزن 0.06 غرام من هلام الليوفيلي ونقلها إلى محلول الجيلاتين للحصول على تركيز نهائي من 2٪ (ث / v) GelMA. دوامة لتسهيل حل.
    4. احتفظ بالحل عند 40 درجة مئوية حتى ينحل بالكامل.
  3. إعداد الجيلاتين المحملة بالخلايا الفلكية / GelMA / الفيبرينوجين bioink
    1. ماصة 0.9 مل من محلول الفيبرينوجين 10 ملغم/مل ونقلها إلى محلول الجيلاتين/جيلما للحصول على تركيز نهائي من 3 ملغم/مل من الفيبرينوجين.
    2. وزن 0.015 غرام من الضوئي (PI) ونقلها إلى حل الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين للحصول على تركيز نهائي من 0.5 ٪ (ث / الخامس) PI. امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب صعودا وهبوطا وإبقائه عند درجة حرارة 40 درجة مئوية محميا من الضوء لتجنب تدهور PI.
      ملاحظة: قم بتخزين المنك الحيوي عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة.
    3. تحت تدفق صفح، فلتر الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
      ملاحظة: يجب أن يكون محلول المواد الحيوية عند 37-40 درجة مئوية للسماح بالترشيح.
    4. نقل 980 ميكرولتر من محلول المواد الحيوية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    5. تمييع صفمين في محلول ملحي للحصول على محلول مخزون من 100 ميكروغرام / مل.
    6. ماصة 20 ميكرولتر من اللامينين ونقلها إلى أنبوب يحتوي على bioink للحصول على تركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل صفمين.
    7. مزيج بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب فقاعات. إذا استمرت أي فقاعات، طرد مركزي أنبوب مخروطي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة. حافظ على نسبة 37 درجة مئوية حتى يتم خلطها مع الخلايا.
    8. جرب الخلايا الفلكية الأولية مع 0.05٪ تريبسين لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: استخدام الخلايا الفلكية من المقاطع 1 إلى 3.
    9. تحييد نشاط التريبسين مع FBS بنسبة 1:1 ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. عد الخلايا ونقل 1 × 106 خلايا إلى أنبوب مخروطي مختلف. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    11. إزالة supernatant ترك حجم صغير (~ 200 ميكرولتر) لتعليق بيليه الخلية، عن طريق التنصت بلطف الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.
    12. نقل 1 مل من الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين حل للأنبوب الذي يحتوي على الخلايا وماصة بلطف صعودا وهبوطا لتجانس، والحصول على تركيز النهائي من 1 × 106 خلايا / مل.

5. إعداد الحل عبر الوصلات

  1. إعادة تشكيل ثروبين
    1. إعداد محلول الأسهم من thrombin 100 U/mL في الماء deionized العقيمة مع 0.1٪ (ث / v) ألبوم مصل البقر (BSA) في أنبوب مخروطي 15 مل. المخزون في الأنابيب الصغيرة عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كما الموازات thrombin إلى الزجاج، لا تستخدم قوارير الزجاج لإعداد حل الأسهم أو تخزين aliquots.
  2. إعداد حل ثروبين-كاكل2
    1. ماصة 100 ميكرولتر من محلول مخزون الثرومبين ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 8.9 مل من الماء deionized العقيمة للحصول على تركيز نهائي من 1 U / مل thrombin.
    2. إعداد محلول CaCl2 بنسبة 10٪ (ث/v) في الماء الم ديونيز وتعقيم باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
    3. نقل 1.1 مل من محلول CaCl2 10٪ إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الثرومبين ، من أجل الحصول على نسبة نهائية من 1:9 (CaCl2 إلى thrombin).
      ملاحظة: تحضير الحل crosslinker في وحدة التخزين لاستخدامها في التجربة، تجنب التخزين.

6. Bioprinting الخلايا الفلكية محملة bioink باستخدام الطابعة الحيوية القائمة على البثق

  1. تصميم الأنسجة العصبية
    1. باستخدام G-code: إنشاء شبكة من 6 × 6 مم (شكل مربع) مع 1 مم من المسافة بين كل خط مطبوع بيولوجيا على المحورين X و Y، و 6 طبقات على المحور Z (0.2 مم بين كل خط)؛ تعيين البثق (E) إلى 0.01 مم، وزيادة 0.001 مم في كل طبقة جديدة من المحور Z؛ وتعيين سرعة الطباعة (F) إلى 400 ملم / دقيقة (معلومات تكميلية).
  2. إعداد الطابعة الحيوية
    1. تعريض الجهاز للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ومن ثم مسح عليه مع الإيثانول 70٪.
    2. قم بتشغيل الطابعة الحيوية باستخدام مفتاح الطاقة. قم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال كابل USB. افتح برنامج التحكم لتوصيله بالطباعة الحيوية وتحميل تصميم الملف.
  3. إعداد حقنة الطباعة الحيوية
    1. نقل الجيلاتين المحملة الخلايا الفلكية / GelMA / الفيبرينوجين bioink إلى حقنة بلاستيكية 5 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
      ملاحظة: نقل ببطء لتجنب تشكيل فقاعة.
    2. قم بتوصيل إبرة معقمة 22 G حادة إلى الحقنة.
      ملاحظة: اترك الحقنة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين.
    3. قم بتوصيل المحقنة برأس الطباعة البيولوجية وامسح يدويا المنك الحيوي لإزالة الفقاعات المتبقية.
  4. الطباعة الحيوية
    ملاحظة: تم إجراء الطباعة الحيوية خارج غطاء محرك السيارة.
    1. ضع طبق ثقافة 35 مم على طاولة الطابعة الحيوية وضع الإبرة 0.1 مم بعيدا عن سطح طبق الثقافة للسماح حركة الإبرة.
      ملاحظة: استخدم طبق ثقافة واحد مقاس 35 مم لكل بصمة بيولوجية.
    2. اضغط على الزر طباعة.
    3. بمجرد الطباعة الحيوية ، تأكد من أن الحقنة تبتعد عن الطبق. ثم أغلق طبق الثقافة واستعد لعملية الربط المتبادل.
      ملاحظة: الطباعة الحيوية لبناء واحد يستغرق حوالي 1 دقيقة و 10 ق.
  5. الربط بين البناء والثقافة المطبوعة بيولوجيا
    1. ضع طبق الثقافة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على 2 كيلوواط / سم2 ل2 × 60 ثانية (صعودا وهبوطا) لGelMA crosslinking.
    2. تحت تدفق الصفيحة ، قم بنقل البناء المطبوع بيولوجيا إلى لوحة من 24 بئرا باستخدام ملعقة معقمة.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من حل thrombin / CaCl2 وترك لمدة 30 دقيقة للسماح للربط المتبادل الفيبرين.
    4. إزالة الحل crosslinking وغسل بناء مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x. ثم، استبدال برنامج تلفزيوني مع 1 مل من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير المتوسطة كل 3 أيام.

7. تقييم قابلية الخلايا الفلكية للحياة

  1. صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا
    1. نقل البناء المطبوع بيولوجيا إلى طبق ثقافة 35 ملم باستخدام ملعقة.
    2. غسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. إيداع 100 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت على البناء وإبقائه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يبقيه محميا من الضوء.
    4. إزالة كاشف لايف / الميت وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    5. نقل العينة إلى طبق confocal باستخدام ملعقة، ومراقبة الخلايا داخل بناء تحت المجهر confocal باستخدام 488 و 570 نانومتر الإثارة للحصول على الصور.
      ملاحظة: استخدام تكبير 10x لتصور الكلي للخلايا داخل البناء.
    6. تأكد من أن العينة مسطحة. إذا لزم الأمر، ضع غطاء فوق العينة لزيادة التسطيح.
      ملاحظة: أثناء التصوير، تأكد من أن طبق الكونفوجكال مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.
    7. حساب عدد قابلة للحياة (الأخضر) والميت (الأحمر) باستخدام برنامج حسابي.
  2. صلاحية ثقافة الخلايا الفلكية 2D
    1. البذور 0.5 × 106 الخلايا الفلكية (مرور 1-3) في طبق confocal 35 ملم، إضافة الخلايا الفلكية المتوسطة، واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. عندما تكون الخلايا التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة ويغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. إيداع 200 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت، والحفاظ على الطبق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
    4. إزالة كاشف لايف / الميت وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    5. خذ الطبق إلى مجهر كونفوجال إلى جانب كاميرا رقمية ، واستخدم 488 و 570 نانومتر من الإثارة للحصول على الصورة.
    6. حساب عدد قابلة للحياة (الأخضر) والميت (الأحمر) باستخدام برنامج حسابي.

8. الاحتواء المناعي للخلايا الفلكية

  1. بروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP) تلطيخ الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد
    ملاحظة: للتحقيق في وجود علامات الخلية الأخرى تغيير الأجسام المضادة الأساسية وفقا لذلك.
    1. إزالة المتوسطة من البئر وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3x.
    2. إضافة 4٪ paraformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى البئر حتى يتم تغطية البناء بالكامل وتركه لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
    3. إزالة PFA وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3x.
      ملاحظة: يمكن إيقاف هذا الإجراء مؤقتا لعدة أشهر إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية في PBS. تأكد من أن لوحة البئر مختومة لتجنب تبخر PBS.
    4. علاج العينة مع الجليسين 0.1 مول / لتر لمدة 5 دقائق.
    5. غسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق.
    6. Permeabilize العينة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 10٪ FBS لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية تحت التحريض المداري.
    7. احتضان بناء مع الدجاج المضادة GFAP (تخفيف الأجسام المضادة الأولية 1:500) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    8. يستنشق الأجسام المضادة الأساسية ويغسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، 3 مرات.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة الأساسية لعدة مرات عند تخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    9. احتضان العينة مع اليكسا فلور 488-اقتران المضادة للدجاج (تخفيف الأجسام المضادة الثانوية 1:500) و 1 ميكروغرام / مل DAPI لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية تحت التحريض المداري.
      ملاحظة: الاحتفاظ العينة محمية من الضوء.
    10. غسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، 3 مرات.
    11. نقل البناء إلى طبق confocal 35 ملم.
      ملاحظة: تأكد من أن الطبق مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.
  2. بروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP) تلطيخ ثقافة الخلايا الفلكية 2D
    1. البذور 0.5 × 106 الخلايا الفلكية (مرور 1-3) في طبق confocal 35 ملم، إضافة الخلايا الفلكية المتوسطة، واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. عندما تكون الخلايا التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسلها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. كرر الخطوات 8.1.2-8.1.10.
  3. هيكل الخلايا الفلكية تلطيخ
    1. كرر الخطوات 8.1.1-8.1.6.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من محلول phalloidin الفلورسنت المترافق في برنامج تلفزيوني و 1 ميكروغرام / مل من DAPI على البناء.
    3. احتضان لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية تحت الهياج المداري، والحفاظ على العينة محمية من الضوء.
    4. غسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3 مرات، ونقل بناء إلى طبق confocal باستخدام ملعقة.
      ملاحظة: تأكد من أن الطبق مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.

9. التصوير الكونفوجال

  1. خذ الأطباق إلى مجهر كونفوجال إلى جانب كاميرا رقمية للتصوير (359 و 488 و 570 نانومتر من الإثارة).
  2. استخدم تكبير 10x للتصور الكلي و40 أو 63x للصور التكبير من الخلايا.
    ملاحظة: تأكد من أن العينة يجلس مسطح. إذا لزم الأمر، ضع غطاء فوق العينة لزيادة التسطيح.

النتائج

يهدف هذا العمل إلى تطوير نسيج يشبه العصبية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإيداع الجيلاتين /GelMA/fibrinogen bioink الأولي المشحون بالخلايا الفلكية طبقة بطبقة. تم استخراج الخلايا الفلكية وعزلها عن قشرة الدماغ من جراء الفئران (الشكل 1) ، إضافة إلى تكوين المواد الحيوية ...

Discussion

ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كبديل ل الصنع الحيوي يسمح بهندسة البنى المكررة التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا الأنسجة الأصلية22، بما في ذلك الدماغ23. يسمح التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالعصبية بنمذجة البيئة الدقيقة الأصلية في المختبر ، كونها أداة ?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP)، وأرقام المنح 2018/23039-3 و2018/12605-8؛ المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية ،أرقام المنح 465656/2014-5 و 309679/2018-4 وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES)، القانون المالي 001.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved