JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui relatamos um método de bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para biofabricagem de tecidos neurais para estudar a funcionalidade dos astrócitos no sistema nervoso central e os mecanismos que envolvem células gliais em doenças neurológicas e tratamentos.

Resumo

Os astrócitos são células gliais com um papel essencial no sistema nervoso central (SNC), incluindo suporte neuronal e funcionalidade. Essas células também respondem a lesões neurais e agem para proteger o tecido de eventos degenerativos. Estudos in vitro da funcionalidade dos astrócitos são importantes para elucidar os mecanismos envolvidos nesses eventos e contribuir para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos. Este protocolo descreve um método para biofabricar uma estrutura de tecido neural rica em astrócitos por bioimizades 3D carregados de astrócitos. Uma bioimpressora 3D baseada em extrusão foi usada neste trabalho, e os astrócitos foram extraídos dos cortices cerebrais dos filhotes de C57Bl/6. O bioink foi preparado pela mistura de astrócitos cortical de até a passagem 3 para uma solução biomaterial composta de gelatina, gelatina-methacryloyl (GelMA) e fibrinogênio, complementado com laminina, que apresentava condições ótimas de bioimpressão. As condições de bioimpressão 3D minimizaram o estresse celular, contribuindo para a alta viabilidade dos astrócitos durante o processo, em que 74,08% ± 1,33% das células eram viáveis logo após a bioimpressão. Após 1 semana de incubação, a viabilidade dos astrócitos aumentou significativamente para 83,54% ± 3,00%, indicando que o construto 3D representa um microambiente adequado para o crescimento celular. A composição do biomatélmico permitiu o apego celular e estimulou o comportamento astrócito, com células expressando os astrócitos específicos marcador de proteína ácida fibrilar glicial (GFAP) e possuindo morfologia astróctica típica. Este protocolo reprodutível fornece um método valioso para biofabricar tecido neural 3D rico em astrócitos que se assemelha ao microambiente nativo das células, útil para pesquisadores que visam entender a funcionalidade dos astrócitos e sua relação com os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas.

Introdução

Os astrócitos são o tipo celular mais abundante no Sistema Nervoso Central (SNC) e desempenham um papel fundamental na homeostase cerebral. Além do suporte neuronal duradouro, os astrócitos são responsáveis por modular a absorção de neurotransmissores, manter a integridade da barreira hematoencefálica e regular a sinapstogênese neuronal1,2. Os astrócitos também têm um papel essencial na inflamação do SNC, respondendo a lesões no cérebro em um processo que leva à reatividade astrocativa ou astrogliose reativa3,4, formando uma cicatriz gliar que impede a exposição saudável do tecido aos agentes degenerativos5. Este evento resulta em mudanças na expressão genética dos astrócitos, morfologia e função6,7. Portanto, estudos envolvendo a funcionalidade dos astrócitos são úteis para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos.

Modelos in vitro são cruciais para estudar mecanismos relacionados a lesões neurológicas, e embora o isolamento bem sucedido e a cultura bidimensional (2D) dos astrócitos cortical tenham sido estabelecidos8,este modelo não fornece um ambiente realista que imita o comportamento celular nativo e para reproduzir a complexidade do cérebro9 . Em condição 2D, o fraco suporte mecânico e bioquímico, as interações de células baixas e matriz celular e o achatamento celular, levando à ausência de polaridade basal-apical, afetam a dinâmica de sinalização celular e os desfechos experimentais levando à alteração da morfologia celular e expressão genética, que comprometem a resposta aos tratamentos10. Por isso, é fundamental desenvolver alternativas que proporcionem um ambiente neural mais realista, visando traduzir os resultados para a clínica.

A cultura celular tridimensional (3D) representa um modelo mais avançado que recapitula com características de fidelidade aumentadas de órgãos e tecidos, incluindo o CNS11. Em relação à cultura gliana, os modelos 3D contribuem para a manutenção da morfologia dos astrócitos, polaridade basal-apical celular e sinalização celular12,13. A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma poderosa ferramenta para biofabritor tecidos vivos 3D de forma controlada, usando células e biomateriais para recriar a estrutura e propriedades dos tecidos nativos. O uso dessa tecnologia levou a uma melhoria substancial da previsão de resultados e contribuiu para a medicina regenerativa aplicada ao CNS14,15,16.

O protocolo descrito aqui detalha o isolamento e a cultura dos astrócitos cortical. O protocolo também detalha um método reprodutível para bioimpressão de astrócitos embutidos em gelatina/gelatina methacryloyl (GelMA)/fibrinogen, complementado com laminina. Neste trabalho, uma bioimpressora baseada em extrusão foi usada para imprimir a composição biomaterial contendo astrócitos cortical a uma densidade de 1 x106 células/mL. O estresse da tesoura de bioimpressão foi minimizado pelo controle da velocidade de impressão, e os astrócitos apresentaram alta viabilidade após o processo. Construções bioimpressadas foram cultivadas por 1 semana, e os astrócitos foram capazes de se espalhar, anexar e sobreviver dentro do hidrogel, mantendo a morfologia astróctica e expressando um marcador específico de proteína ácida fibrilar (GFAP)4.

Este procedimento é compatível com bioimpressoras baseadas em extrusão orientadas por pistão e pode ser usado para bioimpressão de astrócitos derivados de diferentes fontes. O modelo bioimpresso 3D proposto aqui é adequado para uma ampla gama de aplicações de engenharia neural, como estudos dos mecanismos envolvidos na funcionalidade de astrócitos em tecidos saudáveis e compreensão da progressão de patologias neurológicas e desenvolvimento do tratamento.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram diretrizes internacionais para uso de animais em pesquisa (http://www.iclas.org) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019/9292090519).

1. Dissecção cerebral de camundongos

  1. Transfira 10 mL de solução de sal tampão hanks frio (HBSS) para um prato de cultura de 100 mm e 1 mL para um microtubo de 1,5 mL. Prepare um microtubo por animal.
    NOTA: Tanto o prato de cultura quanto o microtubo precisam ser mantidos no gelo.
  2. Prepare o meio de cultura dos astrócitos utilizando DMEM F12 + 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 2% glutamina e 1% Penicilina-Estreptomicina (P/S). Esterilize o meio filtrando usando um filtro de 0,2 μm.
  3. Euthanize filhotes de camundongos C57Bl/6 (pós-natal dia 1) por decapitação usando uma tesoura de operação afiada. Usando fórceps, puxe a pele e exponha o crânio. Certifique-se de que tanto a tesoura quanto as fórceps estão esterilizadas com 70% de etanol.
  4. Corte o crânio do forame magnum até o topo da cabeça ao longo do plano sagital usando uma tesoura de ponta curva afiada.
    NOTA: Certifique-se de que o tecido encefálico não está danificado.
  5. Usando uma espátula previamente esterilizada com etanol 70%, levante o cérebro da cavidade craniana e coloque-o no prato de cultura contendo 10 mL de HBSS frio.
  6. Coloque o prato de cultura contendo o cérebro sob o estereóscópio, e usando dois fórceps de ponta sem corte, remova as meninges do cérebro(Figura 1).
  7. Separe os cortices do resto do cérebro, enrolando-os suavemente para longe da linha mediana do cérebro usando uma espátula.
  8. Colete os dois cortices e transfira-os imediatamente para o mesmo microtubo contendo 1 mL de HBSS frio.

2. Isolamento e cultura de astrócitos

  1. Sob o fluxo laminar, corte o tecido cortical em pequenos pedaços usando uma micro tesoura curvada, e lave-os com 1 mL de HBSS por tubulação para cima e para baixo 3x. Espere o tecido se acalmar. Remova o HBSS e adicione HBSS fresco, repetindo o processo mais duas vezes.
  2. Retire o HBSS e incuba o tecido com 1 mL de trippsina de 0,05% a 37 °C por 5 min.
    NOTA: Apenas a digestão de trippsina é suficiente neste momento.
  3. Dissociar mecanicamente o tecido, encanar suavemente para cima e para baixo 15x.
    NOTA: A dissociação completa do tecido é observada pelo aumento da turbidez da suspensão e pela ausência de grandes fragmentos de tecido na suspensão.
  4. Transfira a solução para um tubo cônico de 15 mL, neutralize a atividade de trippsina adicionando um volume igual de FBS e transfira a solução em um filtro de filtro de filtro de célula de 0,4 μm para remover fragmentos não dissociados.
  5. Lave o filtro com 1 mL de meio de astrócitos, colete a suspensão celular que passou pelo coador e centrífugue por 5 min a 200 x g e 25 °C. Após a centrifugação, descarte o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de meio de cultura de astrócitos.
  6. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura T25, compor o volume do médio para 3,5 mL e incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
  7. Certifique-se de que depois de 24 horas, as células são aderentes. Em seguida, substitua o meio e troque-o a cada 3 dias.
  8. Após 7 dias, remova microglia e oligodendrócitos da cultura lavando as células com 2 mL de 1x PBS.
  9. Substitua a solução PBS pelo meio de cultura de astrócitos e deixe o frasco de cultura em um agitador orbital a 180 rpm durante a noite.
    NOTA: Os astrócitos formam uma monocamada confluente em aproximadamente 10-12 dias de cultura.

3. Síntese de gelatina methacryloyl (GelMA)

  1. Pese 10 g de gelatina obtida da pele suína e dissolva em 100 mL de PBS deixando a solução mexer em uma placa de aquecimento a 240 rpm e 50 °C até a dissolução completa.
  2. Sob um capô, adicione 2 mL de anidrido de metacríclico (MA) para um baixo grau de funcionalização, e deixe a emulsão de gelatina mexer a 240 rpm e 50 °C por 2h.
    ATENÇÃO: Declaração de risco ma: H302 + H332 (prejudicial se engolido ou inalado), H311 (tóxico em contato com a pele), 314 (causa queimaduras graves na pele e danos oculares), 315 (causa irritação na pele), H317 (pode causar reação alérgica à pele), H318 (causa danos oculares graves), 331 (tóxico se inalado), H332 (prejudicial se inalado), H335 (pode causar irritação respiratória). Orientações de manuseio: P261 (evite respirar poeira/vapor/gás/névoa/vapores/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (IF IN EYES: Enxágue com cautela com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se estiver presente e fácil de fazer. Ligue imediatamente para um CENTRO/MÉDICO DE VENENO), P301 + P312 + P330 (SE ENGOLIDO: Ligue para um CENTRO/médico de veneno se você se sentir mal. Enxágüe a boca).
    NOTA: Adicione MA muito lentamente, gota a gota.
  3. Diluir a solução gelatin-MA em 100 mL de PBS pré-aquecido (50 °C) para obter 200 mL de volume final e deixar a solução mexer a 240 rpm e 50 °C por 10 min.
  4. Corte ~20 cm de membrana de diálise (corte molecular de 12-14 kDa) e mergulhe-a em água deionizada até ficar macia.
    NOTA: Encha as membranas com água desionizada para certificar-se de que não há orifícios ou defeitos.
  5. Usando um funil, transfira a solução gelatina-MA para as membranas.
    NOTA: Feche ambos os lados deixando espaço extra dentro para permitir a mistura.
  6. Coloque as membranas que contêm a solução gelatina-MA em um recipiente com 2 L de água destilada para diálise, deixando-as mexer a 40 °C por 5 dias (500 rpm).
    NOTA: Cubra o recipiente para evitar a evaporação da água.
  7. Troque a água destilada duas vezes por dia. Cada vez, vire as membranas de cabeça para baixo para homogeneizar.
  8. No quinto dia, misture 200 mL de água ultrauso pré-aquecido (40 °C) à gelatina dialisada-MA, e deixe mexer por 15 min a 40 °C.
  9. Transfira a solução gelatin-MA para tubos cônicos de 50 mL até 25 mL e deixe os tubos permanecerem a -80 °C por 2 dias.
    NOTA: Armazene os tubos horizontalmente para facilitar a liofilização.
  10. Lyophilize as soluções congeladas por 3-5 dias e armazene o GelMA liofilizado protegido da umidade.

4. Preparação de bioink

NOTA: Para obter 1 mL de bioink, recomenda-se fabricar pelo menos 3 mL de solução biomaterial, pois pode haver perdas durante a filtragem.

  1. Preparação da solução fibrinogênio
    1. Prepare a solução salina (NaCl 0,9%) em água deionizada e dissolva 10 mg de fibrinogênio do plasma bovino em 1 mL da solução salina para obter uma concentração de 10 mg/mL.
      NOTA: Como adsorbs fibrinogen para vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução fibrinogênio.
    2. Deixe a solução em agitação a 37 °C até a dissolução completa da fibrinogênio.
      NOTA: Para dissolução de fibrinogênio, utilize um sistema rotativo colocado dentro de um forno a 37 °C. A agitação magnética (180 rpm) de fibrinogênio em uma placa quente a 37 °C também é adequada. Nesta condição, o fibrinênio de 10 mg/mL leva aproximadamente 40 minutos para dissolver.
  2. Preparação da solução gelatina/GelMA
    1. Pesar 0,12 g de gelatina e adicioná-la a 1,9 mL de PBS pré-aquecido (40 °C) para obter uma concentração final de 4% (w/v) gelatina. Vórtice para facilitar a dissolução.
    2. Mantenha a emulsão a 40 °C até a dissolução completa.
    3. Pese 0,06 g de GelMA liofphilizado e transfira para a solução de gelatina para obter uma concentração final de 2% (w/v) GelMA. Vórtice para facilitar a dissolução.
    4. Mantenha a solução a 40 °C até a dissolução completa.
  3. Preparação de gelatina carregada de astrócitos/GelMA/bioink fibrinogen
    1. Pipeta 0,9 mL da solução fibrinogênio de 10 mg/mL e transferência para a solução gelatina/GelMA para obter uma concentração final de 3 mg/mL de fibrinogênio.
    2. Pese 0,015 g de fotoinitiador (PI) e transfira para a solução gelatina/GelMA/fibrinogênio para obter uma concentração final de 0,5% (w/v) PI. Misture a solução lançando o tubo para cima e para baixo e mantenha-o a 40 °C protegido da luz para evitar a degradação da PI.
      NOTA: Estoque de bioinque a 4 °C para máxima de 24 horas.
    3. Sob o fluxo laminar, filtre a solução usando um filtro de 0,2 μm em um tubo cônico estéril de 15 mL.
      NOTA: A solução de biomateriais deve estar em 37-40 °C para permitir a filtragem.
    4. Transfira 980 μL da solução biomaterial para um tubo cônico de 15 mL.
    5. Diluir laminina em solução salina para obter uma solução de estoque de 100 μg/mL.
    6. Pipeta 20 μL de laminina e transferência para o tubo contendo o bioink para obter uma concentração final de 2 μg/mL laminina.
    7. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo, evitando bolhas. Se alguma bolha persistir, centrifugar o tubo cônico a 200 x g por 2 min. Mantenha o bioink a 37 °C até misturar com as células.
    8. Trypsinize astrócitos primários com 0,05% de trippsina por 5 min.
      NOTA: Use astrócitos das passagens 1 a 3.
    9. Neutralizar a atividade de trippsina com FBS a uma proporção de 1:1 e transferir as células para um tubo cônico de 15 mL. Centrifusá-lo a 200 x g por 5 min.
    10. Conte as células e transfira 1 x 106 células para um tubo cônico diferente. Centrifusá-lo a 200 x g por 5 min.
    11. Remova o supernatante deixando um pequeno volume (~200 μL) para suspender a pelota celular, tocando suavemente a parte inferior do tubo cônico.
    12. Transfira 1 mL de solução de gelatina/GelMA/fibrinogênio para o tubo contendo as células e pipeta suavemente para cima e para baixo para homogeneizar, obtendo uma concentração final de 1 x 106 células/mL.

5. Preparação da solução crosslinker

  1. Reconstituição de trombina
    1. Prepare uma solução de estoque de trombina 100 U/mL em água desionizada estéril com albumina de soro bovino de 0,1% (w/v) (BSA) em um tubo cônico de 15 mL. Estoque em microtubos a -20 °C.
      NOTA: Como adsorbs de trombo ao vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução de estoque ou armazenar as alíquotas.
  2. Preparação da solução thrombin-CaCl2
    1. Pipeta 100 μL de solução de estoque de trombina e transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 8,9 mL de água deionizada estéril para obter uma concentração final de 1 U/mL de trombina.
    2. Prepare uma solução CaCl2 de 10% (w/v) em água desionizada e esterilize usando um filtro de 0,2 μm.
    3. Transfira 1,1 mL da solução cacl2 de 10% para o tubo cônico contendo trombina, a fim de obter uma razão final de 1:9 (CaCl2 para trombina).
      NOTA: Prepare a solução crosslinker no volume a ser utilizado no experimento, evitando o armazenamento.

6. Bioink carregado de astrócitos bioimpressos com uma bioimpressora baseada em extrusão

  1. Projeto do tecido neural
    1. Utilizando o código G: construa uma grade de 6 x 6 mm (forma quadrada) com 1 mm de distância entre cada linha bioimpressora no eixo X e Y, e 6 camadas no eixo Z (0,2 mm entre cada linha); definir a extrusão (E) para 0,01 mm, aumentando 0,001 mm em cada nova camada do eixo Z; e definir a velocidade de impressão (F) para 400 mm/min(Informações Suplementares).
  2. Bioimpressora configurada
    1. Exponha a máquina à luz UV por 15 minutos e, em seguida, limpe-a com etanol 70%.
    2. Ligue a bioimpressora usando o interruptor de alimentação. Conecte a máquina ao computador através de um cabo USB. Abra o software de controle para conectá-lo ao bioimpressor e carregar o design do arquivo.
  3. Preparação da seringa bioimpressora
    1. Transfira o bioink de gelatina/GelMA/fibrinogen carregado de astrócitos para uma seringa plástica de 5 mL usando uma pipeta de 1.000 μL.
      NOTA: Transfira lentamente para evitar a formação de bolhas.
    2. Conecte uma agulha estéril de 22 G à seringa.
      NOTA: Deixe a seringa a 4 °C por 2 minutos.
    3. Conecte a seringa ao cabeçoteiro bioimpressor e lave manualmente o bioink para remover as bolhas restantes.
  4. Bioimpressão
    NOTA: A bioimpressão foi realizada fora do capô laminar.
    1. Coloque um prato de cultura de 35 mm na mesa bioimpressora e posicione a agulha 0,1 mm longe da superfície do prato de cultura para permitir o movimento da agulha.
      NOTA: Use um prato de cultura de 35 mm para cada bioimpressão.
    2. Pressione o botão Imprimir.
    3. Uma vez que a bioimpressão sobre, certifique-se de que a seringa se afasta do prato. Em seguida, feche o prato de cultura e prepare-se para o processo de crosslinking.
      NOTA: A bioimpressão de uma construção leva aproximadamente 1 min e 10 s.
  5. Crosslinking a construção bioimpressora e cultura
    1. Coloque o prato de cultura sob luz UV a 2 mW/cm2 para 2 x 60 s (para cima e para baixo) para o crosslinking gelma.
    2. Sob o fluxo laminar, transfira a construção bioimpressora para uma placa de 24 poços usando uma espátula estéril.
    3. Adicione 500 μL de solução thrombin/CaCl2 e deixe por 30 minutos para permitir a ligação cruzada de fibrinas.
    4. Remova a solução de crosslinking e lave a construção com 2 mL de PBS 1x. Em seguida, substitua o PBS por 1 mL de cultura de astrócitos médio e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Troque o meio a cada 3 dias.

7. Avaliação da viabilidade dos astrócitos

  1. Viabilidade de astrócitos bioimpressas
    1. Transfira a construção bioimpressora para um prato de cultura de 35 mm usando uma espátula.
    2. Lave a construção com 1 mL de 1x PBS.
    3. Deposite 100 μL do reagente Vivo/Morto sobre a construção e mantenha-o a 37 °C por 30 min, mantendo-o protegido da luz.
    4. Remova o reagente Vivo/Morto e lave o construto com 1 mL de PBS 1x.
    5. Transfira a amostra para um prato confocal usando uma espátula, e observe as células dentro do construto sob um microscópio confocal usando excitação de 488 e 570 nm para aquisição de imagens.
      NOTA: Use uma ampliação de 10x para uma visualização geral das células dentro da construção.
    6. Certifique-se de que a amostra está sentada plana. Se necessário, coloque uma mancha de cobertura sobre a amostra para aumentar o achatamento.
      NOTA: Durante a imagem, certifique-se de que o prato confocal está bem selado para evitar que a amostra seque.
    7. Calcule o número de viável (verde) e morto (vermelho) usando um software computacional.
  2. Viabilidade da cultura de astrócitos 2D
    1. Semente 0,5 x 106 astrócitos (passagem 1-3) em um prato confocal de 35 mm, adicione astrócitos médios e incuba-los a 37 °C e 5% de CO2.
    2. Quando as células estiverem confluentes, remova o meio de cultura e lave com 1 mL de 1x PBS.
    3. Deposite 200 μL do reagente Vivo/Morto e mantenha o prato a 37 °C por 30 min, protegido da luz.
    4. Remova o reagente Vivo/Morto e lave as células com 1 mL de PBS 1x.
    5. Leve o prato para um microscópio confocal juntamente com uma câmera digital, e use excitação de 488 e 570 nm para aquisição de imagem.
    6. Calcule o número de viável (verde) e morto (vermelho) usando um software computacional.

8. Imunostaining de astrócitos

  1. Coloração ácida fibrilar gliana (GFAP) de astrócitos bioimpressos bioimpressos 3D
    NOTA: Para investigar a presença de outros marcadores celulares, altere o anticorpo primário de acordo.
    1. Retire o meio do poço e lave o construto com 1 mL de PBS 3x.
    2. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) no PBS ao poço até que a construção esteja completamente coberta e deixe-a por 2h a 4 °C.
    3. Retire o PFA e lave o construto com 1 mL de PBS 3x.
      NOTA: Este procedimento pode ser pausado por vários meses se armazenado a 4 °C em PBS. Certifique-se de que a placa do poço está selada para evitar a evaporação do PBS.
    4. Trate a amostra com glicina 0,1 mol/L por 5 min.
    5. Lave com 1 mL de 1x PBS por 5 min.
    6. Permeabilize a amostra com PBS contendo 0,1% Triton X-100 e 10% FBS por 1 h a 25 °C sob agitação orbital.
    7. Incubar a construção com frango anti-GFAP (diluição de anticorpos primários 1:500) a 4 °C durante a noite.
    8. Aspire o anticorpo primário e lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 minutos e 3 vezes.
      NOTA: O anticorpo primário pode ser reutilizado várias vezes quando armazenado a 4 °C.
    9. Incubar a amostra com fluor Alexa 488-conjugado anti-frango (diluição secundária de anticorpos 1:500) e 1 μg/mL DAPI por 1 h a 25 °C sob agitação orbital.
      NOTA: Mantenha a amostra protegida contra a luz.
    10. Lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 min, 3 vezes.
    11. Transfira a construção para um prato confocal de 35 mm.
      NOTA: Certifique-se de que o prato está bem lacrado para evitar que a amostra seque.
  2. Coloração ácida fibrilar gliana (GFAP) da cultura de astrócitos 2D
    1. Semente 0,5 x 106 astrócitos (passagem 1-3) em um prato confocal de 35 mm, adicione astrócitos médios e incuba-los a 37 °C e 5% de CO2.
    2. Quando as células estiverem confluentes, remova o meio de cultura e lave-as com 1 mL de 1x PBS.
    3. Repetição de passos 8.1.2-8.1.10.
  3. Coloração de citrócitos de citoesqueleto
    1. Repetição passos 8.1.1-8.1.6.
    2. Adicione 200 μL de 50 μg/mL de solução de faloidagem conjugada fluorescente em PBS e 1 μg/mL de DAPI sobre a construção.
    3. Incubar por 1h a 25 °C sob agitação orbital, mantendo a amostra protegida da luz.
    4. Lave a amostra com 1 mL de PBS por 5 min 3 vezes e transfira a construção para um prato confocal usando uma espátula.
      NOTA: Certifique-se de que o prato está bem lacrado para evitar que a amostra seque.

9. Imagem confocal

  1. Leve os pratos para um microscópio confocal aliado a uma câmera digital para imagem (359, 488 e 570 nm de excitação).
  2. Use ampliação de 10x para uma visualização global e 40 ou 63x para imagens ampliadas de células.
    NOTA: Certifique-se de que a amostra está sentada plana. Se necessário, coloque uma mancha de cobertura sobre a amostra para aumentar o achatamento.

Resultados

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um tecido neural usando a tecnologia de bioimpressão 3D para depositar gelatina carregada de astrócitos primários de camada por camada/GelMA/fibrinogen bioink. Os astrócitos foram extraídos e isolados do córtex cerebral de filhotes de camundongos(Figura 1),adicionados a uma composição biomaterial, permitindo a biofabricação de uma construção 3D viva.

O design auxiliado por computador (CAD) foi desenvolvido u...

Discussão

A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma alternativa de biofabricação que permite a engenharia de construtos refinados que se assemelham estrutural e fisiologicamente aos tecidos nativos22, incluindo o cérebro23. A biofabricação de tecidos neurais permite a modelagem in vitro de microambientes nativos, sendo uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares associados ao desenvolvimento e tratamento de muitas doenças...

Divulgações

Os autores não têm conflitos para revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), números de bolsas 2018/23039-3 e 2018/12605-8; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), números de bolsas 465656/2014-5 e 309679/2018-4; e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), código financeiro 001.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusion-based bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Culture flask T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI staining solution
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecular weight cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagent grade
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatin powder from porcine skin
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095No calcium, no magnesium, no phenol red
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine crystalline powder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0For GelMA preparation
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes of 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Sterile blunt needle
Operating scissorIntegra Miltex05--02Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde powder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagent
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
SpatulaMiltexV973-70Number 24 cement spatula previously sterilized
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscope for brain dissection
Syringe 5 mLBD1222C84Sterile syringe
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropylene filter for sterilization
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratory grade
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plateThermo Scientific144530Sterile 24-well plate

Referências

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BioengenhariaEdi o 173astr citosbioimpress o 3Dbiofabaria oengenharia de tecidostecido neuralsistema nervoso central

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados