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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Astrozyten sind Gliazellen mit einer wesentlichen Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), einschließlich neuronaler Unterstützung und Funktionalität. Diese Zellen reagieren auch auf neuronale Verletzungen und schützen das Gewebe vor degenerativen Ereignissen. In-vitro-Studien zur Funktionalität von Astrozyten sind wichtig, um die Mechanismen solcher Ereignisse aufzuklären und zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen beizutragen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Biofabrikation einer neuralen Gewebestruktur, die reich an Astrozyten ist, durch 3D-Bioprinting von Astrozyten-beladener Bioink. Ein extrusionsbasierter 3D-Bioprinter wurde in dieser Arbeit verwendet, und Astrozyten wurden aus den Gehirnkortexen von C57Bl/6 Mäusenwelpen extrahiert. Die Bioink wurde hergestellt, indem kortikale Astrozyten von bis Zurgang 3 zu einer Biomateriallösung aus Gelatine, Gelatine-Methacryloyl (GelMA) und Fibrinogen gemischt wurden, ergänzt mit Laminin, das optimale Bioprinting-Bedingungen aufwies. Die 3D-Bioprinting-Bedingungen minimierten den Zellstress und trugen zur hohen Lebensfähigkeit der Astrozyten während des Prozesses bei, bei dem 74,08% ± 1,33% der Zellen direkt nach dem Bioprinting lebensfähig waren. Nach 1 Woche Inkubation stieg die Lebensfähigkeit der Astrozyten signifikant auf 83,54% ± 3,00%, was darauf hindeutet, dass das 3D-Konstrukt eine geeignete Mikroumgebung für das Zellwachstum darstellt. Die Zusammensetzung des Biomaterials ermöglichte die Zellanheftung und stimulierte das astrozytäre Verhalten, wobei zellen den spezifischen Astrozytenmarker glial fibrillary acidic protein (GFAP) exprimierten und eine typische astrozytäre Morphologie besaßen. Dieses reproduzierbare Protokoll bietet eine wertvolle Methode zur Bioschmierung von 3D-neuralem Gewebe, das reich an Astrozyten ist und der nativen Mikroumgebung der Zellen ähnelt, nützlich für Forscher, die die Funktionalität von Astrozyten und ihre Beziehung zu den Mechanismen neurologischer Erkrankungen verstehen wollen.

Einleitung

Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und spielen eine Schlüsselrolle bei der Homöostase des Gehirns. Neben der dauerhaften neuronalen Unterstützung sind Astrozyten für die Modulation der Aufnahme von Neurotransmittern, die Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und die Regulierung der neuronalen Synaptogenese verantwortlich1,2. Astrozyten spielen auch eine wesentliche Rolle bei ZNS-Entzündungen und reagieren auf Verletzungen des Gehirns in einem Prozess, der zu einer Astrocitary-Reaktivität oder reaktiven Astrogliose führt3,4 und bildet eine Glianarbe, die eine gesunde Gewebeexposition gegenüber degenerativen Agenzien verhindert5. Dieses Ereignis führt zu Veränderungen in der Genexpression, Morphologie und Funktion von Astrozyten6,7. Daher sind Studien zur Funktionalität von Astrozyten hilfreich für die Entwicklung von Therapien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen.

In-vitro-Modelle sind entscheidend für die Untersuchung von Mechanismen im Zusammenhang mit neurologischen Verletzungen, und obwohl eine erfolgreiche Isolierung und zweidimensionale (2D) Kultur von kortikalen Astrozyten etabliert wurde8, bietet dieses Modell keine realistische Umgebung, die das native Zellverhalten nachahmt und die Komplexität des Gehirns reproduziert9 . Im 2D-Zustand beeinflussen die schlechte mechanische und biochemische Unterstützung, die geringen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und die Zellabflachung, die zum Fehlen einer basal-apikalen Polarität führt, die Zellsignaldynamik und die experimentellen Ergebnisse, was zu einer veränderten Zellmorphologie und Genexpression führt, was die Reaktion auf Behandlungen beeinträchtigt10. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Alternativen zu entwickeln, die eine realistischere neuronale Umgebung bieten, um die Ergebnisse in die Klinik zu übertragen.

Die dreidimensionale (3D) Zellkultur stellt ein fortschrittlicheres Modell dar, das mit erhöhter Genauigkeit merkmale von Organen und Geweben, einschließlich des ZNS11,rekapituliert. In Bezug auf die Gliakultur tragen 3D-Modelle zur Aufrechterhaltung der Morphologie der Astrozyten, der basal-apikalen Polarität der Zellen und der Zellsignalisierung bei12,13. Die 3D-Bioprinting-Technologie entwickelte sich zu einem leistungsstarken Werkzeug, um lebendes 3D-Gewebe kontrolliert zu biofabrizieren, indem Zellen und Biomaterialien verwendet werden, um die Struktur und Eigenschaften von nativem Gewebe nachzubilden. Der Einsatz dieser Technologie hat zu einer erheblichen Verbesserung der Ergebnisvorhersage geführt und zur regenerativen Medizin beigetragen, die auf die ZNS14,15,16angewendet wird .

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur kortikaler Astrozyten. Das Protokoll beschreibt auch eine reproduzierbare Methode zum Bioprint von Astrozyten, die in Gelatine / Gelatine Methacryloyl (GelMA) / Fibrinogen eingebettet sind, ergänzt mit Laminin. In dieser Arbeit wurde ein extrusionsbasierter Bioprinter verwendet, um die Biomaterialzusammensetzung zu drucken, die kortikale Astrozyten mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen / ml enthält. Die Bioprinting-Scherspannung wurde durch die Kontrolle der Druckgeschwindigkeit minimiert, und Astrozyten zeigten nach dem Prozess eine hohe Lebensfähigkeit. Biogedruckte Konstrukte wurden 1 Woche lang kultiviert, und Astrozyten konnten sich innerhalb des Hydrogels ausbreiten, anheften und überleben, wobei die astrozytäre Morphologie beibehalten und ein spezifisches Marker-Glialfibrillär-saures Protein (GFAP) exprimiert wurde4.

Dieses Verfahren ist kompatibel mit kolbengetriebenen extrusionsbasierten Bioprintern und kann zum Biodrucken von Astrozyten aus verschiedenen Quellen verwendet werden. Das hier vorgeschlagene 3D-Bioprinted-Modell eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Neurotechnik, wie z.B. Studien der Mechanismen, die an der Funktionalität von Astrozyten in gesundem Gewebe beteiligt sind, und das Verständnis des Fortschreitens neurologischer Pathologien und der Behandlungsentwicklung.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren folgten den internationalen Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (http://www.iclas.org) und wurden vom Komitee für Ethik in der Forschung der Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519) genehmigt.

1. Gehirndissektion von Mäusen

  1. 10 ml kalte Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) in eine 100 mm Kulturschale und 1 ml in eine 1,5 ml Mikroröhre geben. Bereiten Sie eine Mikroröhrchen pro Tier vor.
    HINWEIS: Sowohl die Kulturschale als auch die Mikroröhre müssen auf Eis aufbewahrt werden.
  2. Bereiten Sie Astrozytenkulturmedium mit DMEM F12 + 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) vor. Sterilisieren Sie das Medium durch Filtern mit einem 0,2 μm-Filter.
  3. C57Bl/6 Mäusewelpen (postnataler Tag 1) durch Enthauptung mit einer scharfen Operationsschere einschläfern. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Haut und legen Sie den Schädel frei. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Schere als auch die Pinzette mit 70% Ethanol sterilisiert sind.
  4. Schneiden Sie den Schädel vom Foramen magnum bis zur Oberseite des Kopfes entlang der Sagittalebene mit einer scharf gekrümmten Spitzenschere ab.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das enzephale Gewebe nicht beschädigt ist.
  5. Mit einem Spatel, der zuvor mit Ethanol 70% sterilisiert wurde, heben Sie das Gehirn aus der Schädelhöhle und legen Sie es in die Kulturschale mit 10 ml kaltem HBSS.
  6. Legen Sie die Kulturschale, die das Gehirn enthält, unter das Stereomikroskop und entfernen Sie mit zwei stumpfen Pinzetten die Hirnhäute aus dem Gehirn (Abbildung 1).
  7. Trennen Sie die Cortices vom Rest des Gehirns, indem Sie sie mit einem Spatel sanft von der Mittellinie des Gehirns wegrollen.
  8. Sammeln Sie beide Cortices und übertragen Sie sie sofort in dasselbe Mikroröhrchen, das 1 ml kaltes HBSS enthält.

2. Isolierung und Kultur von Astrozyten

  1. Schneiden Sie unter der laminaren Strömung das kortikale Gewebe mit einer gekrümmten Mikroschere in kleine Stücke und waschen Sie sie mit 1 ml HBSS, indem Sie 3x nach oben und unten pipettieren. Warten Sie, bis sich das Gewebe beruhigt hat. Entfernen Sie HBSS, fügen Sie ein neues HBSS hinzu, und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male.
  2. Entfernen Sie HBSS und inkubieren Sie das Gewebe mit 1 ml 0,05% Trypsin bei 37 °C für 5 min.
    HINWEIS: Nur die Trypsin-Verdauung ist an dieser Stelle ausreichend.
  3. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, indem Sie 15x vorsichtig auf und ab pipettieren.
    ANMERKUNG: Die vollständige Dissoziation des Gewebes wird durch die Zunahme der Suspensionstrübung und durch das Fehlen großer Gewebefragmente in der Suspension beobachtet.
  4. Übertragen Sie die Lösung auf ein konisches 15-ml-Röhrchen, neutralisieren Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe eines gleichen Volumens VON FBS und filtern Sie die Lösung in einem Zellsiebfilter von 0,4 μm, um nicht dissoziierte Fragmente zu entfernen.
  5. Waschen Sie den Filter mit 1 ml Astrozytenmedium, sammeln Sie die Zellsuspension, die durch das Sieb gegangen ist, und zentrifugieren Sie sie für 5 min bei 200 x g und 25 ° C. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Astrozytenkulturmedium suspendieren.
  6. Die Zellsuspension in einen T25-Kulturkolben überführen, das Volumen des Mediums auf 3,5 ml auffüllen und die Zellen bei 37 °C und 5 %CO2inkubieren.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nach 24 h adhärent sind. Ersetzen Sie dann das Medium und wechseln Sie es alle 3 Tage.
  8. Entfernen Sie nach 7 Tagen Mikroglia und Oligodendrozyten aus der Kultur, indem Sie die Zellen mit 2 ml 1x PBS waschen.
  9. Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch das Astrozytenkulturmedium und lassen Sie den Kulturkolben über Nacht in einem Orbitalschüttler mit 180 U / min.
    HINWEIS: Astrozyten bilden in etwa 10-12 Tagen Kultur eine konfluente Monoschicht.

3. Synthese von Gelatine Methacryloyl (GelMA)

  1. 10 g Gelatine aus Schweinehaut werden gewogen und in 100 ml PBS gelöst, indem die Lösung auf einer Heizplatte bei 240 U/min und 50 °C bis zur vollständigen Auflösung gerührt wird.
  2. Unter einer Haube 2 ml Methacrylsäureanhydrid (MA) für einen geringen Funktionalisierungsgrad hinzufügen und die Gelatineemulsion 2 h lang bei 240 U / min und 50 ° C rühren lassen.
    VORSICHT: MA-Gefahrenhinweis: H302 + H332 (schädlich beim Verschlucken oder Einatmen), H311 (giftig bei Hautkontakt), 314 (verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden), 315 (verursacht Hautreizungen), H317 (kann eine allergische Hautreaktion verursachen), H318 (verursacht schwere Augenschäden), 331 (toxisch beim Einatmen), H332 (schädlich beim Einatmen), H335 (kann Atemwegsreizungen verursachen). Handhabungsrichtlinien: P261 (Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dämpfe/Spray vermeiden), P305 + P351 + P338 + P310 (WENN IN AUGEN: Einige Minuten vorsichtig mit Wasser abspülen. Entfernen Sie die Kontaktlinsen, falls vorhanden und einfach. Spülen Sie weiter. Rufen Sie sofort ein GIFTZENTRUM / einen Arzt an), P301 + P312 + P330 (WENN VERSCHLUCKT: Rufen Sie ein GIFTZENTRUM / einen Arzt an, wenn Sie sich unwohl fühlen. Mund spülen).
    HINWEIS: Fügen Sie MA sehr langsam hinzu, Tropfen für Tropfen.
  3. Verdünnen Sie die Gelatine-MA-Lösung in 100 mL vorgewärmtem PBS (50 °C), um 200 mL Endvolumen zu erhalten, und lassen Sie die Lösung bei 240 U / min und 50 ° C für 10 min rühren.
  4. Schneiden Sie ~20 cm Dialysemembran (molekularer Cutoff 12-14 kDa) und weichen Sie sie in deionisiertem Wasser ein, bis sie weich ist.
    HINWEIS: Füllen Sie die Membranen mit entionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass keine Löcher oder Defekte vorhanden sind.
  5. Mit einem Trichter die Gelatine-MA-Lösung auf die Membranen übertragen.
    HINWEIS: Schließen Sie beide Seiten und lassen Sie zusätzlichen Platz im Inneren, um die Mischung zu ermöglichen.
  6. Die Membranen, die die Gelatine-MA-Lösung enthalten, zur Dialyse in einen Behälter mit 2 l destilliertem Wasser geben und bei 40 °C 5 Tage (500 U/min) rühren lassen.
    HINWEIS: Decken Sie den Behälter ab, um Eine Wasserverdunstung zu vermeiden.
  7. Wechseln Sie das destillierte Wasser zweimal am Tag. Drehen Sie die Membranen jedes Mal zur Homogenisierung auf den Kopf.
  8. Am fünften Tag 200 ml vorgewärmtes Reinstwasser (40 °C) mit der dialysierten Gelatine-MA vermischen und 15 min bei 40 °C rühren lassen.
  9. Die Gelatine-MA-Lösung auf 50 mL konische Röhrchen bis 25 mL geben und die Röhrchen 2 Tage bei -80 °C belassen.
    HINWEIS: Lagern Sie die Röhrchen horizontal, um die Lyophilisation zu erleichtern.
  10. Lyophilisieren Sie die gefrorenen Lösungen für 3-5 Tage und lagern Sie das lyophilisierte GelMA vor Feuchtigkeit geschützt.

4. Bioink-Zubereitung

HINWEIS: Um 1 ml Biotinte zu erhalten, wird empfohlen, mindestens 3 ml Biomateriallösung herzustellen, da es während der Filtration zu Verlusten kommen kann.

  1. Herstellung von Fibrinogenlösung
    1. Salzlösung (NaCl 0,9%) in entionisiertem Wasser zubereiten und 10 mg Fibrinogen aus Rinderplasma in 1 ml der Kochsalzlösung lösen, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten.
      HINWEIS: Da Fibrinogen an Glas adsorbiert, verwenden Sie keine Glaskolben, um die Fibrinogenlösung herzustellen.
    2. Lassen Sie die Lösung unter Rühren bei 37 °C bis zur vollständigen Auflösung des Fibrinogens.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Fibrinogenauflösung ein Rotationssystem, das bei 37 °C in einen Ofen gestellt wird. Eine magnetische Bewegung (180 U/min) von Fibrinogen auf einer Heizplatte bei 37 °C ist ebenfalls geeignet. Unter dieser Bedingung benötigt 10 mg / ml Fibrinogen ungefähr 40 Minuten, um sich aufzulösen.
  2. Herstellung von Gelatine/GelMA-Lösung
    1. 0,12 g Gelatine werden eingewogen und zu 1,9 ml vorgewärmtem PBS (40 °C) gegeben, um eine Endkonzentration von 4 % (w/v) Gelatine zu erhalten. Wirbel, um die Auflösung zu erleichtern.
    2. Die Emulsion bis zur vollständigen Auflösung bei 40 °C halten.
    3. 0,06 g lyophilisiertes GelMA werden eingewogen und in die Gelatinelösung überführt, um eine Endkonzentration von 2% (w/v) GelMA zu erhalten. Wirbel, um die Auflösung zu erleichtern.
    4. Die Lösung bis zur vollständigen Auflösung bei 40 °C aufbewahren.
  3. Herstellung von Astrozyten-beladener Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Biotinte
    1. 0,9 ml der 10 mg/ml Fibrinogenlösung pipettieren und in die Gelatine/GelMA-Lösung überführen, um eine Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen zu erhalten.
    2. 0,015 g Photoinitiator (PI) eingewogen und in die Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Lösung überführt, um eine Endkonzentration von 0,5 % (w/v) PI zu erhalten. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen auf und ab drehen und halten Sie es bei 40 ° C vor Licht geschützt, um pi-Degradation zu vermeiden.
      HINWEIS: Lagern Sie die Biotinte bei 4 °C für maximal 24 h.
    3. Unter der laminaren Strömung wird die Lösung mit einem 0,2 μm-Filter in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen filtriert.
      HINWEIS: Die Biomateriallösung sollte bei 37-40 °C liegen, um eine Filtration zu ermöglichen.
    4. 980 μL der Biomateriallösung in ein 15 mL konisches Röhrchen überführen.
    5. Laminin in Kochsalzlösung verdünnen, um eine Stammlösung von 100 μg/ml zu erhalten.
    6. 20 μL Laminin pipettieren und in das Röhrchen geben, das die Biotinte enthält, um eine Endkonzentration von 2 μg/ml Laminin zu erhalten.
    7. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Wenn Blasen bestehen bleiben, zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 200 x g für 2 min. Halten Sie die Biotinte bei 37 °C, bis sie mit den Zellen vermischt ist.
    8. Trypsinisieren Sie primäre Astrozyten mit 0,05% Trypsin für 5 min.
      HINWEIS: Verwenden Sie Astrozyten aus den Passagen 1 bis 3.
    9. Neutralisieren Sie die Trypsinaktivität mit FBS im Verhältnis 1:1 und übertragen Sie die Zellen auf ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 5 min.
    10. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 1 x 106 Zellen in ein anderes konisches Rohr. Zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 5 min.
    11. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ein kleines Volumen (~ 200 μL) zurück, um das Zellpellet zu suspendieren, indem Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Rohrs klopfen.
    12. 1 ml Gelatine/GelMA/Fibrinogenlösung in das Röhrchen geben, das die Zellen enthält, und vorsichtig nach oben und unten pipettieren, um zu homogenisieren, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.

5. Herstellung der Vernetzerlösung

  1. Thrombin-Rekonstitution
    1. Herstellen einer Stammlösung von Thrombin 100 U/ml in sterilem entionisiertem Wasser mit 0,1% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in einem 15 ml konischen Röhrchen. Vorrat in Mikroröhrchen bei -20 °C.
      HINWEIS: Da Thrombin an Glas adsorbiert, verwenden Sie keine Glaskolben, um die Stammlösung vorzubereiten oder die Aliquots zu lagern.
  2. Herstellung von Thrombin-CaCl2-Lösung
    1. 100 μL Thrombin-Stammlösung pipettieren und in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 8,9 ml sterilem deionisiertem Wasser überführen, um eine Endkonzentration von 1 U/ml Thrombin zu erhalten.
    2. Eine 10%ige (w/v) CaCl2-Lösung in entionisiertem Wasser herstellen und mit einem 0,2 μm-Filter sterilisieren.
    3. 1,1 mL der 10%igenCaCl2-Lösung in das thrombinhaltige konische Röhrchen überführen, um ein Endverhältnis von 1:9 (CaCl2 zu Thrombin) zu erhalten.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Vernetzerlösung in dem Volumen vor, das im Versuch verwendet werden soll, und vermeiden Sie so die Speicherung.

6. Bioprinting Astrozyten-beladene Bioink mit einem extrusionsbasierten Bioprinter

  1. Design des Nervengewebes
    1. Verwendung des G-Codes: Konstruieren Sie ein Raster von 6 x 6 mm (quadratische Form) mit 1 mm Abstand zwischen jeder biogedruckten Linie auf der X- und Y-Achse und 6 Schichten auf der Z-Achse (0,2 mm zwischen jeder Linie); Die Extrusion (E) wird auf 0,01 mm eingestellt und bei jeder neuen Schicht der Z-Achse um 0,001 mm erhöht. und stellen Sie die Druckgeschwindigkeit (F) auf 400 mm/min ein (Ergänzende Informationen).
  2. Bioprinter eingerichtet
    1. Setzen Sie die Maschine 15 Minuten lang UV-Licht aus und wischen Sie sie dann mit Ethanol 70% ab.
    2. Schalten Sie den Bioprinter mit dem Netzschalter ein. Verbinden Sie das Gerät über ein USB-Kabel mit dem Computer. Öffnen Sie die Steuerungssoftware, um sie mit dem Bioprinter zu verbinden und das Dateidesign zu laden.
  3. Vorbereitung der Bioprinting-Spritze
    1. Die mit Astrozyten beladene Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Biotinte mit einer 1.000 μL Pipette in eine 5 ml Kunststoffspritze geben.
      HINWEIS: Langsam übertragen, um Blasenbildung zu vermeiden.
    2. Schließen Sie eine sterile stumpfe 22 G Nadel an die Spritze an.
      HINWEIS: Lassen Sie die Spritze 2 Min. bei 4 °C stehen.
    3. Schließen Sie die Spritze an den Bioprinter-Druckkopf an und spülen Sie die Biotinte manuell, um die verbleibenden Blasen zu entfernen.
  4. Bioprinting
    HINWEIS: Das Bioprinting wurde außerhalb der laminaren Haube durchgeführt.
    1. Legen Sie eine 35-mm-Kulturschale auf den Bioprinter-Tisch und positionieren Sie die Nadel 0,1 mm von der Oberfläche der Kulturschale entfernt, um eine Bewegung der Nadel zu ermöglichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jeden Bioprint eine 35-mm-Kulturschale.
    2. Drücken Sie die Taste Drucken.
    3. Sobald der Bioprinting vorbei ist, stellen Sie sicher, dass sich die Spritze von der Schüssel entfernt. Schließen Sie dann das Kulturgericht und bereiten Sie sich auf den Vernetzungsprozess vor.
      HINWEIS: Der Bioprinting eines Konstrukts dauert ca. 1 min und 10 s.
  5. Vernetzung des biogedruckten Konstrukts und der Kultur
    1. Stellen Sie die Kulturschale unter UV-Licht bei 2 mW/cm2 für 2 x 60 s (oben und unten) für die GelMA-Vernetzung.
    2. Übertragen Sie unter der laminaren Strömung das biogedruckte Konstrukt mit einem sterilen Spatel auf eine 24-Well-Platte.
    3. 500 μL Thrombin/CaCl2-Lösung zugeben und 30 min einwirken lassen, um eine Fibrinvernetzung zu ermöglichen.
    4. Entfernen Sie die Vernetzungslösung und waschen Sie das Konstrukt mit 2 ml PBS 1x. Ersetzen Sie dann das PBS durch 1 ml Astrozytenkulturmedium und inkubieren Sie bei 37 ° C und 5%CO2. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.

7. Beurteilung der Lebensfähigkeit von Astrozyten

  1. Lebensfähigkeit von biogedruckten Astrozyten
    1. Übertragen Sie das biogedruckte Konstrukt mit einem Spatel auf eine 35-mm-Kulturschale.
    2. Waschen Sie das Konstrukt mit 1 ml 1x PBS.
    3. Geben Sie 100 μL des Live/Dead-Reagenzes über das Konstrukt und halten Sie es 30 min lang bei 37 °C, um es vor Licht zu schützen.
    4. Entfernen Sie das Live/Dead-Reagenz und waschen Sie das Konstrukt mit 1 ml 1x PBS.
    5. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel in eine konfokale Schale und beobachten Sie die Zellen innerhalb des Konstrukts unter einem konfokalen Mikroskop mit 488 und 570 nm Anregung für die Bildaufnahme.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerung für eine Gesamtvisualisierung der Zellen innerhalb des Konstrukts.
    6. Stellen Sie sicher, dass die Probe flach sitzt. Legen Sie bei Bedarf einen Deckglas über die Probe, um die Ebenheit zu erhöhen.
      HINWEIS: Stellen Sie während der Bildgebung sicher, dass die konfokale Schale gut verschlossen ist, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
    7. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen (grün) und toten (rot) mit einer Berechnungssoftware.
  2. Lebensfähigkeit der 2D-Astrozytenkultur
    1. Säen Sie 0,5 x 106 Astrozyten (Passage 1-3) in eine 35 mm konfokale Schale, fügen Sie Astrozytenmedium hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 ° C und 5%CO2.
    2. Wenn die Zellen konfluent sind, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es mit 1 ml 1x PBS.
    3. Geben Sie 200 μL des Live/Dead-Reagenzes ab und bewahren Sie die Schale 30 min lang bei 37 °C auf, geschützt vor Licht.
    4. Entfernen Sie das Live/Dead-Reagenz und waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x PBS.
    5. Bringen Sie die Schüssel zu einem konfokalen Mikroskop in Verbindung mit einer Digitalkamera und verwenden Sie 488 und 570 nm Anregung für die Bildaufnahme.
    6. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen (grün) und toten (rot) mit einer Berechnungssoftware.

8. Immunfärbung von Astrozyten

  1. GfAP-Färbung (Glial fibrillary acidic protein) von 3D-biogedruckten Astrozyten
    HINWEIS: Um das Vorhandensein anderer Zellmarker zu untersuchen, ändern Sie den primären Antikörper entsprechend.
    1. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen Sie das Konstrukt mit 1 ml 3x PBS.
    2. 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in die Vertiefung geben, bis das Konstrukt vollständig bedeckt ist, und lassen Sie es für 2 h bei 4 °C stehen.
    3. Entfernen Sie die PFA und waschen Sie das Konstrukt mit 1 ml 3x PBS.
      HINWEIS: Dieser Vorgang kann für mehrere Monate pausiert werden, wenn er bei 4 °C in PBS gelagert wird. Stellen Sie sicher, dass die Brunnenplatte versiegelt ist, um PBS-Verdampfung zu vermeiden.
    4. Behandeln Sie die Probe mit Glycin 0,1 mol/L für 5 min.
    5. Waschen Sie mit 1 ml 1x PBS für 5 min.
    6. Permeabilisieren Sie die Probe mit PBS, das 0,1% Triton X-100 und 10% FBS für 1 h bei 25 °C unter Orbitalbewegung enthält.
    7. Inkubieren Sie das Konstrukt mit Hühner-Anti-GFAP (primäre Antikörperverdünnung 1:500) bei 4 °C über Nacht.
    8. Aspirieren Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Probe mit 1 ml PBS für 5 min, 3 mal.
      HINWEIS: Der primäre Antikörper kann bei Lagerung bei 4 °C mehrmals wiederverwendet werden.
    9. Inkubieren Sie die Probe mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-Huhn (sekundäre Antikörperverdünnung 1:500) und 1 μg/ml DAPI für 1 h bei 25 °C unter orbitaler Bewegung.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Probe vor Licht geschützt auf.
    10. Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBS für 5 min, 3 mal.
    11. Übertragen Sie das Konstrukt auf eine 35 mm konfokale Schale.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schale gut verschlossen ist, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
  2. GfAP-Färbung (Glialfibrillary Acidic Protein) der 2D-Astrozytenkultur
    1. Säen Sie 0,5 x 106 Astrozyten (Passage 1-3) in eine 35 mm konfokale Schale, fügen Sie Astrozytenmedium hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 ° C und 5%CO2.
    2. Wenn die Zellen konfluent sind, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie sie mit 1 ml 1x PBS.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrozyten-Zytoskelett-Färbung
    1. Wiederholen Sie die Schritte 8.1.1-8.1.6.
    2. 200 μL 50 μg/ml fluoreszenzkonjugierte Phalloidinlösung in PBS und 1 μg/ml DAPI über das Konstrukt geben.
    3. 1 h bei 25 °C unter Orbitalbewegung inkubieren und die Probe vor Licht geschützt halten.
    4. Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBS für 5 min 3 mal und übertragen Sie das Konstrukt mit einem Spatel in eine konfokale Schale.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schale gut verschlossen ist, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.

9. Konfokale Bildgebung

  1. Bringen Sie das Geschirr zu einem konfokalen Mikroskop in Verbindung mit einer Digitalkamera zur Bildgebung (359, 488 und 570 nm Anregung).
  2. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 10x für eine Gesamtvisualisierung und 40 oder 63x für gezoomte Bilder von Zellen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe flach sitzt. Legen Sie bei Bedarf einen Deckglas über die Probe, um die Ebenheit zu erhöhen.

Ergebnisse

Diese Arbeit zielte darauf ab, ein neuralähnliches Gewebe zu entwickeln, das die 3D-Bioprinting-Technologie nutzt, um Schicht für Schicht primäre Astrozyten-beladene Gelatine / GelMA / Fibrinogen-Biotinte abzuscheiden. Astrozyten wurden extrahiert und aus der Großhirnrinde von Mäusewelpen isoliert (Abbildung 1), zu einer Biomaterialzusammensetzung hinzugefügt, die die Biofabrikation eines lebenden 3D-Konstrukts ermöglicht.

Das Computer-Aided-Design (CAD) wu...

Diskussion

Die 3D-Bioprinting-Technologie hat sich als Biofabrikationsalternative herausgestellt, die die Entwicklung verfeinerter Konstrukte ermöglicht, die strukturell und physiologisch nativen Geweben ähneln22, einschließlich des Gehirns23. Die Biofabrikation von neuralähnlichen Geweben ermöglicht eine in vitro native Mikroumgebungsmodellierung und ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die mit der Entwicklung und Beha...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation (FAPESP), Fördernummern 2018/23039-3 und 2018/12605-8, unterstützt; Nationaler Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq), Fördernummern 465656/2014-5 und 309679/2018-4; und Koordinierung zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES), Finanzcode 001.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

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