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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous rapportons ici une méthode de bioimpression 3D d’astrocytes corticaux murins pour la biofabrication de tissus de type neuronal afin d’étudier la fonctionnalité des astrocytes dans le système nerveux central et les mécanismes impliquant les cellules gliales dans les maladies neurologiques et les traitements.

Résumé

Les astrocytes sont des cellules gliales ayant un rôle essentiel dans le système nerveux central (SNC), y compris le soutien et la fonctionnalité neuronals. Ces cellules répondent également aux lésions neurales et agissent pour protéger le tissu contre les événements dégénératifs. Les études in vitro de la fonctionnalité des astrocytes sont importantes pour élucider les mécanismes impliqués dans de tels événements et contribuer au développement de thérapies pour traiter les troubles neurologiques. Ce protocole décrit une méthode pour biofabriquer une structure tissulaire de type neuronal riche en astrocytes par bioimpression 3D d’une bioencaire chargée d’astrocytes. Une bioimprimante 3D à base d’extrusion a été utilisée dans ce travail, et les astrocytes ont été extraits des cortex cérébraux des chiots de souris C57Bl / 6. La bioencentaire a été préparée en mélangeant des astrocytes corticaux jusqu’au passage 3 à une solution de biomatériau composée de gélatine, de gélatine-méthacryloyle (GelMA) et de fibrinogène, complétée par de la laminine, qui présentait des conditions optimales de bioimpression. Les conditions de bio-impression 3D ont minimisé le stress cellulaire, contribuant à la haute viabilité des astrocytes pendant le processus, dans lequel 74,08% ± 1,33% des cellules étaient viables juste après la bioimpression. Après 1 semaine d’incubation, la viabilité des astrocytes a considérablement augmenté à 83,54% ± 3,00%, ce qui indique que la construction 3D représente un microenvironnement approprié pour la croissance cellulaire. La composition du biomatériau a permis l’attachement cellulaire et stimulé le comportement astrocytaire, les cellules exprimant la protéine acide fibrillaire gliale marqueur astrocytaire spécifique des astrocytes (GFAP) et possédant une morphologie astrocytaire typique. Ce protocole reproductible fournit une méthode précieuse pour biofabriquer des tissus de type neuronal 3D riches en astrocytes qui ressemblent au microenvironnement natif des cellules, utile aux chercheurs qui visent à comprendre la fonctionnalité des astrocytes et leur relation avec les mécanismes impliqués dans les maladies neurologiques.

Introduction

Les astrocytes sont le type de cellule le plus abondant dans le système nerveux central (SNC) et jouent un rôle clé dans l’homéostasie cérébrale. En plus de supporter le neurone, les astrocytes sont responsables de la modulation de l’absorption des neurotransmetteurs, du maintien de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et de la régulation de la synaptogenèse neuronale1,2. Les astrocytes ont également un rôle essentiel dans l’inflammation du SNC, répondant aux lésions cérébrales dans un processus qui conduit à la réactivité astrocitaire ou à l’astrogliose réactive3,4 , formant une cicatriceglialequi empêche l’exposition des tissus sains aux agents dégénératifs5. Cet événement entraîne des changements dans l’expression génique, la morphologie et la fonction des astrocytes6,7. Par conséquent, les études portant sur la fonctionnalité des astrocytes sont utiles pour le développement de thérapies pour traiter les troubles neurologiques.

Les modèles in vitro sont cruciaux pour étudier les mécanismes liés aux lésions neurologiques, et bien que l’isolement réussi et la culture bidimensionnelle (2D) des astrocytes corticaux aient été établis8,ce modèle ne parvient pas à fournir un environnement réaliste qui imite le comportement des cellules natives et à reproduire la complexité du cerveau9 . Dans l’état 2D, le faible soutien mécanique et biochimique, les faibles interactions cellule-cellule et cellule-matrice, et l’aplatissement cellulaire conduisant à l’absence de polarité baso-apicale, affectent la dynamique de signalisation cellulaire et les résultats expérimentaux conduisant à une altération de la morphologie cellulaire et de l’expression des gènes, qui compromettent la réponse aux traitements10. Par conséquent, il est crucial de développer des alternatives qui fournissent un environnement neuronal plus réaliste, visant à traduire les résultats à la clinique.

La culture cellulaire tridimensionnelle (3D) représente un modèle plus avancé qui récapitule avec des caractéristiques de fidélité accrues des organes et des tissus, y compris leSNC 11. En ce qui concerne la culture gliale, les modèles 3D contribuent au maintien de la morphologie des astrocytes, de la polarité baso-apicale cellulaire et de la signalisation cellulaire12,13. La technologie de bio-impression 3D est apparue comme un outil puissant pour biofabriquer des tissus vivants 3D de manière contrôlée en utilisant des cellules et des biomatériaux pour recréer la structure et les propriétés des tissus natifs. L’utilisation de cette technologie a conduit à une amélioration substantielle de la prédiction des résultats et a contribué à la médecine régénérative appliquée au SNC14,15,16.

Le protocole décrit ici détaille l’isolement et la culture des astrocytes corticaux. Le protocole détaille également une méthode reproductible pour bioimprimer des astrocytes incorporés dans de la gélatine / méthacryloyle de gélatine (GelMA) / fibrinogène, complétés par de la laminine. Dans ce travail, une bioimprimante à base d’extrusion a été utilisée pour imprimer la composition de biomatériau contenant des astrocytes corticaux à une densité de 1 x 106 cellules / mL. La contrainte de cisaillement de la bio-impression a été minimisée en contrôlant la vitesse d’impression, et les astrocytes ont montré une viabilité élevée après le processus. Les constructions bioimprimées ont été cultivées pendant 1 semaine, et les astrocytes ont pu se propager, se fixer et survivre dans l’hydrogel, en maintenant la morphologie astrocytaire et en exprimant un marqueur spécifique de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)4.

Cette procédure est compatible avec les bioimprimantes à base d’extrusion à piston et peut être utilisée pour bioimprimer des astrocytes dérivés de différentes sources. Le modèle bioimprimé en 3D proposé ici convient à un large éventail d’applications d’ingénierie neuronale, telles que l’étude des mécanismes impliqués dans la fonctionnalité des astrocytes dans les tissus sains et la compréhension de la progression des pathologies neurologiques et du développement de traitements.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont suivi les directives internationales pour l’utilisation des animaux dans la recherche (http://www.iclas.org) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Dissection cérébrale de souris

  1. Transférer 10 mL de solution saline tamponnée Hanks froide (HBSS) dans une boîte de culture de 100 mm et 1 mL dans un microtube de 1,5 mL. Préparez un microtube par animal.
    REMARQUE: La boîte de culture et le microtube doivent être conservés sur la glace.
  2. Préparer le milieu de culture des astrocytes en utilisant DMEM F12 + 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2% de glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (P / S). Stériliser le milieu en filtrant à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
  3. Euthanasier les chiots souris C57Bl/6 (jour 1 postnatal) par décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant. À l’aide d’une pince, tirez la peau et exposez le crâne. Assurez-vous que les ciseaux et les pinces sont stérilisés avec de l’éthanol à 70%.
  4. Coupez le crâne du foramen magnum au sommet de la tête le long du plan sagittal à l’aide d’un ciseau à pointe incurvée et pointue.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tissu encéphale n’est pas endommagé.
  5. À l’aide d’une spatule préalablement stérilisée à l’éthanol à 70%, soulevez le cerveau de la cavité crânienne et placez-le dans la boîte de culture contenant 10 mL de HBSS froid.
  6. Placez la boîte de culture contenant le cerveau sous le stéréomicroscope et, à l’aide de deux pinces à pointe émoussée, retirez les méninges du cerveau (Figure 1).
  7. Séparez les cortex du reste du cerveau en les faisant rouler doucement loin de la ligne médiane du cerveau à l’aide d’une spatule.
  8. Recueillir les deux cortex et les transférer immédiatement dans le même microtube contenant 1 mL de HBSS froid.

2. Isolement et culture des astrocytes

  1. Sous le flux laminaire, coupez le tissu cortical en petits morceaux à l’aide d’un micro-ciseau incurvé et lavez-les avec 1 mL de HBSS en pipetant de haut en bas 3x. Attendez que le tissu s’installe. Retirez HBSS et ajoutez du HBSS frais, en répétant le processus deux fois de plus.
  2. Retirer HBSS et incuber le tissu avec 1 mL de trypsine à 0,05 % à 37 °C pendant 5 min.
    REMARQUE: Seule la digestion de la trypsine est suffisante à ce stade.
  3. Dissocier mécaniquement le tissu en pipetant doucement de haut en bas 15x.
    NOTE: La dissociation complète du tissu est observée par l’augmentation de la turbidité de la suspension et par l’absence de gros fragments de tissu dans la suspension.
  4. Transférer la solution dans un tube conique de 15 mL, neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant un volume égal de FBS et filtrer la solution dans un filtre à crépine cellulaire de 0,4 μm pour éliminer les fragments non dissociés.
  5. Laver le filtre avec 1 mL de milieu astrocytaire, prélever la suspension cellulaire qui a traversé la passoire et la centrifuger pendant 5 min à 200 x g et 25 °C. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 1 mL de milieu de culture d’astrocytes.
  6. Transférer la suspension cellulaire dans une fiole de culture T25, porter le volume du milieu à 3,5 mL et incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2.
  7. Assurez-vous qu’après 24 h, les cellules adhèrent. Ensuite, remplacez le support et changez-le tous les 3 jours.
  8. Après 7 jours, retirer les microglies et les oligodendrocytes de la culture en lavant les cellules avec 2 mL de 1x PBS.
  9. Remplacer la solution pbS par le milieu de culture des astrocytes et laisser la fiole de culture dans un agitateur orbital à 180 tr/min pendant la nuit.
    REMARQUE: Les astrocytes forment une monocouche confluente en environ 10 à 12 jours de culture.

3. Synthèse de la gélatine méthacryloyl (GelMA)

  1. Peser 10 g de gélatine obtenue à partir de peau de porc et dissoudre dans 100 mL de PBS en laissant la solution remuer sur une plaque chauffante à 240 tr/min et 50 °C jusqu’à dissolution complète.
  2. Sous une hotte, ajouter 2 mL d’anhydride méthacrylique (AM) pour un faible degré de fonctionnalisation, et laisser l’émulsion de gélatine remuer à 240 tr/min et 50 °C pendant 2 h.
    ATTENTION : Mention de danger de l’AM : H302 + H332 (nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation), H311 (toxique au contact de la peau), 314 (provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires), 315 (provoque une irritation de la peau), H317 (peut provoquer une réaction allergique cutanée), H318 (provoque de graves lésions oculaires), 331 (toxique en cas d’inhalation), H332 (nocif en cas d’inhalation), H335 (peut provoquer une irritation respiratoire). Directives de manipulation: P261 (éviter de respirer de la poussière / fumée / gaz / brouillard / vapeurs / pulvérisation), P305 + P351 + P338 + P310 (SI DANS LES YEUX: Rincer prudemment à l’eau pendant plusieurs minutes. Retirez les lentilles de contact, si elles sont présentes et faciles à faire. Continuez le rinçage. Appelez immédiatement un CENTRE ANTIPOISON / médecin), P301 + P312 + P330 (SI AVALÉ: Appelez un CENTRE ANTIPOISON / médecin si vous ne vous sentez pas bien. Rincer la bouche).
    REMARQUE: Ajoutez MA très lentement, goutte à goutte.
  3. Diluer la solution de gélatine-MA dans 100 mL de PBS préchauffé (50 °C) pour obtenir 200 mL de volume final et laisser remuer la solution à 240 tr/min et 50 °C pendant 10 min.
  4. Coupez ~20 cm de membrane de dialyse (coupure moléculaire 12-14 kDa) et faites-la tremper dans de l’eau désionisée jusqu’à ce qu’elle soit molle.
    REMARQUE: Remplissez les membranes avec de l’eau désionisée pour vous assurer qu’il n’y a pas de trous ou de défauts.
  5. À l’aide d’un entonnoir, transférer la solution de gélatine-MA aux membranes.
    REMARQUE: Fermez les deux côtés en laissant plus d’espace à l’intérieur pour permettre le mélange.
  6. Placer les membranes contenant la solution de gélatine-MA dans un récipient contenant 2 L d’eau distillée pour la dialyse, en les laissant remuer à 40 °C pendant 5 jours (500 tr/min).
    REMARQUE: Couvrez le récipient pour éviter l’évaporation de l’eau.
  7. Changez l’eau distillée deux fois par jour. A chaque fois, retournez les membranes à l’envers pour l’homogénéisation.
  8. Le cinquième jour, mélanger 200 mL d’eau ultrapure préchauffée (40 °C) à la gélatine-MA dialysée et laisser remuer pendant 15 min à 40 °C.
  9. Transférer la solution de gélatine-MA dans des tubes coniques de 50 mL jusqu’à 25 mL et laisser les tubes rester à -80 °C pendant 2 jours.
    REMARQUE: Stockez les tubes horizontalement pour faciliter la lyophilisation.
  10. Lyophiliser les solutions congelées pendant 3-5 jours et conserver le GelMA lyophilisé à l’abri de l’humidité.

4. Préparation Bioink

REMARQUE: Afin d’obtenir 1 mL de bioencaire, il est recommandé de fabriquer au moins 3 mL de solution de biomatériau, car il peut y avoir des pertes pendant la filtration.

  1. Préparation de la solution de fibrinogène
    1. Préparer une solution saline (NaCl 0,9%) dans de l’eau désionisée et dissoudre 10 mg de fibrinogène du plasma bovin dans 1 mL de la solution saline pour obtenir une concentration de 10 mg/mL.
      REMARQUE: Comme le fibrinogène s’adsorbe sur le verre, n’utilisez pas de flacons en verre pour préparer la solution de fibrinogène.
    2. Laisser la solution sous agitation à 37 °C jusqu’à dissolution complète du fibrinogène.
      REMARQUE: Pour la dissolution du fibrinogène, utilisez un système rotatif placé à l’intérieur d’un four à 37 ° C. L’agitation magnétique (180 tr/min) du fibrinogène sur une plaque chauffante à 37 °C convient également. Dans ces conditions, 10 mg/ mL de fibrinogène prend environ 40 minutes pour se dissoudre.
  2. Préparation de la solution de gélatine/GelMA
    1. Peser 0,12 g de gélatine et l’ajouter à 1,9 mL de PBS préchauffé (40 °C) pour obtenir une concentration finale de 4 % (p/v) de gélatine. Vortex pour faciliter la dissolution.
    2. Conserver l’émulsion à 40 °C jusqu’à dissolution complète.
    3. Peser 0,06 g de GelMA lyophilisé et transférer dans la solution de gélatine pour obtenir une concentration finale de GelMA à 2% (p/v). Vortex pour faciliter la dissolution.
    4. Conserver la solution à 40 °C jusqu’à dissolution complète.
  3. Préparation de la gélatine chargée d’astrocytes / GelMA / fibrinogène bioink
    1. Pipeter 0,9 mL de la solution de fibrinogène 10 mg/mL et transférer dans la solution de gélatine/GelMA pour obtenir une concentration finale de 3 mg/mL de fibrinogène.
    2. Peser 0,015 g de photoinitiateur (IP) et transférer dans la solution de gélatine/GelMA/fibrinogène pour obtenir une concentration finale de 0,5 % (p/v) PI. Mélanger la solution en retournant le tube de haut en bas et le maintenir à 40 °C à l’abri de la lumière pour éviter la dégradation de l’IP.
      REMARQUE: Stockez la bioencent à 4 °C pendant un maximum de 24 h.
    3. Sous l’écoulement laminaire, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm dans un tube conique stérile de 15 mL.
      REMARQUE: La solution de biomatériau doit être à 37-40 ° C pour permettre la filtration.
    4. Transférer 980 μL de la solution de biomatériau dans un tube conique de 15 mL.
    5. Diluer la laminine dans une solution saline pour obtenir une solution stock de 100 μg/mL.
    6. Pipette 20 μL de laminine et transfert dans le tube contenant la bioencaire pour obtenir une concentration finale de 2 μg/mL de laminine.
    7. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas, en évitant les bulles. Si des bulles persistent, centrifugez le tube conique à 200 x g pendant 2 min. Gardez la bioencentée à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit mélangée aux cellules.
    8. Trypsiniser les astrocytes primaires avec 0,05% de trypsine pendant 5 min.
      REMARQUE: Utilisez les astrocytes des passages 1 à 3.
    9. Neutraliser l’activité de la trypsine avec FBS dans un rapport de 1:1 et transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Centrifugez-le à 200 x g pendant 5 min.
    10. Comptez les cellules et transférez 1 x 106 cellules dans un autre tube conique. Centrifugez-le à 200 x g pendant 5 min.
    11. Retirez le surnageant en laissant un petit volume (~200 μL) pour suspendre la pastille cellulaire, en tapotant doucement le fond du tube conique.
    12. Transférer 1 mL de solution de gélatine/GelMA/fibrinogène dans le tube contenant les cellules et pipeter doucement de haut en bas pour homogénéiser, obtenant une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.

5. Préparation de la solution de réticulation

  1. Reconstitution de la thrombine
    1. Préparer une solution stock de thrombine 100 U/mL dans de l’eau désionisée stérile avec 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tube conique de 15 mL. Stocker en microtubes à -20 °C.
      REMARQUE: Comme la thrombine s’adsorbe sur le verre, n’utilisez pas de flacons en verre pour préparer la solution d’emballage ou stocker les aliquotes.
  2. Préparation de la solution de thrombine-CaCl2
    1. Pipette 100 μL de solution stock de thrombine et transfert dans un tube conique de 50 mL contenant 8,9 mL d’eau désionisée stérile pour obtenir une concentration finale de 1 U/mL de thrombine.
    2. Préparer une solution de CaCl2 à10 % (p/v) dans de l’eau désionisée et stériliser à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
    3. Transférer 1,1 mL de la solution de CaCl2 à 10 % dans le tube conique contenant de la thrombine, afin d’obtenir un rapport final de 1:9 (CaCl2 à la thrombine).
      REMARQUE: Préparez la solution de réticulation au volume à utiliser dans l’expérience, en évitant le stockage.

6. Bio-impression d’une bioencaire chargée d’astrocytes à l’aide d’une bioimprimante à base d’extrusion

  1. Conception du tissu neural
    1. En utilisant le code G: construire une grille de 6 x 6 mm (forme carrée) avec 1 mm de distance entre chaque ligne bioimprimée sur les axes X et Y, et 6 couches sur l’axe Z (0,2 mm entre chaque ligne); régler l’extrusion (E) sur 0,01 mm, en augmentant de 0,001 mm à chaque nouvelle couche de l’axe Z; et réglez la vitesse d’impression (F) à 400 mm/min(Informations supplémentaires).
  2. Configuration de la bioimprimante
    1. Exposez la machine à la lumière UV pendant 15 minutes, puis essuyez-la avec de l’éthanol à 70%.
    2. Allumez la bioimprimante à l’aide de l’interrupteur d’alimentation. Connectez la machine à l’ordinateur via un câble USB. Ouvrez le logiciel de contrôle pour le connecter à la bioimprimante et charger la conception du fichier.
  3. Préparation de la seringue de bio-impression
    1. Transférer la bioensembre de gélatine/GelMA/fibrinogène chargée d’astrocytes dans une seringue en plastique de 5 mL à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
      REMARQUE: Transférer lentement pour éviter la formation de bulles.
    2. Connectez une aiguille émoussée stérile de 22 G à la seringue.
      REMARQUE: Laissez la seringue à 4 °C pendant 2 min.
    3. Connectez la seringue à la tête d’impression de la bioimprimante et rincez manuellement la bioencaire pour éliminer les bulles restantes.
  4. Bioimpression
    REMARQUE: La bio-impression a été effectuée à l’extérieur de la hotte laminaire.
    1. Placez un plat de culture de 35 mm sur la table de la bioimprimante et placez l’aiguille à 0,1 mm de la surface du plat de culture pour permettre le mouvement de l’aiguille.
      REMARQUE: Utilisez un plat de culture de 35 mm pour chaque bio-impression.
    2. Appuyez sur le bouton Imprimer.
    3. Une fois la bioimpression terminée, assurez-vous que la seringue s’éloigne du plat. Ensuite, fermez le plat de culture et préparez-vous au processus de réticulation.
      REMARQUE: La bio-impression d’une construction prend environ 1 min et 10 s.
  5. Réticulation de la construction et de la culture bio-imprimées
    1. Placez la boîte de culture sous la lumière UV à 2 mW/cm2 pendant 2 x 60 s (haut et bas) pour la réticulation GelMA.
    2. Sous le flux laminaire, transférer la construction bioimprimée sur une plaque de 24 puits à l’aide d’une spatule stérile.
    3. Ajouter 500 μL de solution de thrombine/CaCl2 et laisser agir pendant 30 min pour permettre la réticulation de la fibrine.
    4. Retirez la solution de réticulation et lavez la construction avec 2 mL de PBS 1x. Ensuite, remplacez le PBS par 1 mL de milieu de culture d’astrocytes et incubez à 37 °C et 5% de CO2. Changez le support tous les 3 jours.

7. Évaluation de la viabilité des astrocytes

  1. Viabilité des astrocytes bioimprimés
    1. Transférer la construction bioimprimée dans un plat de culture de 35 mm à l’aide d’une spatule.
    2. Lavez la construction avec 1 mL de 1x PBS.
    3. Déposez 100 μL du réactif vivant/mort sur la construction et maintenez-le à 37 °C pendant 30 min, en le protégeant de la lumière.
    4. Retirez le réactif Live/Dead et lavez la construction avec 1 mL de 1x PBS.
    5. Transférez l’échantillon dans une boîte confocale à l’aide d’une spatule et observez les cellules de la construction sous un microscope confocal en utilisant une excitation de 488 et 570 nm pour l’acquisition d’images.
      REMARQUE : Utilisez un grossissement de 10x pour une visualisation globale des cellules de la construction.
    6. Assurez-vous que l’échantillon est à plat. Si nécessaire, placez un couvercle sur l’échantillon pour augmenter la planéité.
      REMARQUE: Pendant l’imagerie, assurez-vous que le plat confocal est bien scellé pour éviter que l’échantillon ne se dessèche.
    7. Calculez le nombre de viables (vert) et de morts (rouges) à l’aide d’un logiciel de calcul.
  2. Viabilité de la culture d’astrocytes 2D
    1. Ensemencez 0,5 x10 6 astrocytes (passage 1-3) dans un plat confocal de 35 mm, ajoutez le milieu des astrocytes et incubez-les à 37 °C et 5% de CO2.
    2. Lorsque les cellules sont confluentes, retirer le milieu de culture et laver avec 1 mL de 1x PBS.
    3. Déposer 200 μL du réactif Vivant/Mort et maintenir la boîte à 37 °C pendant 30 min, à l’abri de la lumière.
    4. Retirez le réactif Live/Dead et lavez les cellules avec 1 mL de 1x PBS.
    5. Prenez la parabole dans un microscope confocal couplé à un appareil photo numérique et utilisez une excitation de 488 et 570 nm pour l’acquisition d’images.
    6. Calculez le nombre de viables (vert) et de morts (rouges) à l’aide d’un logiciel de calcul.

8. Immunocoloration des astrocytes

  1. Coloration de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) des astrocytes bioimprimés en 3D
    REMARQUE: Pour étudier la présence d’autres marqueurs cellulaires, modifiez l’anticorps primaire en conséquence.
    1. Retirez le milieu du puits et lavez la construction avec 1 mL de 3x PBS.
    2. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS au puits jusqu’à ce que la construction soit complètement recouverte et laisser agir pendant 2 h à 4 °C.
    3. Retirez le PFA et lavez la construction avec 1 mL de PBS 3x.
      REMARQUE: Cette procédure peut être suspendue pendant plusieurs mois si elle est stockée à 4 ° C dans PBS. Assurez-vous que la plaque du puits est scellée pour éviter l’évaporation du PBS.
    4. Traiter l’échantillon avec de la glycine 0,1 mol/L pendant 5 min.
    5. Laver avec 1 mL de 1x PBS pendant 5 min.
    6. Perméabiliser l’échantillon avec du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 10 % de FBS pendant 1 h à 25 °C sous agitation orbitale.
    7. Incuber la construction avec de l’anti-GFAP de poulet (dilution d’anticorps primaires 1:500) à 4 °C pendant la nuit.
    8. Aspirer l’anticorps primaire et laver l’échantillon avec 1 mL de PBS pendant 5 min, 3 fois.
      REMARQUE: L’anticorps primaire peut être réutilisé plusieurs fois lorsqu’il est stocké à 4 ° C.
    9. Incuber l’échantillon avec de l’anti-poulet conjugué Alexa fluor 488 (dilution des anticorps secondaires 1:500) et 1 μg/mL DAPI pendant 1 h à 25 °C sous agitation orbitale.
      REMARQUE: Gardez l’échantillon à l’abri de la lumière.
    10. Lavez l’échantillon avec 1 mL de PBS pendant 5 min, 3 fois.
    11. Transférer la construction dans un plat confocal de 35 mm.
      REMARQUE: Assurez-vous que le plat est bien scellé pour éviter que l’échantillon ne se dessèche.
  2. Coloration de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) de la culture d’astrocytes 2D
    1. Ensemencez 0,5 x10 6 astrocytes (passage 1-3) dans un plat confocal de 35 mm, ajoutez le milieu des astrocytes et incubez-les à 37 °C et 5% de CO2.
    2. Lorsque les cellules sont confluentes, retirez le milieu de culture et lavez-les avec 1 mL de PBS.
    3. Répétez les étapes 8.1.2 à 8.1.10.
  3. Coloration du cytosquelette des astrocytes
    1. Répétez les étapes 8.1.1 à 8.1.6.
    2. Ajouter 200 μL de 50 μg/mL de solution de phalloïdine conjuguée par fluorescence dans du PBS et 1 μg/mL de DAPI sur la construction.
    3. Incuber pendant 1 h à 25 °C sous agitation orbitale, en protégeant l’échantillon de la lumière.
    4. Lavez l’échantillon avec 1 mL de PBS pendant 5 min 3 fois et transférez la construction dans un plat confocal à l’aide d’une spatule.
      REMARQUE: Assurez-vous que le plat est bien scellé pour éviter que l’échantillon ne se dessèche.

9. Imagerie confocale

  1. Emmenez les plats dans un microscope confocal couplé à un appareil photo numérique pour l’imagerie (excitation de 359, 488 et 570 nm).
  2. Utilisez un grossissement de 10x pour une visualisation globale et de 40 ou 63x pour les images agrandies des cellules.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’échantillon est à plat. Si nécessaire, placez un couvercle sur l’échantillon pour augmenter la planéité.

Résultats

Ce travail visait à développer un tissu de type neuronal en utilisant la technologie de bio-impression 3D pour déposer couche par couche de gélatine primaire chargée d’astrocytes / GelMA / fibrinogène bioink. Les astrocytes ont été extraits et isolés du cortex cérébral de chiots souris(Figure 1),ajoutés à une composition de biomatériaux, permettant la biofabrication d’une construction 3D vivante.

La conception assistée par ordinateur (CAO) a ét...

Discussion

La technologie de bio-impression 3D est apparue comme une alternative de biofabrication qui permet l’ingénierie de constructions raffinées qui ressemblent structurellement et physiologiquement à des tissus natifs22, y compris le cerveau23. La biofabrication de tissus de type neuronal permet une modélisation in vitro du microenvironnement natif, étant un outil important pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires associés au développement e...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP), numéros de subvention 2018/23039-3 et 2018/12605-8; Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq), numéros de subvention 465656/2014-5 et 309679/2018-4; et Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES), code financier 001.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

Références

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

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