JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы сообщаем о методе 3D-биопечати мышиных кортикальных астроцитов для биофабрикации нервно-подобных тканей для изучения функциональности астроцитов в центральной нервной системе и механизмов с участием глиальных клеток при неврологических заболеваниях и методах лечения.

Аннотация

Астроциты представляют собой глиальные клетки с существенной ролью в центральной нервной системе (ЦНС), включая поддержку и функциональность нейронов. Эти клетки также реагируют на нервные травмы и защищают ткани от дегенеративных событий. Исследования функциональности астроцитов in vitro важны для выяснения механизмов, участвующих в таких событиях, и способствуют разработке методов лечения неврологических расстройств. Этот протокол описывает метод биофабрикатного моделирования невроходной структуры ткани, богатой астроцитами, с помощью 3D-биопечати биоинков, нагруженных астроцитами. В этой работе был использован 3D-биопринтер на основе экструзии, а астроциты были извлечены из коры головного мозга детенышей мышей C57Bl/6. Биомочинку готовили путем смешивания кортикальных астроцитов от пассажа до пассажа 3 с раствором биоматериала, состоящим из желатина, желатино-метанрилоила (GelMA) и фибриногена, дополненного ламинином, который представлял оптимальные условия биопечати. Условия 3D-биопечати минимизировали клеточный стресс, способствуя высокой жизнеспособности астроцитов во время процесса, в котором 74,08% ± 1,33% клеток были жизнеспособными сразу после биопечати. После 1 недели инкубации жизнеспособность астроцитов значительно возросла до 83,54% ± 3,00%, что указывает на то, что 3D-конструкция представляет собой подходящую микросреду для роста клеток. Состав биоматериала позволял прикреплять клетки и стимулировал астроцитарное поведение, при этом клетки экспрессировали специфический маркер астроцитов глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и обладали типичной астроцитарной морфологией. Этот воспроизводимый протокол обеспечивает ценный метод биофабрикатного 3D-невроходобной ткани, богатой астроцитами, которая напоминает нативную микросреду клеток, полезный для исследователей, которые стремятся понять функциональность астроцитов и их связь с механизмами, участвующими в неврологических заболеваниях.

Введение

Астроциты являются наиболее распространенным типом клеток в центральной нервной системе (ЦНС) и играют ключевую роль в гомеостазе мозга. В дополнение к устойчивой поддержке нейронов, астроциты отвечают за модуляцию поглощения нейротрансмиттеров, поддержание целостности гематоэнцефалического барьера и регулирование нейронального синаптогенеза1,2. Астроциты также играют существенную роль в воспалении ЦНС, реагируя на травмы головного мозга в процессе, который приводит к астрограционной реактивности или реактивному астроглиозу3,4,образуя глиальный рубец, который препятствует поражению здоровой ткани дегенеративными агентами5. Это событие приводит к изменениям в экспрессии генов астроцитов, морфологии и функции6,7. Поэтому исследования, связанные с функциональностью астроцитов, полезны для разработки методов лечения неврологических расстройств.

Модели in vitro имеют решающее значение для изучения механизмов, связанных с неврологическими травмами, и хотя была установлена успешная изоляция и двумерная (2D) культура корковых астроцитов8,эта модель не может обеспечить реалистичную среду, которая имитирует поведение нативных клеток и воспроизводит сложность мозга9 . В 2D-состоянии плохая механическая и биохимическая поддержка, низкоклеточные и клеточно-матричные взаимодействия и сплющивание клеток, приводящее к отсутствию базально-апикальной полярности, влияют на динамику клеточной сигнализации и экспериментальные результаты, приводящие к изменению морфологии клеток и экспрессии генов, которые ставят под угрозу реакцию на лечение10. Поэтому крайне важно разработать альтернативы, которые обеспечивают более реалистичную нейронную среду, направленную на перевод результатов в клинику.

Трехмерная (3D) клеточная культура представляет собой более продвинутую модель, которая рекапитулирует с повышенной точностью особенности органов и тканей, включая ЦНС11. Что касается глиальной культуры, 3D-модели способствуют поддержанию морфологии астроцитов, базально-апикальной полярности клеток и клеточной сигнализации12,13. Технология 3D-биопечати стала мощным инструментом для контролируемого биофабрикатирования живых тканей 3D с использованием клеток и биоматериалов для воссоздания структуры и свойств нативных тканей. Использование этой технологии привело к существенному улучшению прогнозирования результатов и способствовало регенеративной медицине, применяемой в ЦНС14,15,16.

Протокол, описанный здесь, детализирует выделение и культуру корковых астроцитов. В протоколе также подробно описывается воспроизводимый метод биопечати астроцитов, встроенных в желатин / желатин метанрилоил (GelMA) / фибриноген, дополненный ламинином. В этой работе биопринтер на основе экструзии использовался для печати композиции биоматериала, содержащей корковые астроциты при плотности 1 х 106 клеток/мл. Напряжение сдвига биопечати было сведено к минимуму за счет контроля скорости печати, а астроциты показали высокую жизнеспособность после процесса. Биопечатные конструкции культивировали в течение 1 недели, и астроциты смогли распространяться, прикрепляться и выживать в гидрогеле, сохраняя астроцитарную морфологию и экспрессируя специфический маркер глиального фибриллярного кислого белка (GFAP)4.

Эта процедура совместима с биопринтерами на основе экструзии с поршневым приводом и может быть использована для биопечати астроцитов, полученных из разных источников. Предложенная здесь 3D-биопечатная модель подходит для широкого спектра применений нейронной инженерии, таких как исследования механизмов, участвующих в функциональности астроцитов в здоровых тканях и понимание прогрессирования неврологических патологий и развития лечения.

протокол

Все процедуры с участием животных соответствовали международным руководящим принципам использования животных в исследованиях (http://www.iclas.org) и были одобрены Комитетом по этике в исследованиях Федерального университета Сан-Паулу (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Рассечение мозга мышей

  1. Переложите 10 мл холодного буферного солевого раствора Хэнкса (HBSS) в 100 мм культурную чашку и 1 мл в микротрубку 1,5 мл. Подготовьте по одной микротрубки на каждое животное.
    ПРИМЕЧАНИЕ: И культуральное блюдо, и микропробирку нужно держать на льду.
  2. Готовят культуральную среду астроцитов с использованием DMEM F12 + 10% фетальной бычий сыворотки (FBS), 2% глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (P/S). Стерилизуйте среду путем фильтрации с помощью фильтра 0,2 мкм.
  3. Усыпление детенышей мышей C57Bl/6 (послеродовой день 1) путем обезглавливания с помощью острых операционных ножниц. Используя щипцы, потяните кожу и обнажите череп. Убедитесь, что ножницы и щипцы стерилизованы 70% этанолом.
  4. Вырежьте череп от большого ямона до макушки головы вдоль сагиттальной плоскости с помощью острых изогнутых наконечников ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что энцефальная ткань не повреждена.
  5. С помощью шпателя, предварительно стерилизованного этанолом 70%, поднимают мозг из полости черепа и помещают его в культуральную посуду, содержащую 10 мл холодного HBSS.
  6. Поместите культурную чашку, содержащую мозг, под стереомикроскоп и, используя два щипца с тупыми кончиками, удалите мозговые огня из мозга(рисунок 1).
  7. Отделите кору от остальной части мозга, осторожно откатывая ее от срединной линии мозга с помощью шпателя.
  8. Соберите обе коры и немедленно перенесите их в одну и ту же микропробирку, содержащую 1 мл холодного HBSS.

2. Выделение и культивировка астроцитов

  1. Под ламинарным потоком разрежьте кортикальные ткани на мелкие кусочки с помощью изогнутых микронарезами и промыте их 1 мл HBSS путем пипетки вверх и вниз 3x. Подождите, пока ткань осядет. Удалите HBSS и добавьте свежий HBSS, повторив процесс еще два раза.
  2. Удалить HBSS и инкубировать ткань с 1 мл 0,05% трипсина при 37 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент достаточно только переваривания трипсина.
  3. Механически диссоциировать ткань, осторожно пипетируя вверх и вниз 15x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная диссоциация ткани наблюдается за счет увеличения мутности суспензии и отсутствия крупных фрагментов ткани в суспензии.
  4. Переложите раствор в коническую трубку объемом 15 мл, нейтрализуйте активность трипсина, добавив равный объем FBS, и отфильтруйте раствор в фильтре клеточного сетчатого фильтра 0,4 мкм для удаления недиссоциированных фрагментов.
  5. Промыть фильтр 1 мл астроцитарной среды, собрать клеточную суспензию, прошедшую через ситечко, и центрифугировать ее в течение 5 мин при 200 х г и 25 °С. После центрифугирования отбросьте супернатант и суспендируют гранулу в 1 мл культурального среды астроцитов.
  6. Переложите клеточную суспензию в колбу для культуры T25, дополним объем среды до 3,5 мл и инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2.
  7. Убедитесь, что через 24 ч клетки прилипают. Затем замените среду и меняйте ее каждые 3 дня.
  8. Через 7 дней удаляют микроглию и олигодендроциты из культуры, промыв клетки 2 мл 1x PBS.
  9. Замените раствор PBS питательной средой астроцитов и оставьте колбу для культивовки в орбитальном шейкере при 180 об/мин на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Астроциты образуют слежущего монослоя примерно через 10-12 дней культивации.

3. Синтез желатина метакрилоила (GelMA)

  1. Взвесьте 10 г желатина, полученного из свиной кожицы, и растворите в 100 мл PBS, давая раствору перемешиваться на нагревательной пластине при 240 об/мин и 50 °C до полного растворения.
  2. Под капотом добавьте 2 мл метанакрилового ангидрида (МА) для низкой степени функционализации и дайте желатиновой эмульсии перемешаться при 240 об/мин и 50 °C в течение 2 ч.
    ВНИМАНИЕ: Заявление об опасности МА: H302 + H332 (вредно при проглатывании или вдыхании), H311 (токсично при контакте с кожей), 314 (вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз), 315 (вызывает раздражение кожи), H317 (может вызвать аллергическую кожную реакцию), H318 (вызывает серьезное повреждение глаз), 331 (токсично при вдыхании), H332 (вредно при вдыхании), H335 (может вызвать раздражение дыхательных путей). Рекомендации по обращению: P261 (избегайте вдыхать пыль / дым / газ / туман / пары / распыление), P305 + P351 + P338 + P310 (ЕСЛИ В ГЛАЗАХ: Осторожно смойте водой в течение нескольких минут. Снимите контактные линзы, если они есть и легко сделать. Продолжайте полоскание. Немедленно позвоните в ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР / врача), P301 + P312 + P330 (ЕСЛИ ПРОГЛОТИЛИ: Позвоните в ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР / врача, если вы чувствуете недомогание. Прополоскивайте рот).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте MA очень медленно, капля за каплей.
  3. Разбавляют раствор желатина-МА в 100 мл предварительно нагретого PBS (50 °C) до получения 200 мл конечного объема и дают раствору перемешиваться при 240 об/мин и 50 °C в течение 10 мин.
  4. Отрежьте ~20 см мембраны диализа (молекулярная отсечку 12-14 кДа) и замочите ее в деионизированной воде до мягкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните мембраны деионизированной водой, чтобы убедиться в отсутствии отверстий или дефектов.
  5. С помощью воронки перенесите раствор желатина-МА на мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте обе стороны, оставив дополнительное пространство внутри, чтобы можно было смешивать.
  6. Поместите мембраны, содержащие раствор желатина-МА, в емкость с 2 л дистиллированной воды для диализа, давая им перемешиваться при 40 °C в течение 5 дней (500 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте контейнер, чтобы избежать испарения воды.
  7. Меняйте дистиллированную воду два раза в день. Каждый раз переворачивайте мембраны вверх дном для гомогенизации.
  8. На пятый день смешайте 200 мл предварительно нагретой сверхчистой воды (40 °C) с диализированным желатином-МА и дайте ему перемешаться в течение 15 минут при 40 °C.
  9. Переложите раствор желатина-МА на конические пробирки по 50 мл до 25 мл и оставить пробирки при -80 °C в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните пробирки горизонтально для облегчения лиофилизации.
  10. Лиофилизируйте замороженные растворы в течение 3-5 дней и храните лиофилизированный GelMA, защищенный от влаги.

4. Подготовка биомохнил

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 1 мл биомотка рекомендуется изготовить не менее 3 мл раствора биоматериала, так как при фильтрации могут возникнуть потери.

  1. Приготовление раствора фибриногена
    1. Готовят физиологический раствор (NaCl 0,9%) в деионизированной воде, а 10 мг фибриногена из бычьей плазмы раствора раствора в 1 мл физиологического раствора получают концентрацию 10 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку фибриноген адсорбирует стекло, не используйте стеклянные колбы для приготовления раствора фибриногена.
    2. Оставить раствор под перемешиванием при 37 °С до полного растворения фибриногена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворения фибриногена используйте ротационную систему, размещенную внутри печи при 37 °C. Также подходит магнитное перемешивание (180 об/мин) фибриногена на конфорочной плите при 37 °C. При этом условии 10 мг/мл фибриногена растворяется примерно 40 мин.
  2. Приготовление раствора желатина/гелма
    1. Взвесьте 0,12 г желатина и добавьте его к 1,9 мл предварительно нагретого PBS (40 °C) для получения конечной концентрации 4% (мас./об.) желатина. Вихрь для облегчения растворения.
    2. Держите эмульсию при 40 °C до полного растворения.
    3. Взвесили 0,06 г лиофилизированного GelMA и переложили в желатиновый раствор для получения конечной концентрации 2% (мас./об.) GelMA. Вихрь для облегчения растворения.
    4. Держите раствор при 40 °C до полного растворения.
  3. Получение астроцитарных желатиновых/гелма/фибриногенных биоинков
    1. Пипетку 0,9 мл раствора фибриногена 10 мг/мл и перенос в раствор желатина/гелма с получением конечной концентрации 3 мг/мл фибриногена.
    2. Взвесьте 0,015 г фотоинициатора (PI) и переложите в раствор желатина/гелма/фибриногена для получения конечной концентрации 0,5% (мас./об.) PI. Перемешайте раствор, перевернув трубку вверх и вниз, и держите ее при 40 °C защищенной от света, чтобы избежать деградации PI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасивать биомосин при 4 °C в течение максимум 24 ч.
    3. Под ламинарной струей фильтруют раствор с помощью фильтра 0,2 мкм в стерильную коническую трубку 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор биоматериала должен находиться при 37-40 °C для обеспечения фильтрации.
    4. Перенесите 980 мкл раствора биоматериала в коническую трубку 15 мл.
    5. Развести ламинин в физиологическом растворе для получения запасного раствора 100 мкг/мл.
    6. Пипетку 20 мкл ламинина и переложить в пробирку, содержащую биочернило, получить конечную концентрацию 2 мкг/мл ламинина.
    7. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, избегая пузырьков. Если пузырьки сохраняются, центрифугируют коническую трубку при 200 х г в течение 2 мин. Держите биотрин при 37 °C до тех пор, пока он не смешается с клетками.
    8. Трипсинизируют первичные астроциты 0,05% трипсином в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте астроциты из проходов от 1 до 3.
    9. Нейтрализуют активность трипсина с помощью FBS в соотношении 1:1 и переносят клетки в коническую трубку 15 мл. Центрифугировать его при 200 х г в течение 5 мин.
    10. Подсчитайте ячейки и перенесите 1 х 106 клеток в другую коническую трубку. Центрифугировать его при 200 х г в течение 5 мин.
    11. Удалите супернатант, оставив небольшой объем (~ 200 мкл), чтобы приостановить гранулу клетки, осторожно постукивая по дну конической трубки.
    12. Переложите 1 мл раствора желатина/гелма/фибриногена в трубку, содержащую клетки, и осторожно пипетку вверх и вниз для гомогенизации, получив конечную концентрацию 1 х 106 клеток/мл.

5. Приготовление раствора сшивателя

  1. Восстановление тромбина
    1. Готовят стоковый раствор тромбина 100 Ед/мл в стерильной деионизированной воде с 0,1% (мас./об.) бычным сывороточным альбумином (БСА) в конической пробирке 15 мл. Запас в микротрубках при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тромбин адсорбирует стекло, не используйте стеклянные колбы для приготовления запасного раствора или хранения аликвот.
  2. Приготовление раствора тромбина-CaCl2
    1. Пипетку 100 мкл раствора тромбина и переложить в коническую трубку 50 мл, содержащую 8,9 мл стерильной деионизированной воды для получения конечной концентрации 1 Ед/мл тромбина.
    2. Приготовьте 10% (мас./об.) раствор CaCl2 в деионизированной воде и стерилизуйте с помощью фильтра 0,2 мкм.
    3. Переложите 1,1 мл 10% раствораCaCl2 в коническую трубку, содержащую тромбин, чтобы получить конечное соотношение 1:9 (CaCl2 к тромбину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор сшивателя на том объеме, который будет использоваться в эксперименте, избегая хранения.

6. Биопечать биочернила, нагруженного астроцитами, с использованием биопринтера на основе экструзии

  1. Дизайн нервной ткани
    1. Использование G-кода: построить сетку размером 6 х 6 мм (квадратная форма) с расстоянием 1 мм между каждой биопечатной линией по осям X и Y и 6 слоями по оси Z (0,2 мм между каждой линией); установить экструзию (E) на 0,01 мм, увеличивая 0,001 мм на каждом новом слое оси Z; и установите скорость печати (F) на 400 мм/мин(Дополнительная информация).
  2. Настройка биопринтера
    1. Подвергайте машину воздействию ультрафиолетового излучения в течение 15 минут, а затем протрите ее этанолом на 70%.
    2. Включите биопринтер с помощью выключателя питания. Подключите устройство к компьютеру с помощью кабеля USB. Откройте управляющую программу, чтобы подключить ее к биопринтеру и загрузить дизайн файла.
  3. Подготовка шприца для биопечати
    1. Перенесите насыщенный астроцитами желатин/гельМА/фибриноген биончи на пластиковый шприц объемом 5 мл с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переместите медленно, чтобы избежать образования пузырьков.
    2. Подключите к шприцев стерильной тупой игле 22 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте шприц при 4 °C в течение 2 мин.
    3. Подключите шприц к печатающей головке биопринтера и вручную промывайте биочернила, чтобы удалить оставшиеся пузырьки.
  4. Биопечать
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопечать выполнялась вне ламинарного капота.
    1. Поместите 35-миллиметровую культурную чашку на стол биопринтера и расположите иглу на 0,1 мм от поверхности чашки для культивовки, чтобы обеспечить движение иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну 35-миллиметровую культурную тарелку для каждой биопечати.
    2. Нажмите кнопку Печать.
    3. После того, как биопечать закончится, убедитесь, что шприц отходит от тарелки. Затем закройте блюдо для культуры и подготовьте к процессу сшивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биопечать одной конструкции занимает примерно 1 мин и 10 с.
  5. Сшивание биопечатной конструкции и культуры
    1. Поместите чашку для культивирования под ультрафиолетовый свет со скоростью 2мВт/см2 в течение 2 x 60 с (вверх и вниз) для сшивания GelMA.
    2. Под ламинарной струей перенесите биопечатную конструкцию на 24-скважинную пластину с помощью стерильного шпателя.
    3. Добавьте 500 мкл раствора тромбина/CaCl2 и оставьте на 30 мин, чтобы фибрин сшивал.
    4. Удалите раствор для сшивания и промыть конструкцию 2 мл PBS 1x. Затем заменить PBS 1 мл культурального носителя астроцитов и инкубировать при 37 °C и 5% CO2. Меняйте среду каждые 3 дня.

7. Оценка жизнеспособности астроцитов

  1. Жизнеспособность биопечатных астроцитов
    1. Перенесите биопечатную конструкцию на 35 мм культурную посуду с помощью шпателя.
    2. Вымойте конструкцию 1 мл 1x PBS.
    3. Нанесите 100 мкл реагента Live/Dead на конструкцию и держите его при 37 °C в течение 30 минут, сохраняя его защищенным от света.
    4. Удалите реагент Live/Dead и промыть конструкцию 1 мл 1x PBS.
    5. Перенесите образец на конфокальную тарелку с помощью шпателя и наблюдайте за клетками внутри конструкции под конфокальным микроскопом, используя возбуждение 488 и 570 нм для получения изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте увеличение в 10 раз для общей визуализации ячеек в конструкции.
    6. Убедитесь, что образец сидит ровно. При необходимости поместите крышку на образец, чтобы увеличить плоскостность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации убедитесь, что конфокальная тарелка хорошо запечатана, чтобы предотвратить высыхание образца.
    7. Рассчитайте количество жизнеспособных (зеленый) и мертвых (красный) с помощью вычислительного программного обеспечения.
  2. Жизнеспособность культуры 2D астроцитов
    1. Семена 0,5 х 106 астроцитов (пассаж 1-3) в конфокальной посуде 35 мм, добавляют астроцитарные среды и инкубируют их при 37 °C и 5% CO2.
    2. Когда клетки сливаются, удалите культурную среду и промыть 1 мл 1x PBS.
    3. Внесите 200 мкл реагента Live/Dead и держите блюдо при 37 °C в течение 30 минут, защищенных от света.
    4. Удалите живой/мертвый реагент и промыть клетки 1 мл 1x PBS.
    5. Отнесите блюдо к конфокальному микроскопу в сочетании с цифровой камерой и используйте возбуждение 488 и 570 нм для получения изображения.
    6. Рассчитайте количество жизнеспособных (зеленый) и мертвых (красный) с помощью вычислительного программного обеспечения.

8. Иммуноокрашивание астроцитов

  1. Окрашивание глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) 3D-биопечатных астроцитов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исследовать наличие других клеточных маркеров, измените первичное антитело соответствующим образом.
    1. Извлеките среду из колодца и промыть конструкцию 1 мл 3x PBS.
    2. Добавьте 4% параформальдегида (PFA) в PBS в скважину до тех пор, пока конструкция не будет полностью покрыта, и оставьте ее на 2 ч при 4 °C.
    3. Снимите PFA и вымойте конструкцию 1 мл 3x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть приостановлена на несколько месяцев, если хранится при 4 °C в PBS. Убедитесь, что пластина скважины герметизирована, чтобы избежать испарения PBS.
    4. Обработайте образец глицином 0,1 моль/л в течение 5 минут.
    5. Промыть 1 мл 1x PBS в течение 5 мин.
    6. Пермеабилизируют образец PBS, содержащим 0,1% тритона X-100 и 10% FBS в течение 1 ч при 25 °C при орбитальном перемешивании.
    7. Инкубировать конструкцию с куриным анти-GFAP (первичное разведение антител 1:500) при 4 °C в течение ночи.
    8. Аспирировать первичное антитело и промыть образец 1 мл PBS в течение 5 мин, 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела могут быть повторно повторно разылены при хранении при 4 °C.
    9. Инкубируют образец с Alexa fluor 488-конъюгированной антикиплодой (вторичное разведение антител 1:500) и 1 мкг/мл DAPI в течение 1 ч при 25 °C при орбитальном перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образец защищенным от света.
    10. Промыть образец 1 мл PBS в течение 5 мин, 3 раза.
    11. Перенесите конструкцию на 35-миллиметровую конфокальную тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что блюдо хорошо запечатано, чтобы образец не высох.
  2. Окрашивание глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) культуры 2D астроцитов
    1. Семена 0,5 х 106 астроцитов (пассаж 1-3) в конфокальной посуде 35 мм, добавляют астроцитарные среды и инкубируют их при 37 °C и 5% CO2.
    2. Когда клетки слятся, удалите культурную среду и промыть их 1 мл 1x PBS.
    3. Повторите шаги 8.1.2-8.1.10.
  3. Окрашивание цитоскелетов астроцитами
    1. Повторите шаги 8.1.1-8.1.6.
    2. Добавьте 200 мкл 50 мкг/мл флуоресцентно-конъюгированного раствора фаллоидина в PBS и 1 мкг/мл DAPI поверх конструкции.
    3. Инкубировать в течение 1 ч при 25 °C при орбитальном перемешивании, сохраняя образец защищенным от света.
    4. Промыть образец 1 мл PBS в течение 5 мин 3 раза, а конструкцию перенести на конфокальную посуду шпателем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что блюдо хорошо запечатано, чтобы образец не высох.

9. Конфокальная визуализация

  1. Возьмите посуду к конфокальному микроскопу в сочетании с цифровой камерой для визуализации (возбуждение 359, 488 и 570 нм).
  2. Используйте увеличение 10x для общей визуализации и 40 или 63x для увеличенных изображений ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец сидит ровно. При необходимости поместите крышку на образец, чтобы увеличить плоскостность.

Результаты

Эта работа была направлена на разработку невроподобной ткани с использованием технологии 3D-биопечати для нанесения послойного первичного астроцита, нагруженного желатином / GelMA / фибриногеном биоинке. Астроциты были извлечены и выделены из коры головного мозга детенышей мышей

Обсуждение

Технология 3D-биопечати появилась как альтернатива биофабрикации, которая позволяет создавать усовершенствованные конструкции, которые структурно и физиологически напоминают нативныеткани 22,включая мозг23. Биофабрикация нервно-подобных тканей позволяет ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP), номера грантов 2018/23039-3 и 2018/12605-8; Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq), номера грантов 465656/2014-5 и 309679/2018-4; и Координация по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES), финансовый код 001.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

Ссылки

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1733D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены