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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui riportiamo un metodo di bioprinting 3D di astrociti corticali murini per biofabbricare tessuti neurali simili per studiare la funzionalità degli astrociti nel sistema nervoso centrale e i meccanismi che coinvolgono le cellule gliali nelle malattie e nei trattamenti neurologici.

Abstract

Gli astrociti sono cellule gliali con un ruolo essenziale nel sistema nervoso centrale (SNC), compreso il supporto neuronale e la funzionalità. Queste cellule rispondono anche alle lesioni neurali e agiscono per proteggere il tessuto da eventi degenerativi. Gli studi in vitro sulla funzionalità degli astrociti sono importanti per chiarire i meccanismi coinvolti in tali eventi e contribuire allo sviluppo di terapie per il trattamento dei disturbi neurologici. Questo protocollo descrive un metodo per biofabbricare una struttura tissutale simile a quella neurale ricca di astrociti mediante bioink 3D bioprinting carico di astrociti. In questo lavoro è stato utilizzato un bioprinter 3D basato sull'estrusione e gli astrociti sono stati estratti dalle cortecce cerebrali dei cuccioli di topi C57Bl / 6. Il bioink è stato preparato mescolando astrociti corticali fino al passaggio 3 in una soluzione di biomateriale composta da gelatina, gelatina-metacriloile (GelMA) e fibrinogeno, integrata con laminina, che presentava condizioni ottimali di bioprinting. Le condizioni di bioprinting 3D hanno ridotto al minimo lo stress cellulare, contribuendo all'elevata vitalità degli astrociti durante il processo, in cui il 74,08% ± l'1,33% delle cellule erano vitali subito dopo la bioprinting. Dopo 1 settimana di incubazione, la vitalità degli astrociti è aumentata significativamente all'83,54% ± al 3,00%, indicando che il costrutto 3D rappresenta un microambiente adatto per la crescita cellulare. La composizione del biomateriale permetteva l'attaccamento cellulare e stimolava il comportamento astrocitico, con cellule che esprimevano lo specifico marcatore astrocitario della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e possedevano la tipica morfologia astrocitica. Questo protocollo riproducibile fornisce un metodo prezioso per biofabbricare tessuto neurale 3D ricco di astrociti che assomiglia al microambiente nativo delle cellule, utile ai ricercatori che mirano a comprendere la funzionalità degli astrociti e la loro relazione con i meccanismi coinvolti nelle malattie neurologiche.

Introduzione

Gli astrociti sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi cerebrale. Oltre a sopportare il supporto neuronale, gli astrociti sono responsabili della modulazione dell'assorbimento dei neurotrasmettitori, del mantenimento dell'integrità della barriera emato-encefalica e della regolazione della sinaptogenesi neuronale1,2. Gli astrociti hanno anche un ruolo essenziale nell'infiammazione del SNC, rispondendo alle lesioni al cervello in un processo che porta alla reattività astrologica o all'astrogliosi reattiva3,4,formando una cicatrice gliale che impedisce l'esposizione di tessuti sani ad agenti degenerativi5. Questo evento provoca cambiamenti nell'espressione genica, nella morfologia e nella funzione degli astrociti6,7. Pertanto, gli studi che coinvolgono la funzionalità degli astrociti sono utili per lo sviluppo di terapie per il trattamento di disturbi neurologici.

I modelli in vitro sono cruciali per lo studio dei meccanismi legati alle lesioni neurologiche e, sebbene siano stati stabiliti un isolamento di successo e una coltura bidimensionale (2D) di astrociti corticali8, questo modello non riesce a fornire un ambiente realistico che imita il comportamento delle cellule native e a riprodurre la complessità del cervello9 . In condizioni 2D, lo scarso supporto meccanico e biochimico, le basse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice e l'appiattimento cellulare che porta all'assenza di polarità basale-apicale, influenzano la dinamica della segnalazione cellulare e gli esiti sperimentali che portano a un'alterata morfologia cellulare e all'espressione genica, che compromettono la risposta ai trattamenti10. Pertanto, è fondamentale sviluppare alternative che forniscano un ambiente neurale più realistico, con l'obiettivo di tradurre i risultati in clinica.

La coltura cellulare tridimensionale (3D) rappresenta un modello più avanzato che ricapitola con maggiore fedeltà le caratteristiche di organi e tessuti, tra cui il CNS11. Per quanto riguarda la coltura gliale, i modelli 3D contribuiscono al mantenimento della morfologia degli astrociti, della polarità basale-apicale cellulare e della segnalazione cellulare12,13. La tecnologia di bioprinting 3D è emersa come un potente strumento per biofabbricare tessuti viventi 3D in modo controllato utilizzando cellule e biomateriali per ricreare la struttura e le proprietà dei tessuti nativi. L'utilizzo di questa tecnologia ha portato ad un sostanziale miglioramento della previsione dei risultati e ha contribuito alla medicina rigenerativa applicata al SNC 14,15,16.

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'isolamento e la coltura degli astrociti corticali. Il protocollo descrive anche un metodo riproducibile per biostampare astrociti incorporati in gelatina / gelatina metacriloil (GelMA) / fibrinogeno, integrato con laminina. In questo lavoro, una biostampante basata sull'estrusione è stata utilizzata per stampare la composizione del biomateriale contenente astrociti corticali ad una densità di 1 x10 6 cellule / ml. Lo stress di taglio della biostampa è stato ridotto al minimo controllando la velocità di stampa e gli astrociti hanno mostrato un'elevata vitalità dopo il processo. I costrutti biostampati sono stati coltivati per 1 settimana e gli astrociti sono stati in grado di diffondersi, attaccarsi e sopravvivere all'interno dell'idrogel, mantenendo la morfologia astrocitica ed esprimendo uno specifico marcatore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP)4.

Questa procedura è compatibile con bioprinter a base di estrusione azionata da pistone e può essere utilizzata per biostampare astrociti derivati da fonti diverse. Il modello biostampato 3D qui proposto è adatto per una vasta gamma di applicazioni di ingegneria neurale, come gli studi dei meccanismi coinvolti nella funzionalità degli astrociti nei tessuti sani e la comprensione della progressione delle patologie neurologiche e lo sviluppo del trattamento.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito le linee guida internazionali per l'uso degli animali nella ricerca (http://www.iclas.org) e sono state approvate dal Comitato per l'etica nella ricerca dell'Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Dissezione cerebrale dei topi

  1. Trasferire 10 mL di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) fredda in una soluzione di coltura da 100 mm e 1 mL in un microtubo da 1,5 mL. Preparare un microtubo per animale.
    NOTA: Sia il piatto di coltura che il microtubo devono essere tenuti sul ghiaccio.
  2. Preparare il terreno di coltura degli astrociti utilizzando DMEM F12 + 10% di siero bovino fetale (FBS), 2% di glutammina e 1% di penicillina-streptomicina (P / S). Sterilizzare il mezzo filtrando utilizzando un filtro da 0,2 μm.
  3. Eutanasia cuccioli di topi C57Bl/6 (giorno 1 postnatale) per decapitazione usando una forbice affilata. Usando la pince, tirare la pelle ed esporre il cranio. Assicurarsi che sia le forbici che le pinza siano sterilizzate con etanolo al 70%.
  4. Tagliare il cranio dal foramen magnum alla sommità della testa lungo il piano sagittale usando una forbice a punta ricurva affilata.
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto encefalico non sia danneggiato.
  5. Utilizzando una spatola precedentemente sterilizzata con etanolo al 70%, sollevare il cervello dalla cavità cranica e posizionarlo nel piatto di coltura contenente 10 ml di HBSS freddo.
  6. Posizionare il piatto di coltura contenente il cervello sotto lo stereomicroscopio e, usando due pinci a punta smussata, rimuovere le meningi dal cervello (Figura 1).
  7. Separare le cortecce dal resto del cervello facendole rotolare delicatamente lontano dalla linea mediana del cervello usando una spatola.
  8. Raccogliere entrambe le cortecce e trasferirle immediatamente nello stesso microtubo contenente 1 mL di HBSS freddo.

2. Isolamento e coltura degli astrociti

  1. Sotto il flusso laminare, tagliare il tessuto corticale in piccoli pezzi usando una micro forbice curva e lavarli con 1 mL di HBSS tubando su e giù 3x. Attendi che il tessuto si stabilizzi. Rimuovere HBSS e aggiungere HBSS fresco, ripetendo il processo altre due volte.
  2. Rimuovere HBSS e incubare il tessuto con 1 mL di tripsina allo 0,05% a 37 °C per 5 minuti.
    NOTA: Solo la digestione della tripsina è sufficiente a questo punto.
  3. Dissociare meccanicamente il tessuto tubando delicatamente su e giù 15 volte.
    NOTA: La completa dissociazione del tessuto è osservata dall'aumento della torbidità della sospensione e dall'assenza di grandi frammenti di tessuto nella sospensione.
  4. Trasferire la soluzione in un tubo conico da 15 mL, neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo un volume uguale di FBS e filtrare la soluzione in un filtro filtrante cellulare di 0,4 μm per rimuovere i frammenti non dissociati.
  5. Lavare il filtro con 1 mL di mezzo astrocitario, raccogliere la sospensione cellulare che è passata attraverso il filtro e centrifugarla per 5 minuti a 200 x g e 25 °C. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura degli astrociti.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio di coltura T25, portare il volume del mezzo a 3,5 ml e incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2.
  7. Assicurarsi che dopo 24 ore, le cellule siano aderenti. Quindi, sostituire il mezzo e cambiarlo ogni 3 giorni.
  8. Dopo 7 giorni, rimuovere microglia e oligodendrociti dalla coltura lavando le cellule con 2 ml di 1x PBS.
  9. Sostituire la soluzione PBS con il terreno di coltura degli astrociti e lasciare il pallone di coltura in uno shaker orbitale a 180 giri/min durante la notte.
    NOTA: Gli astrociti formano un monostrato confluente in circa 10-12 giorni di coltura.

3. Sintesi della gelatina metacriloil (GelMA)

  1. Pesare 10 g di gelatina ottenuta dalla pelle suina e sciogliere in 100 ml di PBS lasciando che la soluzione si mescolmi su una piastra riscaldante a 240 giri/min e 50 °C fino alla completa dissoluzione.
  2. Sotto un cappuccio, aggiungere 2 ml di anidride metacrilica (MA) per un basso grado di funzionalizzazione e lasciare che l'emulsione di gelatina si mescoli a 240 giri / min e 50 ° C per 2 ore.
    ATTENZIONE: MA indicazione di pericolo: H302 + H332 (nocivo se ingerito o inalato), H311 (tossico a contatto con la pelle), 314 (provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi), 315 (provoca irritazione cutanea), H317 (può causare una reazione allergica cutanea), H318 (provoca gravi danni agli occhi), 331 (tossico se inalato), H332 (dannoso se inalato), H335 (può causare irritazione respiratoria). Linee guida per la manipolazione: P261 (evitare di respirare polvere / fumi / gas / nebbia / vapori / spray), P305 + P351 + P338 + P310 (SE NEGLI OCCHI: Risciacquare con cautela con acqua per diversi minuti. Rimuovere le lenti a contatto, se presenti e facili da fare. Continuare il risciacquo. Chiamare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI / medico), P301 + P312 + P330 (SE INGERITO: Chiamare un CENTRO ANTIVELENI / medico se non si sente bene. Risciacquare la bocca).
    NOTA: Aggiungi MA molto lentamente, goccia a goccia.
  3. Diluire la soluzione di gelatina-MA in 100 mL di PBS preriscaldato (50 °C) per ottenere 200 mL di volume finale e lasciare che la soluzione si agiti a 240 giri/min e 50 °C per 10 minuti.
  4. Tagliare ~ 20 cm di membrana di dialisi (cutoff molecolare 12-14 kDa) e immergerlo in acqua deionizzata fino a quando non è morbido.
    NOTA: Riempire le membrane con acqua deionizzata per assicurarsi che non ci siano fori o difetti.
  5. Utilizzando un imbuto, trasferire la soluzione di gelatina-MA alle membrane.
    NOTA: Chiudere entrambi i lati lasciando spazio extra all'interno per consentire la miscela.
  6. Posizionare le membrane contenenti la soluzione di gelatina-MA in un contenitore con 2 L di acqua distillata per la dialisi, lasciandole mescolare a 40 °C per 5 giorni (500 giri/min).
    NOTA: Coprire il contenitore per evitare l'evaporazione dell'acqua.
  7. Cambiare l'acqua distillata due volte al giorno. Ogni volta, capovolgere le membrane per l'omogeneizzazione.
  8. Il quinto giorno, mescolare 200 ml di acqua ultrapura preriscaldata (40 °C) alla gelatina-MA dializzata e lasciare mescolare per 15 minuti a 40 °C.
  9. Trasferire la soluzione di gelatina-MA in tubi conici da 50 mL fino a 25 mL e lasciare che i tubi rimangano a -80 °C per 2 giorni.
    NOTA: Conservare i tubi orizzontalmente per facilitare la liofilizzazione.
  10. Liofilizzare le soluzioni congelate per 3-5 giorni e conservare il GelMA liofilizzato al riparo dall'umidità.

4. Preparazione Bioink

NOTA: Per ottenere 1 mL di bioink, si consiglia di fabbricare almeno 3 mL di soluzione di biomateriale, in quanto potrebbero esserci perdite durante la filtrazione.

  1. Preparazione della soluzione di fibrinogeno
    1. Preparare la soluzione salina (NaCl 0,9%) in acqua deionizzata e sciogliere 10 mg di fibrinogeno dal plasma bovino in 1 mL di soluzione salina per ottenere una concentrazione di 10 mg/mL.
      NOTA: poiché il fibrinogeno assorbe al vetro, non utilizzare palloni di vetro per preparare la soluzione di fibrinogeno.
    2. Lasciare la soluzione sotto agitazione a 37 °C fino alla completa dissoluzione del fibrinogeno.
      NOTA: Per la dissoluzione del fibrinogeno, utilizzare un sistema rotante posto all'interno di un forno a 37 °C. È adatta anche l'agitazione magnetica (180 giri/min) del fibrinogeno su una piastra calda a 37 °C. In questa condizione, 10 mg/mL fibrinogen richiede circa 40 minuti per dissolversi.
  2. Preparazione della soluzione di gelatina/GelMA
    1. Pesare 0,12 g di gelatina e aggiungerla a 1,9 ml di PBS preriscaldato (40 °C) per ottenere una concentrazione finale del 4% (p/v) di gelatina. Vortice per facilitare la dissoluzione.
    2. Mantenere l'emulsione a 40 °C fino alla completa dissoluzione.
    3. Pesare 0,06 g di GelMA liofilizzato e trasferirlo nella soluzione di gelatina per ottenere una concentrazione finale del 2% (p/v) di GelMA. Vortice per facilitare la dissoluzione.
    4. Conservare la soluzione a 40 °C fino alla completa dissoluzione.
  3. Preparazione di bioink gelatina/GelMA/fibrinogeno carico di astrociti
    1. Pipettare 0,9 mL della soluzione di fibrinogeno da 10 mg/mL e trasferire alla soluzione di gelatina/GelMA per ottenere una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno.
    2. Pesare 0,015 g di fotoiniziatore (PI) e trasferirlo nella soluzione di gelatina/GelMA/fibrinogeno per ottenere una concentrazione finale dello 0,5% (p/v) PI. Mescolare la soluzione capovolgendo il tubo su e giù e tenerlo a 40 °C al riparo dalla luce per evitare la degradazione del PI.
      NOTA: Immagazzinare il bioink a 4 °C per un massimo di 24 ore.
    3. Sotto il flusso laminare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm in un tubo conico sterile da 15 mL.
      NOTA: la soluzione di biomateriale deve essere a 37-40 °C per consentire la filtrazione.
    4. Trasferire 980 μL della soluzione di biomateriale in un tubo conico da 15 mL.
    5. Diluire laminina in soluzione salina per ottenere una soluzione stock di 100 μg/mL.
    6. Pipettare 20 μL di laminina e trasferire al tubo contenente il bioink per ottenere una concentrazione finale di 2 μg/mL di laminina.
    7. Mescolare delicatamente pipettando su e giù, evitando bolle. Se persistono bolle, centrifugare il tubo conico a 200 x g per 2 minuti. Mantenere il bioink a 37 °C fino a quando non viene miscelato con le cellule.
    8. Tripsinizzare gli astrociti primari con tripsina 0,05% per 5 minuti.
      NOTA: Utilizzare astrociti dai passaggi da 1 a 3.
    9. Neutralizzare l'attività della tripsina con FBS in un rapporto di 1:1 e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 ml. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
    10. Contare le cellule e trasferire 1 x 106 celle in un tubo conico diverso. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
    11. Rimuovere il surnatante lasciando un piccolo volume (~200 μL) per sospendere il pellet cellulare, picchiettando delicatamente il fondo del tubo conico.
    12. Trasferire 1 mL di gelatina/GelMA/soluzione di fibrinogeno nel tubo contenente le cellule e pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare, ottenendo una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.

5. Preparazione della soluzione reticolante

  1. Ricostituzione della trombina
    1. Preparare una soluzione stock di trombina 100 U/mL in acqua deionizzata sterile con albumina sierica bovina allo 0,1% (p/v) (BSA) in un tubo conico da 15 mL. Stock in microtubi a -20 °C.
      NOTA: poiché la trombina assorbe al vetro, non utilizzare palloni di vetro per preparare la soluzione stock o conservare le aliquote.
  2. Preparazione della soluzione di trombina-CaCl2
    1. Pipettare 100 μL di soluzione stock di trombina e trasferire in un tubo conico da 50 mL contenente 8,9 mL di acqua deionizzata sterile per ottenere una concentrazione finale di 1 U/mL di trombina.
    2. Preparare una soluzione di CaCl2 al 10% (p/v) in acqua deionizzata e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,2 μm.
    3. Trasferire 1,1 mL della soluzione di CaCl2 al 10% al tubo conico contenente trombina, al fine di ottenere un rapporto finale di 1:9 (CaCl2 a trombina).
      NOTA: preparare la soluzione di reticolante al volume da utilizzare nell'esperimento, evitando la memorizzazione.

6. Bioprinting astrocytes-laden bioink utilizzando un bioprinter basato sull'estrusione

  1. Progettazione del tessuto neurale
    1. Usando il codice G: costruisci una griglia di 6 x 6 mm (forma quadrata) con 1 mm di distanza tra ogni linea biostampata sull'asse X e Y e 6 strati sull'asse Z (0,2 mm tra ogni linea); impostare l'estrusione (E) a 0,01 mm, aumentando di 0,001 mm ad ogni nuovo strato dell'asse Z; e impostare la velocità di stampa (F) su 400 mm/min (Informazioni supplementari).
  2. Configurazione di Bioprinter
    1. Esporre la macchina alla luce UV per 15 minuti, quindi pulirla con etanolo al 70%.
    2. Accendere la bioprinter utilizzando l'interruttore di alimentazione. Collegare la macchina al computer tramite un cavo USB. Aprire il software di controllo per collegarlo alla bioprinter e caricare il design del file.
  3. Preparazione della siringa per bioprinting
    1. Trasferire il bioink di gelatina/GelMA/fibrinogeno carico di astrociti in una siringa di plastica da 5 ml utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
      NOTA: Trasferire lentamente per evitare la formazione di bolle.
    2. Collegare un ago smussato sterile da 22 G alla siringa.
      NOTA: Lasciare la siringa a 4 °C per 2 min.
    3. Collegare la siringa alla testina di stampa della biostampante e lavare manualmente il bioink per rimuovere le bolle rimanenti.
  4. Bioprinting
    NOTA: La bioprinting è stata eseguita al di fuori della cappa laminare.
    1. Posizionare un piatto di coltura da 35 mm sul tavolo della bioprinter e posizionare l'ago a 0,1 mm di distanza dalla superficie del piatto di coltura per consentire il movimento dell'ago.
      NOTA: utilizzare una parabola di coltura da 35 mm per ogni bioprinting.
    2. Premere il pulsante Stampa.
    3. Una volta terminata la bioprinting, assicurarsi che la siringa si allontani dal piatto. Quindi, chiudi il piatto di cultura e preparati per il processo di reticolazione.
      NOTA: La bioprinting di un costrutto richiede circa 1 min e 10 s.
  5. Reticolazione del costrutto e della cultura bioprinted
    1. Posizionare la parabola di coltura sotto luce UV a 2 mW/cm2 per 2 x 60 s (su e giù) per la reticolazione GelMA.
    2. Sotto il flusso laminare, trasferire il costrutto biostampato su una piastra a 24 pozzetti usando una spatola sterile.
    3. Aggiungere 500 μL di trombina/soluzione di CaCl2 e lasciare per 30 minuti per consentire la reticolazione della fibrina.
    4. Rimuovere la soluzione reticolante e lavare il costrutto con 2 ml di PBS 1x. Quindi, sostituire il PBS con 1 mL di terreno di coltura degli astrociti e incubare a 37 °C e 5% CO2. Cambia il mezzo ogni 3 giorni.

7. Valutazione della vitalità degli astrociti

  1. Vitalità degli astrociti bioprinted
    1. Trasferire il costrutto biostampato in un piatto di coltura di 35 mm utilizzando una spatola.
    2. Lavare il costrutto con 1 mL di 1x PBS.
    3. Depositare 100 μL del reagente Live/Dead sul costrutto e tenerlo a 37 °C per 30 minuti, mantenendolo al riparo dalla luce.
    4. Rimuovere il reagente Live/Dead e lavare il costrutto con 1 mL di 1x PBS.
    5. Trasferire il campione su un piatto confocale usando una spatola e osservare le cellule all'interno del costrutto al microscopio confocale utilizzando l'eccitazione a 488 e 570 nm per l'acquisizione delle immagini.
      NOTA: utilizzare un ingrandimento di 10 volte per una visualizzazione complessiva delle celle all'interno del costrutto.
    6. Assicurati che il campione sia piatto. Se necessario, posizionare una coverslip sul campione per aumentare la planarità.
      NOTA: durante l'imaging, assicurarsi che la parabola confocale sia ben sigillata per evitare che il campione si secchi.
    7. Calcola il numero di vitali (verde) e morti (rosso) utilizzando un software computazionale.
  2. Vitalità della coltura di astrociti 2D
    1. Seminare 0,5 x 106 astrociti (passaggio 1-3) in un piatto confocale da 35 mm, aggiungere astrociti in mezzo e incubarli a 37 °C e 5% CO2.
    2. Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il terreno di coltura e lavare con 1 mL di 1x PBS.
    3. Depositare 200 μL del reagente Vivo/Morto e mantenere il piatto a 37 °C per 30 minuti, al riparo dalla luce.
    4. Rimuovere il reagente Vivo/Morto e lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS.
    5. Porta il piatto su un microscopio confocale accoppiato con una fotocamera digitale e usa l'eccitazione a 488 e 570 nm per l'acquisizione delle immagini.
    6. Calcola il numero di vitali (verde) e morti (rosso) utilizzando un software computazionale.

8. Immunostaining degli astrociti

  1. Colorazione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) degli astrociti bioprinted 3D
    NOTA: Per studiare la presenza di altri marcatori cellulari, modificare l'anticorpo primario di conseguenza.
    1. Rimuovere il mezzo dal pozzo e lavare il costrutto con 1 mL di PBS 3x.
    2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS al pozzo fino a quando il costrutto è completamente coperto e lasciarlo per 2 ore a 4 °C.
    3. Rimuovere il PFA e lavare il costrutto con 1 mL di 3x PBS.
      NOTA: questa procedura può essere sospesa per diversi mesi se conservata a 4 °C in PBS. Assicurarsi che la piastra del pozzo sia sigillata per evitare l'evaporazione PBS.
    4. Trattare il campione con glicina 0,1 mol/L per 5 min.
    5. Lavare con 1 mL di 1x PBS per 5 min.
    6. Permeabilizzare il campione con PBS contenente 0,1% Triton X-100 e 10% FBS per 1 ora a 25 °C sotto agitazione orbitale.
    7. Incubare il costrutto con pollo anti-GFAP (diluizione anticorpale primaria 1:500) a 4 °C durante la notte.
    8. Aspirare l'anticorpo primario e lavare il campione con 1 mL di PBS per 5 minuti, 3 volte.
      NOTA: l'anticorpo primario può essere riutilizzato per più volte se conservato a 4 °C.
    9. Incubare il campione con Alexa fluor 488-coniugato anti-pollo (diluizione anticorpale secondaria 1:500) e 1 μg/mL DAPI per 1 ora a 25 °C sotto agitazione orbitale.
      NOTA: tenere il campione al riparo dalla luce.
    10. Lavare il campione con 1 mL di PBS per 5 minuti, 3 volte.
    11. Trasferire il costrutto su una parabola confocale da 35 mm.
      NOTA: Assicurarsi che il piatto sia ben sigillato per evitare che il campione si secchi.
  2. Colorazione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) della coltura di astrociti 2D
    1. Seminare 0,5 x 106 astrociti (passaggio 1-3) in un piatto confocale da 35 mm, aggiungere astrociti in mezzo e incubarli a 37 °C e 5% CO2.
    2. Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il terreno di coltura e lavarle con 1 mL di 1x PBS.
    3. Ripetere i passaggi 8.1.2-8.1.10.
  3. Colorazione del citoscheletro degli astrociti
    1. Ripetere i passaggi 8.1.1-8.1.6.
    2. Aggiungere 200 μL di 50 μg/mL di soluzione di falloidina coniugata fluorescente in PBS e 1 μg/mL di DAPI sopra il costrutto.
    3. Incubare per 1 ora a 25 °C sotto agitazione orbitale, mantenendo il campione al riparo dalla luce.
    4. Lavare il campione con 1 mL di PBS per 5 min 3 volte e trasferire il costrutto in un piatto confocale usando una spatola.
      NOTA: Assicurarsi che il piatto sia ben sigillato per evitare che il campione si secchi.

9. Imaging confocale

  1. Porta i piatti a un microscopio confocale accoppiato con una fotocamera digitale per l'imaging (eccitazione a 359, 488 e 570 nm).
  2. Utilizzare l'ingrandimento di 10x per una visualizzazione complessiva e 40 o 63x per le immagini ingrandite delle celle.
    NOTA: assicurarsi che il campione sia piatto. Se necessario, posizionare una coverslip sul campione per aumentare la planarità.

Risultati

Questo lavoro mirava a sviluppare un tessuto simile a quello neurale utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D per depositare strato per strato la gelatina primaria carica di astrociti / GelMA / fibrinogen bioink. Gli astrociti sono stati estratti e isolati dalla corteccia cerebrale dei cuccioli di topo (Figura 1), aggiunti a una composizione di biomateriale, consentendo la biofabbricazione di un costrutto 3D vivente.

Il computer-aided-design (CAD) è stato svil...

Discussione

La tecnologia di bioprinting 3D è emersa come alternativa alla biofabbricazione che consente l'ingegnerizzazione di costrutti raffinati che strutturalmente e fisiologicamente assomigliano ai tessuti nativi22, incluso il cervello23. La biofabbricazione di tessuti simili a quelli neurali consente la modellazione in vitro del microambiente nativo, essendo uno strumento importante per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari associati allo sviluppo e al trattam...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la ricerca di San Paolo (FAPESP), numeri di sovvenzione 2018/23039-3 e 2018/12605-8; Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq), numeri di sovvenzione 465656/2014-5 e 309679/2018-4; e Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES), codice finanziario 001.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

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