用于工程神经样组织的小鼠皮质星形胶质细胞的3D生物打印

摘要

在这里，我们报道了一种3D生物打印小鼠皮质星形胶质细胞的方法，用于生物制造神经样组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能以及涉及神经胶质细胞在神经系统疾病和治疗中的机制。

摘要

星形胶质细胞是神经胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中起着至关重要的作用，包括神经元的支持和功能。这些细胞也对神经损伤有反应，并保护组织免受退行性事件的影响。星形胶质细胞功能的 体外 研究对于阐明此类事件所涉及的机制并有助于开发治疗神经系统疾病的疗法非常重要。该协议描述了一种通过3D生物打印含有星形胶质细胞的生物墨水生物制造富含星形胶质细胞的神经样组织结构的方法。在这项工作中使用了基于挤出的3D生物打印机，并从C57Bl / 6小鼠幼崽的脑皮质层中提取星形胶质细胞。通过将皮质星形胶质细胞从第3代混合到由明胶，明胶 - 甲基丙烯酰（GelMA）和纤维蛋白原组成的生物材料溶液中，并补充层粘连蛋白来制备生物墨水，其提供了最佳的生物打印条件。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，有助于星形胶质细胞在此过程中的高活力，其中74.08%±1.33%的细胞在生物打印后立即存活。孵育1周后，星形胶质细胞的活力显着增加到83.54%±3.00%，表明3D构建体代表了适合细胞生长的微环境。生物材料组成允许细胞附着并刺激星形细胞行为，细胞表达特定的星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）并具有典型的星形细胞形态。这种可重复的方案提供了一种有价值的方法来生物制造富含星形胶质细胞的3D神经样组织，类似于细胞的天然微环境，对于旨在了解星形胶质细胞的功能及其与神经系统疾病中涉及的机制的关系的研究人员很有用。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在大脑稳态中起着关键作用。除了持久的神经元支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质摄取，维持血脑屏障完整性，并调节神经元突触发生^1，2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，在导致星体反应性或反应性星形胶质细胞增多症^3，4的过程中对大脑损伤作出反应^，形成神经胶质疤痕，阻止健康组织暴露于退行性因子^5。该事件导致星形胶质细胞的基因表达，形态和功能^{的变化6，7。}因此，涉及星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的疗法。

体外 模型对于研究与神经损伤相关的机制至关重要，尽管已经建立了成功的皮质星形胶质细胞的分离和二维（2D）培养^8，但该模型未能提供模拟天然细胞行为的现实环境并重现大脑的复杂性⁹.在2D条件下，较差的机械和生化支持，低细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用以及细胞扁平化导致基底 - 顶端极性缺失，影响细胞信号传导动力学和实验结果，导致细胞形态和基因表达改变，从而损害对治疗的反应^10。因此，开发提供更逼真的神经环境的替代方案至关重要，旨在将结果转化为临床。

三维（3D）细胞培养代表了一种更先进的模型，该模型概括了器官和组织（包括CNS^11）的保真度增加的特征。关于神经胶质培养，3D模型有助于维持星形胶质细胞形态，细胞基底 - 顶端极性和细胞信号传导^12，13。3D生物打印技术成为一种强大的工具，通过使用细胞和生物材料重建天然组织的结构和性质，以受控的方式生物制造3D活组织。该技术的使用导致了结果预测的实质性改进，并有助于再生医学应用于CNS^{14，15，16。}

这里描述的方案详细介绍了皮质星形胶质细胞的分离和培养。该协议还详细介绍了一种可重复的方法，用于生物打印嵌入明胶/明胶甲基丙烯酰（GelMA）/纤维蛋白原中的星形胶质细胞，并补充层粘连蛋白。在这项工作中，使用基于挤出的生物打印机以1×10⁶个细胞/ mL的密度打印含有皮质星形胶质细胞的生物材料组合物。通过控制打印速度将生物打印剪切应力降至最低，并且星形胶质细胞在该过程后显示出高活力。生物打印构建体培养1周，星形胶质细胞能够在水凝胶内扩散，附着和存活，维持星形细胞形态并表达特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4 。

该程序与活塞驱动的基于挤出的生物打印机兼容，可用于生物打印来自不同来源的星形胶质细胞。这里提出的3D生物打印模型适用于广泛的神经工程应用，例如研究健康组织中星形胶质细胞功能所涉及的机制以及了解神经病理学的进展和治疗发展。

研究方案

所有涉及动物的程序都遵循国际动物在研究中使用的指导方针（http://www.iclas.org），并得到圣保罗联邦大学研究伦理委员会（CEUA 2019 / 9292090519）的批准。

1. 小鼠脑部解剖

1. 将 10 mL 冷汉克斯缓冲盐溶液 （HBSS） 转移到 100 mm 培养皿中，将 1 mL 转移到 1.5 mL 微管中。每只动物准备一个微管。
   注意:培养皿和微管都需要保持在冰上。
2. 使用DMEM F12 + 10%胎牛血清（FBS），2%谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素（P / S）制备星形胶质细胞培养基。通过使用0.2μm过滤器过滤对培养基进行灭菌。
3. 使用锋利的手术剪刀斩首C57Bl / 6小鼠幼崽（出生后第1天）实施安乐死。使用镊子，拉扯皮肤并暴露头骨。确保剪刀和镊子都用70%乙醇灭菌。
4. 使用锋利的弯曲尖端剪刀沿着矢状平面将头骨从大孔切到头顶。
   注意:确保脑组织没有受损。
5. 使用先前用乙醇灭菌的刮刀70%，将大脑从颅腔中取出并将其放入含有10mL冷HBSS的培养皿中。
6. 将含有大脑的培养皿置于立体显微镜下，并使用两个钝尖镊子，从大脑中取出脑膜（图1）。
7. 通过使用刮刀轻轻地将它们从大脑的正中线滚动开来，将皮质层与大脑的其余部分分开。
8. 收集两个皮质，并立即将它们转移到含有1 mL冷HBSS的同一微管中。

2. 星形胶质细胞分离和培养

1. 在层流下，使用弯曲的微型剪刀将皮质组织切成小块，并通过上下移液3次用1 mL HBSS洗涤它们。等待纸巾安定下来。删除 HBSS 并添加新的 HBSS，再重复该过程两次。
2. 除去HBSS，用1mL0.05%胰蛋白酶在37°C下孵育组织5分钟。
   注意:此时只有胰蛋白酶消化就足够了。
3. 通过轻轻地上下移液15倍来机械地解离组织。
   注意:通过悬浮液浊度的增加和悬浮液中没有大块组织碎片来观察组织的完全解离。
4. 将溶液转移到15mL锥形管中，通过加入等体积的FBS中和胰蛋白酶活性，并在0.4μm的细胞过滤器过滤器中过滤溶液以除去未解离的片段。
5. 用1mL星形胶质细胞培养基洗涤过滤器，收集通过过滤器的细胞悬浮液，并在200×g和25°C下离心5分钟。 离心后，弃去上清液并将沉淀悬浮在1mL星形胶质细胞培养基中。
6. 将细胞悬浮液转移到T25培养瓶中，将培养基的体积组成为3.5mL，并将细胞在37°C和5%CO₂下孵育。
7. 确保24小时后，细胞贴壁。然后，更换培养基并每3天更换一次。
8. 7天后，通过用2mL 1x PBS洗涤细胞，从培养物中除去小胶质细胞和少突胶质细胞。
9. 用星形胶质细胞培养基代替PBS溶液，并将培养瓶以180rpm的转速留在轨道振荡器中过夜。
   注意:星形胶质细胞在大约10-12天的培养中形成汇合的单层。

3. 明胶甲基丙烯酰（GelMA）的合成

1. 称取从猪皮获得的10克明胶，并通过让溶液在加热板上以240rpm和50°C搅拌直至完全溶解来溶解在100mL PBS中。
2. 在罩下，加入2mL甲基丙烯酸酐（MA）以获得低程度的功能化，并让明胶乳液在240rpm和50°C下搅拌2小时。
   注意:MA危险说明:H302 + H332（吞咽或吸入有害），H311（与皮肤接触有毒），314（引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤），315（引起皮肤刺激），H317（可能引起过敏性皮肤反应），H318（引起严重眼损伤），331（吸入有毒），H332（吸入有害），H335（可能引起呼吸道刺激）。处理指南:P261（避免吸入灰尘/烟雾/气体/烟雾/蒸气/喷雾），P305 + P351 + P338 + P310（如果眼睛进入:用水小心冲洗几分钟。取下隐形眼镜（如果存在且易于操作）。继续冲洗。立即呼叫毒物中心/医生），P301 + P312 + P330（如果吞咽:如果您感到不适，请致电解毒中心/医生。漱口）。
   注意:添加 MA 非常缓慢，一滴一滴。
3. 将明胶-MA溶液稀释在100mL预热的PBS（50°C）中，以获得200mL的最终体积，并让溶液在240rpm和50°C下搅拌10分钟。
4. 切下约20厘米的透析膜（分子截止12-14 kDa），并将其浸泡在去离子水中直至变软。
   注意:用去离子水填充膜，以确保没有孔或缺陷。
5. 使用漏斗将明胶-MA溶液转移到膜上。
   注意:关闭两侧，在内部留出额外的空间以允许混合。
6. 将含有明胶-MA溶液的膜放入装有2L蒸馏水进行透析的容器中，让它们在40°C下搅拌5天（500rpm）。
   注意:盖上容器，避免水分蒸发。
7. 每天更换两次蒸馏水。每次，将膜倒置以进行均质化。
8. 在第五天，将200mL预热的超纯水（40°C）混合到透析的明胶-MA中，并在40°C下搅拌15分钟。
9. 将明胶-MA溶液转移到50 mL锥形管中，最高可达25 mL，并让管在-80°C下保持2天。
   注意:水平存放试管，以利于冻干。
10. 冻干冷冻溶液3-5天，并储存冻干凝胶MA免受潮湿。

4. 生物墨水制备

注意:为了获得1 mL的生物墨水，建议制造至少3 mL的生物材料溶液，因为在过滤过程中可能会有损失。

1. 纤维蛋白原溶液的制备
   1. 在去离子水中制备盐水溶液（NaCl 0.9%），并将牛血浆中的10mg纤维蛋白原溶解在1mL盐水溶液中，以获得10mg / mL的浓度。
      注意:由于纤维蛋白原吸附到玻璃上，请勿使用玻璃烧瓶制备纤维蛋白原溶液。
   2. 将溶液在37°C搅拌下放置，直到纤维蛋白原完全溶解。
      注意:对于纤维蛋白原溶解，使用放置在37°C烘箱内的旋转系统。 在37°C的热板上磁性搅拌（180rpm）纤维蛋白原也是合适的。在这种情况下，10 mg / mL纤维蛋白原需要大约40分钟才能溶解。
2. 明胶/凝胶MA溶液的制备
   1. 称取0.12克明胶，加入1.9毫升预热的PBS（40°C）中，得到终浓度为4%（w / v）的明胶。涡流有利于溶解。
   2. 将乳液保持在40°C直至完全溶解。
   3. 称取0.06g冻干凝胶MA并转移到明胶溶液中，以获得终浓度为2%（w / v）的GelMA。涡流有利于溶解。
   4. 将溶液保持在40°C直至完全溶解。
3. 含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的制备
   1. 移取0.9mL的10mg / mL纤维蛋白原溶液，并转移到明胶/ GelMA溶液中，以获得终浓度为3mg / mL的纤维蛋白原。
   2. 称取0.015g光引发剂（PI）并转移到明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液中，以获得终浓度为0.5%（w / v）PI。通过上下翻转管子来混合溶液，并将其保持在40°C，避免光照，以避免PI降解。
      注意:将生物墨水在4°C下储存最多24小时。
   3. 在层流下，使用0.2μm过滤器过滤溶液到无菌的15mL锥形管中。
      注意:生物材料溶液应在37-40°C下进行过滤。
   4. 将980μL生物材料溶液转移到15mL锥形管中。
   5. 将层粘连蛋白稀释在盐水中，以获得100μg/ mL的储备溶液。
   6. 移取20μL层粘连蛋白并转移到含有生物墨水的管中，以获得最终浓度为2μg/ mL层粘连蛋白。
   7. 通过上下移液轻轻混合，避免气泡。如果任何气泡持续存在，则以200×g离心锥形管2分钟。 将生物墨水保持在37°C，直到与细胞混合。
   8. 胰蛋白酶用0.05%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞进行5分钟。
      注意:使用第1至3段的星形胶质细胞。
   9. 用FBS以1:1的比例中和胰蛋白酶活性，并将细胞转移到15mL锥形管中。以200×g离心5分钟。
   10. 计数细胞并将1 x 10⁶个细胞转移到不同的锥形管中。以200×g离心5分钟。
   11. 通过轻轻敲击锥形管的底部，除去留下小体积（〜200μL）的上清液以悬浮细胞沉淀。
   12. 将1mL明胶/ GelMA /纤维蛋白原溶液转移到含有细胞的管中，并轻轻地上下移液以匀浆，获得1 x 10⁶ 个细胞/ mL的最终浓度。

5. 交联剂溶液的制备

1. 凝血酶重建
   1. 在15 mL锥形管中制备凝血酶100 U / mL的储备溶液，在无菌去离子水中加入0.1%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）。在-20°C的微管中储存。
      注意:由于凝血酶吸附到玻璃上，请勿使用玻璃烧瓶制备储备溶液或储存等分试样。
2. 凝血酶-CaCl₂ 溶液的制备
   1. 移取100μL凝血酶储备溶液，并转移到含有8.9mL无菌去离子水的50mL锥形管中，以获得1 U / mL凝血酶的终浓度。
   2. 在去离子水中制备10%（w / v）CaCl₂ 溶液，并使用0.2μm过滤器灭菌。
   3. 将1.1mL的10%CaCl₂ 溶液转移到含有凝血酶的锥形管中，以获得1:9的最终比例（CaCl₂ 与凝血酶）。
      注意:以实验中使用的体积准备交联剂溶液，避免储存。

6. 使用基于挤出的生物打印机对含有星形胶质细胞的生物墨水进行生物打印

1. 神经组织的设计
   1. 使用G代码:构建一个6 x 6 mm（方形）的网格，X轴和Y轴上的每条生物打印线之间的距离为1 mm，Z轴上的6层（每行之间为0.2 mm）;将挤出（E）设置为0.01毫米，在Z轴的每一个新层处增加0.001毫米;并将打印速度（F）设置为400毫米/分钟（补充信息）。
2. 生物打印机设置
   1. 将机器暴露在紫外线下15分钟，然后用70%乙醇擦拭。
   2. 使用电源开关打开生物打印机。通过 USB 电缆将机器连接到计算机。打开控制软件将其连接到生物打印机并加载文件设计。
3. 生物打印注射器的制备
   1. 使用1，000μL移液管将含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移到5 mL塑料注射器中。
      注意:缓慢转移以避免气泡形成。
   2. 将无菌的22 G钝针连接到注射器。
      注意:将注射器在4°C下放置2分钟。
   3. 将注射器连接到生物打印机打印头，然后手动冲洗生物墨水以除去剩余的气泡。
4. 生物打印
   注:生物打印是在层流罩外进行的。
   1. 将35mm培养皿放在生物打印机台上，并将针头放置在距离培养皿表面0.1mm的位置，以允许针头移动。
      注意:每次生物打印使用一个35毫米培养皿。
   2. 按 打印 按钮。
   3. 生物打印结束后，确保注射器远离培养皿。然后，关闭培养皿并准备交联过程。
      注意:一个结构的生物打印大约需要1分钟和10秒。
5. 交联生物打印结构和培养物
   1. 将培养皿置于2 mW /^cm 2的紫外线下，持续2 x 60秒（上下）以进行GelMA交联。
   2. 在层流下，使用无菌刮刀将生物打印的结构转移到24孔板中。
   3. 加入500μL凝血酶/ CaCl₂ 溶液，放置30分钟以允许纤维蛋白交联。
   4. 取出交联溶液，用2 mL PBS 1x清洗结构。然后，用1mL星形胶质细胞培养基代替PBS，并在37°C和5%CO₂下孵育。每3天更换一次培养基。

7. 星形胶质细胞活力评估

1. 生物打印星形胶质细胞的活力
   1. 使用刮刀将生物打印的结构转移到35mm培养皿中。
   2. 用 1 mL 1x PBS 清洗结构。
   3. 将100μL活/死试剂沉积在构建物上，并将其保持在37°C下30分钟，使其免受光照。
   4. 取出活/死试剂，并用1 mL 1x PBS洗涤构建体。
   5. 使用刮刀将样品转移到共聚焦培养皿中，并使用488和570nm激发在共聚焦显微镜下观察构建体内的细胞以获取图像。
      注意:使用 10 倍的放大倍率对构造中的单元格进行整体可视化。
   6. 确保样品平放。如有必要，在样品上放置盖玻片以增加平坦度。
      注:在成像过程中，请确保共聚焦皿密封良好，以防止样品变干。
   7. 使用计算软件计算可行（绿色）和死亡（红色）的数量。
2. 二维星形胶质细胞培养的活力
   1. 在35mm共聚焦皿中播种0.5×10⁶ 个星形胶质细胞（传代1-3），加入星形胶质细胞培养基，并在37°C和5%CO₂下孵育它们。
   2. 当细胞汇合时，取出培养基并用1mL 1x PBS洗涤。
   3. 沉积200μL活/死试剂，并将培养皿在37°C下保持30分钟，避光。
   4. 取出活/死试剂，并用1 mL 1x PBS洗涤细胞。
   5. 将培养皿与数码相机一起放入共聚焦显微镜，并使用488和570 nm激发进行图像采集。
   6. 使用计算软件计算可行（绿色）和死亡（红色）的数量。

8. 星形胶质细胞的免疫染色

1. 3D生物打印星形胶质胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
   注意:要研究其他细胞标志物的存在，请相应地改变一抗。
   1. 从孔中取出培养基，并用1 mL 3x PBS洗涤结构。
   2. 将PBS中的4%多聚甲醛（PFA）添加到井中，直到结构完全覆盖，并在4°C下放置2小时。
   3. 取出PFA，用1 mL 3x PBS清洗结构。
      注意:如果在PBS中储存在4°C下，此过程可以暂停数月。确保孔板密封，以避免PBS蒸发。
   4. 用甘氨酸0.1摩尔/升处理样品5分钟。
   5. 用 1 mL 1x PBS 洗涤 5 分钟。
   6. 在轨道搅拌下，用含有0.1%Triton X-100和10%FBS的PBS在25°C下透化样品1小时。
   7. 将构建体与鸡肉抗GFAP（一抗稀释1:500）在4°C下孵育过夜。
   8. 吸出一抗并用1mL PBS洗涤样品5分钟，3次。
      注意:一抗在4°C下储存时可重复使用多次。
   9. 在轨道搅拌下，用Alexa fluor 488偶联抗鸡（二抗稀释1:500）和1μg/ mL DAPI孵育样品1小时，在25°C下。
      注:请保持样品避光。
   10. 用1 mL PBS洗涤样品5分钟，3次。
   11. 将结构转移到35 mm共聚焦皿中。
       注意:确保培养皿密封良好，以防止样品变干。
2. 2D星形胶质细胞培养的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
   1. 在35mm共聚焦皿中播种0.5×10⁶ 个星形胶质细胞（传代1-3），加入星形胶质细胞培养基，并在37°C和5%CO₂下孵育它们。
   2. 当细胞汇合时，取出培养基并用1mL 1x PBS洗涤它们。
   3. 重复步骤 8.1.2-8.1.10。
3. 星形胶质细胞细胞骨架染色
   1. 重复步骤 8.1.1-8.1.6。
   2. 在PBS中加入200μL50μg/ mL荧光偶联的鬼臼素溶液，并在构建体上加入1μg/ mL的DAPI。
   3. 在轨道搅拌下在25°C下孵育1小时，使样品免受光照。
   4. 用1 mL PBS洗涤样品5分钟3次，然后用刮刀将结构转移到共聚焦皿中。
      注意:确保培养皿密封良好，以防止样品变干。

9. 共聚焦成像

1. 将培养皿带到共聚焦显微镜和数码相机上进行成像（359，488和570nm激发）。
2. 使用 10 倍的放大倍率进行整体可视化，使用 40 倍或 63 倍的放大倍率进行细胞的缩放图像。
   注意:确保样品平放。如有必要，在样品上放置盖玻片以增加平坦度。

结果

这项工作旨在使用3D生物打印技术开发一种神经样组织，以逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/ GelMA / 纤维蛋白原生物墨水。从小鼠幼崽的大脑皮层中提取和分离星形胶质细胞（图1），添加到生物材料组合物中，允许生物制造活的3D构建体。

计算机辅助设计（CAD）是使用G代码（补充文件）作为方形（0.6 x 0.6毫米）的互连框架开发的，孔?...

讨论

3D生物打印技术已经成为一种生物制造替代方案，可以设计出在结构和生理上类似于天然组织²²的精制结构，包括大脑^23。神经样组织的生物制造允许在体外进行天然微环境建模，是了解与影响CNS¹¹的许多疾病的发展和治疗相关的细胞和分子机制的重要工具。由于神经胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮质星形胶质细胞已被用于许多研?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Bioprinter	3D Biotechnology Solutions		Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps	Integra Miltex	6--30	Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Cell culture flask	Fisher Scientific	156340	Culture flask T25
Cell strainer	Corning Incorporated	352340	Cell strainer 40 µm
Confocal microscope	Leica		Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes	Thermo Scientific	339651, 339652	Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	DAPI staining solution
DMEM/F12	Gibco; Life Technologies Corporation	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol	Fisher Scientific	64-15-5	Reagent grade
Fetal Bovine Serum	Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	Research Grade
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatin powder from porcine skin
Glycine	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutamine crystalline powder
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit	Thermo Scientific	R37601	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	760-93-0	For GelMA preparation
Microtubes	Corning Incorporated	MCT-150-C	Microtubes of 1,5 mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Needle 22G	Fisher Scientific	NC1362045	Sterile blunt needle
Operating scissor	Integra Miltex	05--02	Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish	Corning Incorporated	430591, 430588	Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin	Abcam	ab176753	iFluor 488 reagent
Photoinitiator	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody	Abcam	ab4674	Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula	Miltex	V973-70	Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope	Fisherbrand	3000038	Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL	BD	1222C84	Sterile syringe
Syringe filter 2 µm	Fisher Scientific	09-740-105	Polypropylene filter for sterilization
Thrombin	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Laboratory grade
Trypsin-EDTA	Gibco; Life Technologies Corporation	15400054	Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate	Thermo Scientific	144530	Sterile 24-well plate